Summary
Избирательно меченый флуоресцентной GnRH-I, -II и -III производные являются надежные инструменты для отслеживания и количественной оценки их клеточного поглощения. Эта рукопись представляет эксперименты для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения этих ГнРГ конъюгатов в различных клеточных линиях.
Abstract
аналоги ГнРГ являются эффективными и Целевые фрагменты способны доставить противораковые агенты избирательно в злокачественные опухоли клетки, которые высоко выражают рецепторы ГнРГ. Тем не менее, количественный анализ клеточного поглощения аналогов GnRH 'и исследуемые типы клеток в ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств в настоящее время ограничены. Ранее введены, селективно помечены флуоресцентной ГнРГ I, -II и -III производные обеспечивают высокую выявляемость, и у них есть подходящие химические свойства для воспроизводимых и надежных экспериментов. Мы также обнаружили, что соответствующие методы уточненный с этими мечеными аналогами ГнРГ может предложить новую информацию о ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств. Эта рукопись вводит некоторые простые и быстрые эксперименты относительно клеточному поглощению [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II и [Lys 8 (FITC)] - ГнРГ -III на EBC-1 (легкие), то BxPC-3 (поджелудочная железа) и на Detroit-562- (зева) злокачественная тumor клетки. Параллельно с этим ГнРГ-FITC конъюгатов, уровень поверхности клеток рецепторов GnRH-I также исследовали на этих клеточных линиях до и после лечения ГнРГ с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии. Клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов количественно оценивали с помощью флуоресцентной активированный сортировки клеток. В этих экспериментах наблюдалось незначительные различия между ГнРГ аналогов и основных различий между типами клеток. Значительные различия между клеточных линий коррелируют с их отчетливым уровнем рецепторов клеточной поверхности, GnRH-I. Введенные эксперименты содержат практические методы для визуализации, количественной оценки и сравнения эффективности поглощения ГнРГ-FITC конъюгатов в времени и зависимости от концентрации на различных культур прикрепленных клеток. Эти результаты могут предсказать наркотиков ориентации эффективность ГнРГ конъюгатов по данной культуре клеток, и предлагают хорошую основу для дальнейших экспериментов в изучении ГнРГ на основе систем доставки лекарственных средств.
Introduction
Целевые системы доставки лекарственных средств на основе пептидов стали быстро развивающееся и перспективное направление в терапии рака в течение последних нескольких лет 1, 2. Человеческий гонадотропин тип высвобождения гормона рецептор I (ГнРГ-IR) в основном находится в гипофизе , но также присутствует в ряде других тканей , которые ответственны за самовоспроизводства 3. ГнРГ-IR также выражается в ряде раковых тканей, связанные или не связанные с репродуктивной системой 4, 5. Высокая экспрессия GnRH-IR на нескольких злокачественных опухолевых клеток по сравнению со здоровыми тканями дает возможность для целенаправленной терапии 5, 6.
Многие гонадотропин-рилизинг-гормона (ГнРГ) аналоги были разработаны в течение последних нескольких десятилетий, которые могут быть использованы в качестве ориентации фрагментове "> 7, 8, 9. Эти пептиды способны доставить противораковые агенты с высокой селективностью в злокачественные опухолевые клетки , которые сверхэкспрессии GnRH-IR 6. Несколько ГнРГ конъюгированных противоопухолевых препаратов с более высокой селективностью и лучшей эффективностью , чем соответствующий неконъюгированный свободное лекарственное средство было зарегистрировано 7, 8, 9.
