Summary
Selectivamente la etiqueta fluorescente GnRH-I, II y III Los derivados son instrumentos fiables para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular. Este manuscrito introduce experimentos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de estos conjugados de GnRH en diversas líneas celulares.
Abstract
análogos de GnRH son eficaces restos de dirección y capaz de administrar agentes anticancerígenos selectivamente en células tumorales malignas que los receptores de GnRH altamente exprés. Sin embargo, el análisis cuantitativo de la captación celular de GnRH análogos 'y los tipos de células investigadas en los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH se limitan actualmente. Previamente introducida, marcado fluorescente selectivamente GnRH I, II y III derivados proporcionar gran capacidad de detección, y tienen propiedades químicas adecuadas para experimentos reproducibles y robustos. También se encontró que los métodos apropiados en marcha hasta la fecha con estos análogos de GnRH etiquetados podrían ofrecer nueva información sobre los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH. Este manuscrito presenta algunos experimentos simples y rápidas con respecto a la captación celular de [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] - GnRH -III en la EBC-1 (pulmón), el BxPC-3 (páncreas) y en el Detroit-562- (faringe) t malignoumor células. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, el nivel de la superficie celular de los receptores de GnRH-I también fue examinado en estas líneas celulares antes y después del tratamiento con GnRH por microscopía confocal de barrido láser. La absorción celular de conjugados de GnRH-FITC se cuantificó mediante clasificación de células activadas por fluorescencia. En estos experimentos se observó diferencias menores entre los análogos de la GnRH y las principales diferencias entre los tipos de células. Las diferencias significativas entre las líneas celulares se correlacionan con su nivel distinto de los receptores de la superficie celular GnRH-I. Los experimentos introducidas contienen métodos prácticos para visualizar, cuantificar y comparar la eficiencia de absorción de los conjugados GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración en diferentes cultivos de células adherentes. Estos resultados podrían predecir la eficacia de dirección de fármaco de conjugados de GnRH en el cultivo celular dado, y ofrecer una buena base para futuros experimentos en el examen de los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH.
Introduction
Sistemas de administración dirigida de fármacos a base de péptidos se han convertido en un desarrollo rápido y área prometedora en la terapia del cáncer en los últimos años 1, 2. Gonadotropina humana tipo liberación de receptor de la hormona I (GnRH-IR) se encuentra principalmente en la glándula pituitaria, pero también está presente en varios otros tejidos que son responsables de autorreproducción 3. GnRH-IR también se expresa en una serie de tejidos de cáncer, relacionados o no con el sistema reproductivo 4, 5. La elevada expresión de GnRH-IR en varias células tumorales malignas en comparación con los tejidos sanos proporciona una oportunidad para que la terapia dirigida 5, 6.
Muchos hormona liberadora de gonadotropina (GnRH) se han desarrollado en las últimas décadas, que podrían ser utilizados como restos de direccionamientof "> 7, 8, 9. Estos péptidos son capaces de administrar agentes anticáncer con alta selectividad en células tumorales malignas que sobre-expresa GnRH-IR 6. Varios fármacos anti-tumorales conjugados de GnRH con una mayor selectividad y una mejor eficiencia de la no conjugada correspondiente fármaco libre se ha informado de 7, 8, 9.
Publicaciones anteriores sobre los péptidos de GnRH y sus receptores informaron que la GnRH-IR puede asumir diversas conformaciones que tienen una selectividad diferente para la GnRH análogos 10. La GnRH-IR altamente variable ha vías de señalización complejos y diversos están dotados de actividad diferente en contra de sus ligandos naturales y artificiales 11. Estos hechos hacen investigación de sistemas basados en GnRH desafiante. Por otra parte, la y poseen potencial terapéutico prometedor. Varios experimentos con péptidos GnRH radiomarcados se informó anteriormente 12, 13, 14, 15, pero los experimentos en los que se utilizaron los análogos de GnRH marcados con fluorescencia son todavía limitada. Si bien el etiquetado radiactivo ofrece alta sensibilidad, etiquetado fluorescente tiene varias otras ventajas, por ejemplo, el manejo más fácil, y la capacidad de contratinción con diferentes fluoróforos. Tres análogos de GnRH comunes que con éxito han sido utilizados para la administración de fármacos son el [D-Lys 6] GnRH-I, [D-Lys 6] GnRH-II y III-GnRH, pero la eficacia de estos péptidos como restos de direccionamiento es raramente en comparación 16, 17. Por otra parte, los resultados de experimentos separados en los que se utilizaron diferentes células cancerosas y análogos de la GnRH es diversa.