Предыдущие публикации о пептидов ГнРГ и их рецепторов сообщили , что ГнРГ-IR может принимать различные конформации , которые имеют различную селективность в отношении GnRH аналогов 10. Сильно варьирует GnRH-IR имеет сложные и различные сигнальные пути , наделены различной активностью в отношении их естественных и искусственных лигандов 11. Эти факты делают исследование систем ГнРГ на основе сложной. С другой стороны, у обладают многообещающим терапевтическим потенциалом. Несколько экспериментов с радиоактивно меченных пептидов ГнРГ ранее сообщалось о 12, 13, 14, 15, но эксперименты , в которых были использованы флуоресцентно меченных аналогов GnRH все еще ограничены. В то время как радиоактивное мечение обладает высокой чувствительностью, флуоресцентное мечение имеет ряд других преимуществ, например, более легкое обращение с ними, а также возможность контрастирующая с различными флуорофоров. Существует три основных аналогов GnRH , которые были успешно использованы для доставки лекарственных средств являются [D-Lys 6] -GnRH-я, [D-Lys 6] -GnRH-II и III-ГнРГ, однако эффективность этих пептидов в качестве целевые фрагменты , является редко по сравнению 16, 17. С другой стороны, результаты отдельных экспериментов, в которых использовались различные раковые клетки и аналоги ГнРГ разнообразен.
ntent "> Исходя из этих соображений, мы сосредоточились на опухоль ориентации и доставки лекарственного потенциала этих ГнРГ пептидов, и , таким образом , синтезированы и охарактеризованы в [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, [D-Lys 6 (FITC )] - GnRH-II и в работе [Lys 8 (FITC)] - ГнРГ-III пептидных конъюгатов 18 Эти аналоги селективно меченных FITC на боковой цепи их Lys или D-Lys (отношение пептид-FITC 1: 1 в каждой из них . сопряженная). идея заключалась в том, что селективная флуоресцентная маркировка может предложить новую информацию об этих пептидов, а также позволяет их хорошей отслеживания и надежной количественной оценки. Эти конъюгаты имеют безопасное обращение и надежную выявляемость, которые делают его более легким, чтобы сравнить их эффективность ориентации опухоли, и скрининг многочисленных типов клеток злокачественных опухолей. Мы надеемся, что до-на сегодняшний день экспериментов с этими пептидных конъюгатов могут внести вклад в развитие нового рака ориентации конъюгаты GnRH-наркотиков, а также помочь идентифицировать новые терапевтические смолыполучает также.Настоящая рукопись демонстрирует некоторые хорошо воспроизводимые и быстрые эксперименты с ГнРГ-FITC конъюгатов. Экспрессия на поверхности клеток GnRH-R является определяющим состояние относительно поглощения ГнРГ, поэтому мы одновременно исследовали уровень клеточной поверхности GnRH-IR на тестируемых клеточных линиях. Мы визуализировали ГнРГ-IR и ГнРГ-FITC конъюгаты с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) и количественно оценивали клеточное поглощение ГнРГ-FITC конъюгатов с помощью флуоресцентной активированного сортировки клеток (FACS).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Получение клеточных культур и реактивов
- Поддерживать клеточные культуры в рекомендуемой среде изготовителя, с добавлением 10% (об / об) фетальной бычьей сыворотки и антибиотики (так называемый полная среда). Хранить культивирования клеток колбу в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы при температуре 37 ° C. Следуйте пролиферацию и слитности клеток с помощью инвертированного микроскопа (с использованием 10X контрастности цели фазы).
- Когда клетки достигают достаточного слитности, удалить среды и промыть культуру с 2-3 мл, стерильный фосфатно-солевого буферного раствора (PBS). Удалите PBS и добавляют 0,5 мл, стерильный 0,25% раствора трипсина-ЭДТА в культуре клеток и инкубируют при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяться (примерно 10 мин).
- Суспендирования клеток в 3-4 мл стерильной полной среде, чтобы остановить трипсина и передавать их в стерильную пробирку центрифуги. Центрифуга клетки при 150 мкг в течение 4 мин при комнатной температуре (RT). Удалите супернатант тщательно и приостановить рellet в 2-3 мл стерильной полной среде.
- Возьмите 100 мкл клеточной суспензии и смешать с 100 мкл 0,4% (м / V) трипанового синий раствор, чтобы посрамить мертвые клетки. Нагрузка 10 мкл этой смеси в гемоцитометра и определить количество жизнеспособных клеток с помощью инвертированного микроскопа.
- Развести необходимое количество суспензии клеток , приготовленной на стадии 1.3 до 10 мл стерильной полной среде, содержащей 4 х 10 4 штук / мл.
- Добавить 250 мкл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (10 4 клеток / лунку) на семь скважин первого стеклянным дном 8-хорошо микроскопический слайд. Используйте этот слайд в методе поглощения ГнРГ.
- Добавить 250 мкл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (10 4 клеток / лунку) на пять лунок второй 8-луночного предметное стекло. Этот слайд будет использоваться в способе экспрессии ГнРГ-IR.
- Добавить 1 мл клеточной суспензии (полученного на стадии 1.5) на лунку (4 × 10 4 клеток / лунку) в семь достLs из 12-луночного планшета. Эта пластина будет использоваться в способе количественного определения ГнРГ.
- Пусть клетки прилипать на двух микроскопических слайдов и пластины. Выдержите их в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 48 ч.
- После инкубации проверьте клеток с помощью инвертированного микроскопа (с использованием 10X контрастной цели фазы). Если клетки здоровы и связаны, по-прежнему со следующими шагами.
- Готовят 10 мМ ГнРГ-FITC исходного раствора в диметилсульфоксиде (ДМСО) от каждого из трех конъюгатов 18. (Используйте эти концентрации разведения: 16,43 мкг / мкл [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I, 16,97 мкг / мкл [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-II и 16,47 мкг / мкл [Lys 8 ( FITC)] - GnRH-III) Держите эти растворы в темном месте при комнатной температуре и использовать их в течение нескольких недель.
- Развести 1,7 мкл каждого из трех 10 мМ маточных растворов ГнРГ-FITC в 1,7 мл полной среды. Встряска эти решения. (Thesе являются 10 мкМ ГнРГ-ФИТЦ обработки носителя.) Развести 150 мкл каждого из трех 10 мкМ ГнРГ-FITC обрабатывающей среды в 1,35 мл полной среды. Встряска эти решения, а также (это 1 мкМ GnRH-FITC обработки среды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Все GnRH-FITC, содержащий среду для обработки должны быть защищены от света и использовать в течение нескольких часов. - Предварительно подогревают шесть GnRH-FITC обрабатывающей среды (полученного на стадии 1.12) и 4 мл полной среды до 37 ° С.
- Развести 3 мкл 5 мМ раствора флуоресцентного зонда (ядерный контрастное, упомянутых в перечне материалов) в 3 мл PBS до 5 мкм. Это решение должно быть защищено от света, держать его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов.
2. конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM)
- ГнРГ поглощение методом
- Возьмите первый микроскопический препарат, полученный на стадии 1.6, и пипеткой из полной среды из каждого из семи скважин. Добавьте 250 мкл предварительно нагретую полного Mediит в первую лунку. Используйте это в качестве отрицательного контроля. Добавьте 250 мкл в предварительно нагретый GnRH-FITC лечащему носитель (от 1.13) к каждому из следующих шести лунок (3 скважины с 1 мкМ и 3 с 10 мкМ). Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 часов.
- Пипетировать из среды из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл раствора (фиксирующим 10% нейтральный забуференный формалин) в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Пипетировать из Фиксирующий раствор из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл PBS, содержащего 5 мкМ раствора флуоресцентного зонда, полученного на шаге 1.14 в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Пипетировать из раствора флуоресцентного зонда из каждой лунки, и промыть клетки дважды 250 мкл PBS осторожно. Добавьте 3-4 капли монтажной среды в каждую лунку, в конце концов. Держите слайд в темноте при комнатной температуре, до получения изображения.
- Метод экспрессии GnRH-ИК
- Возьмем второй 8-луночного микроскопический препарат, полученный на стадии 1.7, и пипеткой из полной среды из каждой из пяти скважин.
- Добавить 250 мкл предварительно разогретой полной среды в первую лунку, использовать это в качестве отрицательного контроля. Добавить 250 мкл предварительно разогретой полной среды во вторую скважину тоже, и использовать эту возможность для изучения экспрессии GnRH-IR до лечения ГнРГ.