ntent "> Sobre la base de estas consideraciones, se centró en el tumor de orientación y el potencial de suministro de medicamento de estos péptidos de GnRH y de este modo sintetizado y caracterizado la [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II y [Lys 8 (FITC)] - conjugados de péptido GnRH-III 18 Estos análogos están etiquetados selectivamente con FITC en la cadena lateral de su (relación de péptido-FITC Lys o D-Lys 1: 1 en cada uno. conjugado). la idea era que el etiquetado fluorescente selectiva puede ofrecer información novedosa de estos péptidos, y permite su buen seguimiento y cuantificación fiable. estos conjugados tienen una manipulación segura y detectabilidad fiable, que hacen que sea más fácil de comparar la eficiencia de la orientación del tumor, y la la detección de numerosos tipos de células tumorales malignas. esperamos que se ponga a experimentos hechos con estos conjugados peptídicos podría contribuir al desarrollo de cáncer de novela de orientación conjugados GnRH con las drogas, y ayudará a identificar nuevas alquitrán terapéuticaconsigue así.El presente manuscrito demuestra algunos experimentos reproducibles y rápidos con conjugados GnRH-FITC. La expresión de la superficie celular de GnRH-R es una condición determinante en cuanto a la absorción de GnRH, por lo que simultáneamente investigó el nivel de la superficie celular de GnRH-IR en las líneas celulares ensayadas. Estamos visualizar los conjugados de GnRH y GnRH-IR-FITC por microscopía confocal de barrido láser (CLSM) y se cuantificó la captación celular de conjugados de GnRH-FITC usando células activadas por fluorescencia (FACS).
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Protocol
1. Preparación de Cultivos Celulares y Reactivos
- Mantener los cultivos de células en medio recomendado por el fabricante, suplementado con 10% (v / v) de suero bovino fetal y antibióticos (denominado medio completo). Mantener el matraz de cultivo celular en un, 5% de CO 2 atmósfera incubador humidificado a 37 ° C. Siga la proliferación y la confluencia de las células por microscopio invertido (con objetivo de 10x de contraste de fase).
- Cuando las células alcanzan la confluencia adecuada, se elimina el medio, y se lava el cultivo con 2-3 ml, estéril tamponada con fosfato salino (PBS). Retire el PBS y añadir 0,5 ml, solución de tripsina-EDTA estéril 0,25% al cultivo celular y se incuba a 37 ° C hasta que las células se separan (aproximadamente 10 min).
- Suspender las células en 3 a 4 ml de medio completo estéril para detener la tripsina y transferirlos a un tubo de centrífuga estéril. Centrifugar las células a 150 xg durante 4 minutos a temperatura ambiente (RT). Descartar el sobrenadante con cuidado y suspender la pEllet en 2-3 ml de medio completo estéril.
- Sacar 100 l de la suspensión celular y se mezcla con 100 l 0,4% (m / V) de tripano solución de azul, para teñir las células muertas. Cargar 10 l de esta mezcla en un hemocitómetro y determinar el número de células viables por microscopio invertido.
- Diluir la cantidad requerida de suspensión de células preparada en el paso 1.3 a 10 ml con medio completo estéril, que contiene 4 x 10 4 células / mL.
- Añadir 250 l de suspensión celular (preparado en el paso 1.5) por pozo (10 4 células / pocillo) en siete pozos del primer fondo de cristal de 8 pocillos portaobjetos de microscopio. Utilice esta diapositiva en el método de captación de GnRH.
- Añadir 250 l de suspensión celular (preparado en el paso 1.5) por pozo (10 4 células / pocillo) en cinco pozos de la segunda diapositiva de 8 pocillos microscópica. Esta diapositiva se utiliza en el método de expresión de GnRH-IR.
- Añadir 1 ml de suspensión de células (preparado en el paso 1.5) por pocillo (4 x 10 4 células / pocillo) en siete wells de una placa de 12 pocillos. Esta placa se utiliza en el método de cuantificación de la GnRH.
- Deje que las células se adhieren en los dos portaobjetos de microscopio y la placa. Incubar en un, 5% de CO 2 atmósfera incubador humidificado a 37 ° C durante 48 h.
- Después de la incubación comprobar las células por microscopio invertido (con objetivo de 10x de contraste de fase). Si las células son sanas y unido, continúe con los siguientes pasos.
- Preparar mM GnRH-FITC solución al 10 acciones en dimetilsulfóxido (DMSO) de cada uno de los tres conjugados 18. (Use estas concentraciones de dilución: 16,43 mg / l [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 g / l [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II y 16.47 g / l [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Mantener estas soluciones madre en un lugar oscuro a temperatura ambiente y el uso de ellos hasta dentro de unas semanas.