- Добавьте 250 мкл каждого из трех предварительно нагретый 10 мкМ ГнРГ-FITC лечащих сред в последующие три лунки. Используйте эти скважины для предварительной обработки клеток с ГнРГ-FITC конъюгатов, прежде чем рассматривать выражение GnRH-IR. Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
- Пипетировать из обрабатывающей среды из каждой из трех скважин, которые будут использованы для изучения ГнРГ-IR выражение после обработки ГнРГ и мыть эти лунки 250 мкл предварительно нагретую полной среды. Добавить 250мкл предварительно нагретую полной среды в каждой из трех лунок. Инкубировать слайд в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 1 ч.
- Пипетировать из среды от каждого из пяти лунок и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл фиксируя раствора в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 10 мин.
- Пипетировать из Фиксирующий раствор из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавьте 250 мкл PBS, содержащего 5% сыворотки бычьего альбумина (БСА) блокирующего раствора в каждую лунку и инкубировать слайд при комнатной температуре в течение 1 ч.
- Развести 10 мкл GnRH-ИК первичного антитела в 1 мл PBS (соотношение 1: 100). Держите его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов.
- Пипетировать из блокирующего раствора БСА из каждой лунки, кроме отрицательного контроля (первая скважина). Вымойте клеток с 250 мкл PBS (за исключением отрицательного контроля). Добавить 250 мкл PBS, содержащий GnRH-ИК первичного антитела, полученного на стадии 2.2.7 в EACч хорошо (за исключением отрицательного контроля). Выдержите слайд при комнатной температуре, в течение 1 ч в темном месте.
- Развести 2,5 мкл Alexa 546 меченых вторичных антител в 1,25 мл PBS (соотношение 1: 500).
Примечание: Это решение должно быть защищено от света, держать его при комнатной температуре и использовать его в течение нескольких часов. - Пипетировать из решения от каждой из пяти лунок и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавьте 250 мкл PBS, содержащих AF 546 меченого вторичного антитела, полученного на стадии 2.2.9 в каждую лунку. Выдержите слайд при комнатной температуре, в течение 1 ч в темноте.
- Пипетировать из раствора из каждой лунки и промыть клетки с 250 мкл PBS. Добавить 250 мкл PBS, содержащего 5 мкМ раствора флуоресцентного зонда, полученного на шаге 1.14 в каждую лунку и инкубировать слайд в течение 10 мин, при комнатной температуре.
- Пипетировать из раствора флуоресцентного зонда из каждой лунки и промыть клетки дважды 250 мкл PBS осторожно. Добавьте 3-4 капли монтажными среды в каждую лунку, после этого. Держите слайд в темноне при комнатной температуре до микроскопических изображений.
- обработки изображений
- Изображение клетки по перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (с использованием 63x цель нефти погружения)
- Используйте следующие длины волн возбуждения / излучения. ГнРГ конъюгаты: 488/514 нм, Alexa 546 меченые антитела,: 488/546 нм (использование только для метода экспрессии GnRH-IR), Draq5 флуоресцентного зонда: 633/680 нм.
- Настройка параметров изображения с использованием отрицательных клеток контроля. Используйте эти параметры для изображения клеток , обработанных (рисунок 3). Заново отрегулировать параметры изображения на каждом предметное стекло в начале анализа. Тонкая настройка и экспортировать изображения с программным обеспечением, предоставленным производителем, если это необходимо.
- Изображение клетки по перевернутой конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (с использованием 63x цель нефти погружения)
3. флуоресценция активированных сортировки клеток (FACS)
- Метод количественного определения ГнРГ
- Возьмите тарелку, полученного на стадии 1.8 и пипеткой из полной среды от еач из семи скважин. Добавить 1 мл предварительно разогретой полной среды в первую лунку. Используйте это в качестве отрицательного контроля. Добавить 1 мл каждого из шести предварительно нагретую обработки медиа (3 скважины с 1 мкМ и 3-х скважин с 10 мкМ) в течение следующих шести скважин. Инкубируйте планшет в увлажненной атмосфере 5% СО 2 атмосферы инкубаторе при температуре 37 ° С в течение 5 часов.
- Пипетировать из среды из каждой лунки. Промыть клетки дважды с 2 мл PBS тщательно. Добавьте 500 мкл раствора трипсин-ЭДТА в каждый лунки. Инкубируйте планшет при 37 ° С до тех пор, пока клетки не отделяться (примерно 10 мин).