- Diluir 1,7 l cada una de las tres soluciones madre 10 mM GnRH-FITC en 1,7 ml de medio completo. Agitar estas soluciones. (Tse son el 10 M GnRH-FITC tratamiento de medios de comunicación.) Diluir 150 ml de cada uno de los tres 10 M GnRH-FITC medio de tratamiento en 1,35 ml de medio completo. Agitar estas soluciones también (estos son los 1 M GnRH-FITC medio de tratamiento).
NOTA: Todos los GnRH-FITC que contiene medio de tratamiento debe ser protegido de la luz y se utiliza dentro de pocas horas. - Precalentar el seis GnRH-FITC medio de tratamiento (preparado en la etapa 1.12) y 4 ml de medio completo a 37 ° C.
- Diluir 3 l de solución de sonda fluorescente 5 mM (contratinción nuclear mencionado en la Lista de Materiales) en 3 ml de PBS a 5 micras. Esta solución debe protegerse de la luz, deberá mantenerse a temperatura ambiente y se utilizan dentro de unas cuantas horas.
2. Microscopía confocal de barrido láser (CLSM)
- Método de captación de GnRH
- Tome la primera lámina de microscopio, preparado en la etapa 1.6 y una pipeta el medio completo de cada uno de los siete bien. Añadir 250 l de medi completa precalentadoum en el primer pocillo. Use esto como un control negativo. Añadir 250 l de la precalentado GnRH-FITC tratamiento de medios de comunicación (de 1,13) a cada uno de los siguientes seis pozos (3 pocillos con 1 M y 3 con 10 mM). Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 5 h.
- Pipetear hacia fuera el medio de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de solución de fijación (10% de formalina tamponada neutral) en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
- Pipetear la solución de fijación de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contiene 5 mM solución de sonda fluorescente preparado en la etapa 1.14 en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
- Pipetear la solución de la sonda fluorescente de cada pocillo, y se lavan las células dos veces con 250 l de PBS con cuidado. Añadir 3-4 gotas de medio de montaje en cada pocillo, por fin. Mantenga la diapositiva en la oscuridad a temperatura ambiente, hasta que la proyección de imagen.
- Método de expresión de GnRH-IR
- Tome la segunda lámina de microscopio de 8 pocillos preparada en el paso 1.7 y pipetear el medio completo de cada uno de los cinco pozos.
- Añadir 250 l de medio completo precalentado en el primer pocillo, utilice este control negativo. Añadir 250 l de medio completo precalentado en el segundo pozo también, y usar esto para examinar la expresión de GnRH-IR antes del tratamiento con GnRH.
- Añadir 250 ml de cada uno de los tres precalentado 10 micras GnRH-FITC medios de tratamiento en los próximos tres pozos. Utilice estos pozos para tratar previamente las células con conjugados GnRH-FITC antes de examinar la expresión de GnRH-IR. Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Pipetear el medio de tratamiento de cada uno de los tres pocillos que se utilizan para examinar la expresión de GnRH-IR después del tratamiento GnRH y lavar los pozos con 250 l de medio completo precalentado. Añadir 250l de medio completo precalentado en cada uno de los tres pozos. Incubar el portaobjetos en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 1 h.
- Pipetear hacia fuera el medio de cada uno de los cinco pocillos y lavar las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de solución de fijación en cada pocillo y se incuba el portaobjetos a TA, durante 10 min.
- Pipetear la solución de fijación de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contenía albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución de bloqueo cada pocillo e incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h.
- Diluir 10 l de anticuerpo primario GnRH-IR en 1 ml de PBS (relación 1: 100). Mantenerlo a temperatura ambiente y utilizarlo hasta dentro de unas horas.
- Pipetear la solución de bloqueo BSA de cada pocillo, excepto el control negativo (primer pozo). Se lavan las células con 250 l de PBS (excepto el pocillo de control negativo). Añadir 250 l de PBS que contenía GnRH-IR anticuerpo primario preparado en la etapa 2.2.7 en EACh bien (excepto el control negativo). Incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h, en un lugar oscuro.
- Diluir 2,5 l de Alexa 546 anticuerpo secundario marcado en 1,25 ml de PBS (relación 1: 500).