- Добавляют 1 мл полной среды в каждую лунку, чтобы остановить трипсина. Встряхнуть тарелку. Суспендирования клеток осторожно пипеткой, и передать приостановку из каждой лунки в FACS труб. Центрифуга трубки при 150 х г в течение 4 мин, при температуре 4 ° С.
- Вылейте супернатанты осторожно, одним движением. Добавить 500 мкл охлажденного льдом PBS в каждую пробирку FACS и осторожно повторно приостанавливать клетки. Хранить трубы на льду до концаПостановка эксперимента.
- Анализ и расчет
- Анализ клеток методом проточной цитометрии. Для возбуждения используют 488 нм аргонового лазера и длину волны для обнаружения используют 530 нм. Настройка параметров потока цитометра, запустив отрицательные контрольные клетки. Используйте эти параметры для анализа обработанных клеток (рис 4а). Оценка данных с помощью программного обеспечения производителя, определить средний показатель интенсивности флуоресценции значений (MFI), и вычислить относительные значения MFI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Изображения, полученные с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (CLSM) предлагают захватывающую информацию о поглощении GnRH-FITC конъюгатов на данной клеточной культуре в то время и в зависимости от концентрации. Параллельно с этим ГнРГ-ФИТЦ конъюгаты, присутствие GnRH-IR на поверхности клеток также перепроверить эксперимента CLSM. Кроме того, при использовании дальнего красного окрашивания ДНК флуоресцентного зонда, можно контрастное ядрах клеток, к тому же ГнРГ и GnRH-IR. Тем не менее, в то время как конфокальной изображение не поддается количественному определению, простой "метод поглощения ГнРГ" может легко оценить, содержат ли исследуемые клетки большее или меньшее количество ГнРГ-FITC конъюгатов. Применяемые ГнРГ-FITC конъюгаты, их концентрации и время обработки являются переменными в этом методе, по мере необходимости. Как показано на рисунке 1 различных раковых клеток содержат различные уровни GnRH-FITC в зависимости от концентрации. Передовой "ГнРГ-ИК метод выражение" описывает визуализацию клеточной поверхности GnRH-IR с помощью иммуногистохимии, до и после лечения ГнРГ-FITC. В первой части этого метода (до лечения ГнРГ-FITC), мы визуализировать GnRH-IR с помощью иммуногистохимии, без лечения ГнРГ-FITC. Во второй части этого метода (после лечения ГнРГ-FITC), мы рассматриваем клетки в течение 1 ч с 10 мкМ GnRH-FITC. После обработки мы инкубировать клеток в полной среде в течение еще 1 ч и визуализировать GnRH-IR с помощью иммуногистохимии. Как показано на фигуре 2А, различные раковые клетки имеют различные уровни GnRH-IR на их поверхности до лечения ГнРГ-FITC. Как показано на рисунке 2B, после лечения ГнРГ-FITC, то GnRH-IR клеток , экспрессирующих поддерживать (EBC-1) или увеличения (Detroit-562) уровень GnRH-IR на их мембранах. В этот момент, обратите внимание, что мы ранее подтвердили, что BxPC-3 клетки также выражают GnRH-IR, но не представить его на своей мембране 18. ГнРГ-IR можно визуализировать внутри клеток BxPC-3 с помощью иммуногистохимии, если их мембраны проницаемыми. Это явление объясняет относительно низкую ГнРГ эффективность поглощения клеток BxPC-3. На основании этих утверждений можно сосредоточиться только на клеточной поверхности GnRH-IR здесь. Сравнение Рисунок 1 Рисунок 2 подтверждает , что уровень клеточной поверхности GnRH-IR коррелирует с количеством GnRH-FITC в соответствующих клетках. Кроме того, 3С поясняет , что ГнРГ-FITC , интернализируется в клетки , так как локализация GnRH-FITC отделен от сигнала клеточной поверхности GnRH-I стропилами 1 ч лечения ГнРГ-FITC. Мы пришли к выводу, что "метод выражения ГнРГ-ИК" поддерживает информацию, полученную из "GnRH метода обратного захвата".