NOTA: Esta solución debe protegerse de la luz, mantenerlo a temperatura ambiente y utilizarlo hasta dentro de unas horas. - Pipetear soluciones de cada uno de los cinco pozos y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contienen 546 AF anticuerpo secundario marcado preparado en la etapa 2.2.9 en cada pocillo. Incubar el portaobjetos a TA, durante 1 h en la oscuridad.
- Pipetear la solución de cada pocillo y se lavan las células con 250 l de PBS. Añadir 250 l de PBS que contiene 5 mM solución de sonda fluorescente preparado en la etapa 1.14 en cada pocillo y se incuba el portaobjetos durante 10 min, a temperatura ambiente.
- Pipetear la solución de la sonda fluorescente de cada pocillo y se lavan las células dos veces con 250 l de PBS con cuidado. Añadir 3-4 gotas de medio de montaje en cada pocillo, después. Mantenga la diapositiva en la oscuridada TA hasta que la formación de imágenes microscópicas.
- Imaging
- Imagen de las células por confocal invertido microscopio de escaneo láser (usando 63X objetivo de inmersión en aceite)
- Utilice las siguientes longitudes de onda de excitación / emisión. conjugados GnRH: 488/514 nm, Alexa 546 anticuerpo marcado: 488/546 nm (uso sólo para el método de expresión de GnRH-IR), sonda fluorescente DRAQ5: 633/680 nm.
- Configurar los parámetros de imagen utilizando las células de control negativo. Use estos parámetros para las células tratadas imagen (Figura 3). Volver a ajustar los parámetros de imagen en cada portaobjetos microscópico en el comienzo del análisis. imágenes afinar y exportación con el software proporcionado por el fabricante si es necesario.
- Imagen de las células por confocal invertido microscopio de escaneo láser (usando 63X objetivo de inmersión en aceite)
3. celular activada por fluorescencia (FACS)
- Método de cuantificación GnRH
- Tomar el plato preparado en la etapa 1.8 y pipetear el medio completo de EAch de los siete pozos. Añadir 1 ml de medio completo precalentado en el primer pocillo. Use esto como un control negativo. Añadir 1 ml de cada uno de los seis precalentado el tratamiento de los medios de comunicación (3 pozos con 1 M y 3 pozos con 10 mM) en los próximos seis pozos. Se incuba la placa en un 5% de CO2 humidificado incubadora a 37 ° C durante 5 h.
- Pipetear a cabo el medio de cada pocillo. Lavar las células dos veces con 2 ml de PBS con cuidado. Añadir 500 l de solución de tripsina-EDTA en cada uno de los pozos. Incubar la placa a 37 ° C hasta que las células se separan (aproximadamente 10 min).
- Añadir 1 ml de medio completo en cada pocillo para detener la tripsina. Agitar la placa. Suspender las células suavemente con una pipeta, y la transferencia de la suspensión de cada pocillo a tubos de FACS. Centrifugar los tubos a 150 xg durante 4 minutos, a 4 ° C.
- Derrama los sobrenadantes con cuidado, con un solo movimiento. Añadir 500 l de PBS helado en cada tubo de FACS y suavemente volver a suspender las células. Mantener los tubos en hielo hasta el finaldel experimento.
- Análisis y cálculo
- Analizar las células por citometría de flujo. Para la excitación, el uso de longitudes de onda láser de argón de 488 nm y para la detección de usar 530 nm longitud de onda. Configurar el citómetro de flujo parámetros mediante la ejecución de las células de control negativo. Use estos parámetros para analizar las células tratadas (Figura 4A). Evaluar los datos con el software del fabricante, determinar los valores de intensidad de fluorescencia media (MFI), y calcular los valores relativos de las IFM.