Важно использовать хорошо отлаженный наборTings во время визуализации. Как показано на фигуре 3А на длине волны эмиссии FITC (514 нм) и флуорофора меченого вторичного антитела (546 нм), необработанные отрицательные контрольные клетки также имеют небольшой аутофлуоресценцию. Эта нежелательная флуоресценции может дать ложные положительные результаты. Таким образом, в начале формирования изображения, важно , чтобы регулировать интенсивность флуоресценции на контрольных клеток , как показано на фигуре 3В. Ожидается, что будет наблюдаться четкий сигнал ядер на длине волны испускания окрашивающим ядра (680 нм), с флуоресцентного сигнала на двух других длинах волн, просто видимой или близкой к нулю. Все остальные образцы клеток должны быть отображены с этими хорошо приспособленными и фиксированными параметрами. Таким образом, сигнал , наблюдаемый при 514 нм происходит от сигнала только FITC-ГнРГ, при длине волны 546 нм от полезного сигнала GnRH-IR в частности и при 680 нм от сигнала ядер , как показано на фиг.3С. Изображения могут быть фипе настроенная после визуализации с помощью программного обеспечения, если это необходимо.
Проточная цитометрия эксперименты предлагают количественному информацию о количестве ГнРГ-FITC конъюгатов, которые были рассмотрены клетками. Применяемые ГнРГ-FITC конъюгаты, их концентрации и время обработки также варьируют в этом методе, по мере необходимости. Необработанные клетки используются в качестве отрицательного контроля для регулирования потока цитометрии параметров и определить их медиана интенсивности флуоресценции (MFI) в начале анализа. Как показано на рисунке 4A ИТР был определен для каждого образца с использованием тех же самых параметров. Относительные значения MFI вычисляются из значений MFI , используя формулу расчета на рисунке 4B. С помощью этой формулы, относительное значение MFI, контрольных клеток всегда равна нулю. Рассчитанные относительные величины MFI количественного определения интенсивности флуоресценции GnRH-FITC конъюгатов, которые пропорциональны их аКонцентрации verage в клетках. Как показано на рисунке 5, с этими данными, можно показать и сравнить , насколько эффективно эти раковые клетки принимают на GnRH-FITC конъюгатов. Таким образом, результаты, полученные с помощью проточной цитометрии, дополняют и поддерживают изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии.
Рисунок 1: Конфокальные изображения необработанный и в [8 (Lys FITC)] - GnRH-III обрабатывают раковые клетки. Голубые пятна: ядра; зеленые пятна: [Лис 8 (FITC)] - GnRH-III. Эти изображения получены с использованием "ГнРГ метода поглощения". (А) Флуоресцентные сигналы необработанных клеток отрегулированы до нуля при 514 нм (зеленый) на каждой линии клеток. Draq5 далеко красный флуоресцентный зонд используется для окрашивания ядер клеток. (B) После применения настроек, рак EBC-1 легких и Детройт-562 человекраковые клетки обнаруживают глотка обнаружить, но низкий уровень сигнала при 514 нм (зеленый) после 5 ч лечения с 1 мкМ [лиз 8 (FITC)] - GnRH-III. (С) через 5 часов обработки 10 мкМ [Lys 8 (FITC)] - ГнРГ-III, каждый из трех клеточных линий присутствует выше флуоресцентный сигнал. Результаты этого эксперимента показывают, что BxPC-3 панкреатические раковые клетки заняли GnRH-FITC с гораздо более низкой эффективностью по сравнению с другими линиями двух клеточных, которые легко атаковать, с помощью ГнРГ конъюгатов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: Конфокальные изображения клеточной поверхности GnRH-IR до и после [D-Lys 6 (FITC)] - лечение GnRH-I. Голубые пятна: ядра; зеленые пятна: [D-Lys 6 (FITC)] - GnRH-I; красное пятно : GnRH-IR. Эти изображения генерируются с использованием "GnRH-IR метод экспрессии". (A) До лечения ГнРГ-FITC, клетки BxPC-3 не имеют GnRH-IR на мембране, однако EBC-1 клетки обладают высокой, и некоторые клетки Detroit-562 демонстрируют умеренный уровень GnRH-IR. (B) После лечения ГнРГ-FITC, клетки BxPC-3 до сих пор не проявляют GnRH-IR на своей мембране. Клетки ЕВС-1 поддерживают их экспрессия ГнРГ-ИК и ГнРГ-FITC, появляется внутри них. Клетки Detroit-562, похоже, выставляется более высокий уровень GnRH-IR после обработки, и они занимают GnRH-FITC, а также. Этот эксперимент показывает, что различные типы злокачественных опухолевых клеток демонстрируют различный уровень GnRH-IR на их поверхности, а также поглощение ГнРГ-FITC, как представляется, тесно связано с выражением ГнРГ-IR на клеточной поверхности. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: конфокальных изображений ЕВС-1 клеток рака легких. Голубые пятна: ядра; зеленые пятна: [Лис 8 (FITC)] - GnRH-III; красное пятно: GnRH-IR. Эти изображения сделаны "GnRH-IR методом экспрессии". (A) Необработанные клетки отрицательного контроля (без GnRH-FITC и Alexa 546) имеют обнаруживаемый и нежелательную флуоресценцию 514 нм и 546 нм при использовании более-усиленных настройки прибора. (B) Настройка параметров прибора на необработанных клетках отрицательный контроль, зеленый (514nm) и красный (546 нм) сигнал близок к нулю. (C) Скорректированные параметры приводят к четких и надежных сигналов для GnRH-FITC обработанной и GnRH-IR окрашенных клеток. После лечения ГнРГ-FITC, локализация GnRH-FITC (зеленый) отделена от клеточной поверхности GnRH-IR (красный).529fig3large.jpg "целевых =" _blank "> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 4: Оценка проточной цитометрии данных. (А) Гистограмма необработанного и обработанных клеток Детройт-562. Значения MFI клеточных образцов определяются из гистограммы. Ось Х изображает интенсивности флуоресценции клеток, а по оси у изображает отсчеты. Черная линия: MFI до лечения ГнРГ-FITC; зеленая пунктирная линия: MFI после 5 ч лечения с 1 мкМ [8 Лис (FITC)] - GnRH-III; красная пунктирная линия: MFI после 5 ч лечения с 10 мкМ [8 Лис (FITC)] - GnRH-III. (B) Формула расчета относительных величин MFI. Относительные значения MFI вычисляются из значений MFI. Используя этот расчет, относительное значение MFI, необработанного контрольного образца, всегда равна нулю. RELAT Значения Айв ПТР обработанных образцов представляют количество ГнРГ-FITC конъюгатов, которые находятся внутри клеток. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 5: Относительные величины ИТР раковых клеток через 5 часов обработки с 1 мкМ ГнРГ-FITC конъюгатов. Относительные величины MFI сопоставимы и определить, насколько эффективно данные типы клеток может занять до аналогов ГнРГ. В ГнРГ-ИК не-экспонирование клетки BxPC-3 содержат только следы этих аналогов ГнРГ. GnRH-IR выражения EBC-1 клетки рака легкого содержат умеренное и Детройт-562 раковые клетки глотка содержат большое количество аналогов ГнРГ. Результаты представлены в виде среднего значения ± стандартное отклонение, n = 3."_blank"> Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эксперименты, описанные здесь используют селективно меченых аналогов ГнРГ для скрининга приверженца культуры клеток в пробирке. Конфокальной микроскопией и проточной цитометрии методы пригодны для отслеживания и количественной оценки клеточное поглощение этих ГнРГ-ФИТЦ конъюгаты в то время, и зависимым от концентрации образом. Эти эксперименты имеют следующие важные шаги: 1) поддерживать стерильную, здоровую клеточную культуру; 2) ГнРГ пептиды должны быть высокого качества; 3) разумные концентрации и времени инкубации должны быть соблюдены; 4) обработки и промывки; 5) отлаженный настройки прибора.
Клетки сохран ют в среде, рекомендованной изготовителем, дополненной 10% (V / V) эмбриональной телячьей сыворотки и антибиотиков (полная среда). Клетки должны храниться и не обработаны в стерильной среде до стадии обработки (с ГнРГ-FITC конъюгатов). Перед экспериментами, проверьте клеток с использованием инвертированного микроскопа. Они должны быть здоровыми, Приложен и должен достигнуть требуемого количества.