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Representative Results
Las imágenes obtenidas por microscopía de barrido láser confocal (CLSM) ofrecen información acerca de la espectacular captación de los conjugados de GnRH-FITC en el cultivo de células en un determinado tiempo y forma dependiente de la concentración. En paralelo con estos conjugados GnRH-FITC, la presencia de la GnRH-IR en la superficie celular también es verificable por el experimento CLSM. Además, mediante el uso de una sonda fluorescente rojo lejano tinción de ADN, es posible contrateñir los núcleos de las células además de GnRH y GnRH-IR. Sin embargo, mientras que la imagen confocal no es cuantificable, la simple "método de captación de GnRH" puede estimar fácilmente si las células ensayadas contienen mayor o menor cantidad de conjugados de GnRH-FITC. Los conjugados aplicadas GnRH-FITC, sus concentraciones, y el tiempo del tratamiento son variables en este método, según sea necesario. Como se muestra en la Figura 1 en las células de cáncer de diferentes contienen diferentes niveles de GnRH-FITC de una manera dependiente de la concentración. El avanzado "método de expresión de GnRH-IR" describe la visualización de la superficie de la célula GnRH-IR por inmunocitoquímica, antes y después del tratamiento con GnRH-FITC. En la primera parte de este método (antes del tratamiento con GnRH-FITC), visualizamos GnRH-IR por inmunocitoquímica, sin tratamiento GnRH-FITC. En la segunda parte de este método (después del tratamiento con GnRH-FITC), tratamos las células durante 1 h con 10 mM de GnRH-FITC. Después del tratamiento, se incuban las células en medio completo durante 1 h, y visualizamos GnRH-IR por inmunocitoquímica. Como se muestra en la Figura 2A, las diferentes células cancerosas exhiben diferentes niveles de GnRH-IR sobre su superficie antes del tratamiento GnRH-FITC. Como se muestra en la Figura 2B, después del tratamiento GnRH-FITC, la GnRH-IR células que expresan mantener (562-Detroit) Nivel de GnRH-IR (EBC-1) o un aumento en sus membranas. En este punto, observamos que previamente se confirmó que BxLas células PC-3 también expresan GnRH-IR, pero no la presentan en su membrana 18. GnRH-IR se puede visualizar el interior de las células BxPC-3 por inmunocitoquímica si se permeabilizaron sus membranas. Este fenómeno explica la relativamente baja eficiencia de absorción de la GnRH BxPC-3 células. Sobre la base de estos balances nos centramos sólo en la superficie celular de GnRH-IR aquí. La comparación de la Figura 1 a la Figura 2 confirma que el nivel de la superficie celular GnRH-IR se correlaciona con la cantidad de GnRH-FITC en las celdas correspondientes. Además, la Figura 3C aclara que GnRH-FITC se internaliza en las células debido a la localización de GnRH-FITC se separa de la señal de superficie celular GnRH-I-Rafter 1 h del tratamiento GnRH-FITC. Llegamos a la conclusión de que "método de expresión de GnRH-IR" apoya la información obtenida del "método de captación de GnRH".
Es importante el uso conjunto bien ajustadoTings durante la proyección de imagen. Como se ilustra en la figura 3A en la longitud de onda de emisión de FITC (514 nm) y el fluoróforo marcado con anticuerpo secundario (546 nm), las células de control negativos sin tratar también tienen un ligero autofluorescencia. Esta fluorescencia no deseada puede proporcionar resultados positivos falsos. De este modo, al comienzo de la formación de imágenes, es importante ajustar la intensidad de fluorescencia en las células de control como se muestra en la Figura 3B. Se espera que se observará señal clara de los núcleos en la longitud de onda de emisión de la tinción nuclear (680 nm), con la señal fluorescente en las otras dos longitudes de onda es sólo visible o cerca de cero. Todas las otras muestras de células deberían obtenerse imágenes con estos parámetros bien adaptados y fijos. De esta manera, la señal observada a 514 nm se deriva de la señal de sólo el FITC-GnRH, a 546 nm de la señal de GnRH-IR en particular y a 680 nm de la señal de los núcleos, como se muestra en la Figura 3C. Imágenes podrían ser fine-sintonizado después de la formación de imágenes mediante software si es necesario.
Citometría de flujo experimentos ofrecen información cuantificable sobre la cantidad de conjugados de GnRH-FITC las cuales fueron tomadas por las células. Los conjugados GnRH-FITC aplicadas, sus concentraciones y el tiempo del tratamiento también son variables en este método, según sea necesario. Las células no tratadas se usan como control negativo para el ajuste de la citometría de flujo parámetros y determinar su intensidad de fluorescencia media (MFI) en el comienzo del análisis. Como se ilustra en la Figura 4A, el MFI se determinó para cada muestra utilizando los mismos parámetros. Los valores de MFI relativos se calcularon a partir de los valores de MFI utilizando la fórmula de cálculo en la figura 4B. Usando esta fórmula, el valor de MFI relativo de las células de control es siempre cero. Los valores de MFI relativos calculados cuantificar la intensidad de fluorescencia de los conjugados GnRH-FITC, que son proporcionales a su unalas concentraciones de P romedio en las células. Como se ilustra en la Figura 5, con estos datos, se puede demostrar y comparar la eficacia con estas células de cáncer ocupan los conjugados GnRH-FITC. Por lo tanto, los resultados obtenidos por citometría de flujo se complementan y apoyan las imágenes obtenidas por microscopía confocal.
Figura 1: Las imágenes confocales de la no tratada y la [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III tratado las células cancerosas. la mancha azul: núcleos; mancha verde: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III. Estas imágenes se obtuvieron utilizando el "método de captación de GnRH". (A) Las señales de fluorescencia de las células no tratadas se ajustan a cerca de cero a 514 nm (verde) en cada línea celular. La sonda fluorescente rojo lejano DRAQ5 se usa para teñir los núcleos de las células. (B) Después de aplicar los ajustes, el cáncer de pulmón y EBC-1 humano Detroit-562las células cancerosas faringe muestran detectable, pero baja la señal a 514 nm (verde) después del tratamiento con 5 h con 1 mM [8 Lys (FITC)] - GnRH-III. (C) Después del tratamiento 5 h con 10 mM [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III, cada una de las tres líneas celulares de señal más alto fluorescente presente. Los resultados de este experimento sugieren que los BxPC-3 células de cáncer de páncreas tomaron GnRH-FITC con una eficiencia mucho más baja en comparación con las otras líneas de dos células que son fácilmente objeto de orientación por conjugados de GnRH. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Confocal de imágenes de la superficie celular de GnRH-IR antes y después [6 D-Lys (FITC)] - tratamiento con GnRH-I. la mancha azul: núcleos; mancha verde: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; mancha roja : GnRH-IR. Estas imágenes se generan mediante el "método de expresión de GnRH-IR". (A) Antes del tratamiento GnRH-FITC, BxPC-3 células no tienen GnRH-IR sobre la membrana, sin embargo EBC-1 células exhiben alta, y ciertas células Detroit-562 exhiben nivel moderado de GnRH-IR. (B) Después del tratamiento con GnRH-FITC, BxPC-3 células todavía no exhiben GnRH-IR en su membrana. EBC-1 células mantienen su expresión de GnRH y GnRH-IR-FITC aparece dentro de ellos. Detroit-562 células parecen estar exhibiendo un mayor nivel de GnRH-IR después del tratamiento y que ocupan GnRH-FITC, también. Este experimento pone de manifiesto que los diferentes tipos de células tumorales malignas presentan diferentes niveles de GnRH-IR en su superficie, y la absorción de GnRH-FITC parece estar estrechamente relacionada con la expresión de GnRH-IR de la superficie celular. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Las imágenes confocales de células EBC-1 de cáncer de pulmón. la mancha azul: núcleos; mancha verde: [Lys 8 (FITC)] - GnRH-III; mancha roja: GnRH-IR. Estas imágenes son tomadas por el "método de expresión de GnRH-IR". (A) células de control negativo no tratado (sin GnRH-FITC y Alexa 546) tienen fluorescencia detectable y no deseada a 514 nm y 546 nm utilizando las configuraciones del instrumento sobre-amplificados. (B) Ajuste de la configuración del instrumento en las células controles negativos sin tratar, el verde (514 nm) y rojo de la señal (546 nm) es cercano a cero. (C) los parámetros ajustados producen señales claras y fiables para la GnRH-FITC tratada y GnRH-IR células teñidas. Después del tratamiento GnRH-FITC, la localización de GnRH-FITC (verde) se separa de la superficie de la célula GnRH-IR (rojo).529fig3large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Evaluación de la citometría de flujo de datos. (A) Histograma de la no tratada y las células Detroit-562 tratadas. valores de MFI de las muestras de células se determinan a partir del histograma. El eje x representa la intensidad de fluorescencia de las células, y el eje y representa los recuentos. línea de negro: IMF antes del tratamiento con GnRH-FITC; verde línea de puntos: IMF después del tratamiento con 5 h con 1 mM [8 Lys (FITC)] - GnRH-III; línea discontinua roja: IMF después del tratamiento con 5 h con 10 mM [8 Lys (FITC)] - GnRH-III. (B) Fórmula de cálculo de los valores relativos de las IFM. Los valores de MFI relativos se calcularon a partir de los valores de MFI. Usando este cálculo, el valor de MFI relativa de la muestra de control sin tratar es siempre cero. el relat ive valores de IFM de las muestras tratadas representan la cantidad de conjugados de GnRH-FITC que están dentro de las células. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Los valores relativos de las IFM de las células del cáncer después del tratamiento con 5 h con 1 M de conjugados de GnRH-FITC. valores de MFI relativos son comparables y definen la eficiencia con los tipos de células dados podrían tomar hasta análogos de la GnRH. Las células no exhibiendo BxPC-3 de GnRH-IR contienen sólo trazas de estos análogos de la GnRH. La GnRH-IR expresar EBC-1 en las células de cáncer de pulmón contiene moderado y las células de cáncer de faringe Detroit-562 contiene alta cantidad de análogos de GnRH. Los resultados se presentan como media ± SD, n = 3."_blank"> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los experimentos descritos en este documento utilizar análogos de la GnRH marcadas selectivamente para adherente cribado cultivos de células in vitro. La microscopía confocal y citometría de flujo métodos son adecuados para el seguimiento y la cuantificación de la captación celular de estos conjugados de GnRH-FITC en un tiempo y manera dependiente de la concentración. Estos experimentos tienen los siguientes pasos críticos: 1) mantener un cultivo celular estéril, sana; 2) péptidos GnRH deben ser de alta calidad; 3) las concentraciones razonables y tiempos de incubación deben seguirse; 4) el tratamiento y etapas de lavado; 5) los ajustes del instrumento bien ajustado.
Las células se mantuvieron en medio recomendado por el fabricante suplementado con 10% (V / V) de suero fetal bovino y antibióticos (medio completo). Las células deben ser mantenidos y manejados en un ambiente estéril hasta que las etapas de tratamiento (con conjugados GnRH-FITC). Antes de los experimentos, compruebe las células usando un microscopio invertido. Ellos deben ser saludables, Que se adjunta y debe llegar a las cantidades requeridas.
Es importante utilizar los péptidos de GnRH con alta calidad y pureza. Se sintetizaron estos péptidos y los purificamos a más de 98% 18. El péptido se puede almacenar a -25 ° C en un refrigerador como un polvo liofilizado. Los mM GnRH-FITC soluciones madre en DMSO 10 deben mantenerse en un lugar oscuro a temperatura ambiente y se utilizan dentro de unas cuantas semanas. Se investigó la estabilidad de estos conjugados y encontramos que son estables en DMSO y su intensidad de fluorescencia se mantienen después de 1 mes de almacenamiento adecuado. La concentración de los conjugados GnRH-FITC y el tiempo de los tratamientos son variables en estos experimentos, lo que ofrece grandes ventajas, pero con ciertas limitaciones (ver abajo). Las concentraciones aplicadas y los tiempos de incubación en este protocolo son sólo recomendaciones, sino que proporcionan una buena base para los experimentos iniciales.
CLSM experimentos requieren cortaretapas de lavado al. Estos pasos deben llevarse a cabo con cuidado. No transferir el líquido directamente sobre las células. Más bien, utilizar el lado o en la esquina de los pozos para este propósito. Esto puede minimizar la pérdida de lavar y las células adheridas. También se recomienda para evitar la luz directa durante todo el experimento, ya que puede desensibilizar a las muestras fluorescentes (efecto photobleaching). Mantener las muestras tratadas en un lugar oscuro o cubierto con un trozo de papel de aluminio durante el experimento. Con base en los resultados anteriores, nos dimos cuenta de que la concentración final de DMSO en los medios de comunicación el tratamiento aplicado es insignificante (0,1% (V / V) de DMSO en el 10 M medios de tratar) y no tiene ningún efecto sobre los resultados, medio completo con ello DMSO-libre es también son adecuados como control negativo.
Es importante utilizar los parámetros de instrumentos bien adaptados durante los experimentos CLSM y FACS. Estos parámetros necesitan ser re-calibrado en cada tipo de célula, antes de ambos análisis. En el experimento CLSM, la ISintensidad gnal de imágenes confocales depende de los siguientes parámetros: la intensidad del láser, la ganancia del detector y el desplazamiento y el tamaño del agujero de alfiler. Al ajustar estos parámetros, utilice la potencia del láser más bajo para producir una imagen aceptable y evitar photobleaching. Establecer los parámetros de imagen para ajustar la fluorescencia de fondo de las células de control negativo sin teñir a casi cero (Figura 3B). tratada imagen células con estos parámetros ajustados para evitar resultados falsos positivos. Señales adicionales emitidos por las células tratadas a 514 nm y 546 nm contienen la información necesaria acerca de GnRH o GnRH-IR. Estos pasos requieren experiencia en los experimentos CLSM. En el experimento de FACS, crear un gráfico estándar de dispersión frontal del lado de dispersión (escala lineal) y los voltajes establecidos para ajustar la principal población de células de estar en medio de la trama. Dibuje una región alrededor de las células vivas. Crear un histograma, establecer abscisa para canalizar una (FL1-530 nm, escala logarítmica) y establecer la región previamente definida como una puertapara este histograma. Ajustar el voltaje FL1 para llevar la señal de las células de control negativo no teñidas por debajo de 10 1 (Figura 4A). Analizar las células tratadas con estos parámetros ajustados.
Además, es importante comprobar el estado de micoplasma de los cultivos celulares de vez en cuando. Varios ensayos están disponibles para este propósito. En caso de positividad micoplasma, desechar las células y empezar a trabajar con una nueva cultura. Se recomienda el uso de una mezcla de antibióticos en el medio de cultivo que está optimizado para evitar micoplasma. La concentración aplicada de conjugados GnRH-FITC, y el tiempo de los tratamientos son variables en estos experimentos, sin embargo la aplicación de bajas concentraciones y tiempos de incubación cortos podría resultar en señales demasiado débil para la detección de fluorescencia.
Cuando imágenes de la GnRH-IR en paralelo con análogos de la GnRH, se recomienda una concentración más alta de GnRH-FITC (10 mM es óptima). La razón de la mayor concentraciónes el corto tiempo de incubación (1 hora) y la señal de fluorescencia relativamente alta del anticuerpo marcado, en comparación con conjugados GnRH-FITC. Por otra parte, se encontró un pequeño solapamiento entre las dos emisiones de colorantes fluorescentes (514 nm y 546 nm), que sólo se produce a 546 nm y se deriva de la señal de conjugados GnRH-FITC. Sin embargo, la señal fluorescente relativamente mayor de Alexa 546 y de los parámetros bien adaptados podría minimizar este efecto, como se demuestra en la Figura 3. Otra posible solución para evitar la superposición, es la aplicación de anticuerpo secundario marcado que tiene diferente longitud de onda de excitación y / o espectro de emisión mejor separada en comparación con FITC (si los parámetros técnicos CLSM permiten esto). Esta posibilidad ofrece una gran ventaja para el método CLSM, que permite el uso de sondas fluorescentes opcionales en paralelo con conjugados GnRH-FITC. Por ejemplo, estas sondas fluorescentes alternativas podrían ser utilizados para la contratinción otros orgánulos, según sea necesario.
La concentración aplicada de conjugados GnRH-FITC tiene las siguientes limitaciones. El límite máximo de concentración de los conjugados de GnRH-FITC se basa en su solubilidad 18. Estos valores son los siguientes en PBS a temperatura ambiente: GnRH-I: 90 M; GnRH-II: 40 M; GnRH-III: 200 micras. Por otra parte, en los experimentos anteriores supone que la absorción de estos péptidos de GnRH podría tener lugar por receptores distintos de los receptores de GnRH-I humano; esta absorción parece ser más importante en concentraciones más altas (por encima de 10 mM) 18. El límite inferior de detección de conjugados GnRH-FITC se basa en una variedad de parámetros, pero en configuración ideal es de aproximadamente 1 M durante CLMS experimentos. Se encontró que la citometría de flujo ofrece una mejor sensibilidad que la microscopía confocal. En un escenario ideal, el límite de cuantificación de los conjugados de GnRH-FITC podría ser inferior a 1 micra. El límite de detección o cuantificación podríaser diferente en cada experimento, porque dependen del tipo de célula y el tiempo de incubación. Tenga en cuenta que los datos obtenidos por FACS es más fiable que CLSM, porque detecta miles de células por muestra y se calcula la media de la señal de las células. Sin embargo, en el protocolo, FACS no proporciona información sobre la localización celular de conjugados de GnRH-FITC y la expresión de la superficie celular de GnRH-IR. Sobre la base de estas consideraciones se concluye que, la CLSM y FACS experimentos tienen ventajas distintas, y que se complementan entre sí. Por otro lado, el análisis de imágenes de alta contenido podría ser una interesante y una buena alternativa para FACS y análisis de CLSM.
En resumen, los datos obtenidos de estos experimentos confirman que cada uno de los tres conjugados de GnRH-FITC puede entrar en las células que expresan la superficie celular GnRH-IR. Estos análogos de la GnRH tienen una potencia orientación similares a las mismas concentraciones. Sin embargo, el nivel de GnRH-IR en la superficie de diferentes latacer las células es muy variable. Resultados calculados a partir de los datos de citometría de flujo análisis permite la comparación de las líneas celulares o análogos de la GnRH. Al mismo tiempo, las imágenes obtenidas por microscopía confocal podrían revelar el nivel de expresión de GnRH-IR de la superficie celular y confirmar que estos conjugados se internalizan en las células. Sobre la base de estos resultados, se puede confirmar que los experimentos introducidos contienen métodos prácticos y variables para la investigación de los sistemas de administración de fármacos a base de GnRH y ofrecen una buena base para experimentos adicionales.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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