Важно использовать гонадолиберина пептиды с высоким качеством и чистотой. Мы синтезировали эти пептиды и очищают их более 98% 18. Пептид можно хранить при -25 ° С в холодильнике в виде лиофилизированного порошка. В 10 мМ GnRH-FITC исходные растворы в ДМСО должны храниться в темном месте при комнатной температуре и использовать в течение нескольких недель. Мы исследовали стабильность этих конъюгатов и обнаружили, что они стабильны в ДМСО и их интенсивность флуоресценции сохраняются после 1 месяца надлежащего хранения. Концентрация ГнРГ-FITC конъюгатов и время лечения являются переменными в этих экспериментах, который предлагает большие преимущества, но с некоторыми ограничениями (см ниже). Применяемые концентрации и времени инкубации в этом протоколе только рекомендации, но они обеспечивают хорошую основу для начальных экспериментов.
Эксперименты CLSM требуют разъединитьаль стадии промывки. Эти шаги должны быть выполнены тщательно. Не переносить жидкость непосредственно на клетки. Скорее всего, использовать сторону или угол лунок для этой цели. Это может свести к минимуму смывания и потери прилипшие клетки. Кроме того, рекомендуется избегать прямого света в течение всего эксперимента, так как это может снизить чувствительность флуоресцентных образцов (фотообесцвечиванию эффект). Хранить обработанные образцы в темном месте или покрытые куском алюминиевой фольги во время эксперимента. На основании предыдущих выводов, мы заметили, что конечная концентрация ДМСО в прикладном лечащий сред незначительна (0,1% (V / V) ДМСО в концентрации 10 мкМ для обработки носителя) и не оказывает никакого влияния на результаты, таким образом, ДМСО-свободно полная среда также пригодны в качестве отрицательного контроля.
Важно использовать хорошо скорректированные параметры прибора во время экспериментов CLSM и FACS. Эти параметры должны быть повторно откалиброван на каждом типе клеток, перед тем как анализы. В эксперименте CLSM, сигнал интенсивность конфокальных изображений зависит от следующих параметров: интенсивности лазерного излучения, коэффициента усиления детектора и смещение, и пинхол размера. При настройке этих параметров, используйте самую низкую мощность лазера для получения приемлемого изображения и избежать фотообесцвечивания. Установите параметры изображения для настройки фоновой флуоресценции неокрашенных отрицательных контрольных клеток практически до нуля (рис 3B). Изображение обработанных клетках с этими настраиваемых параметров, чтобы избежать ложных положительных результатов. Дополнительные сигналы, излучаемые из обработанных клеток при 514 нм и 546 нм, содержит необходимую информацию о гонадолиберина или GnRH-IR. Эти шаги требуют опыта в экспериментах CLSM. В эксперименте FACS, создать стандартный разброс вперед стороне график рассеяния (линейная шкала) и установить напряжения для регулировки основного населения живой клетки в середине участка. Нарисуйте область вокруг живых клеток. Создание гистограммы, установите оси абсцисс на канал один (FL1-530 нм, логарифмическая шкала) и установите ранее определенную область как воротадля этой гистограммы. Установить FL1 напряжение , чтобы довести сигнал неокрашенных клеток отрицательного контрольного образца при 10 1 (фиг.4А). Анализ обработанных клеток с этими настраиваемых параметров.
Кроме того, важно, чтобы проверить состояние микоплазмы клеточных культур время от времени. Как показывают различные анализы доступны для этой цели. В случае микоплазмы позитивности, выбросьте клетки и начать работать с новой культурой. Рекомендуется использовать смесь антибиотика в культуральной среде, которая оптимизирована для предотвращения микоплазма. Применяемая концентрация ГнРГ-FITC конъюгатов, а время лечения являются переменными в этих экспериментах, однако применение низких концентраций и короткое время инкубации может привести к слишком слабым сигналом для флуоресцентной детекции.
При визуализации GnRH-IR параллельно с аналогами ГнРГ, рекомендуется более высокая концентрация GnRH-FITC (10 мкМ является оптимальным). Причиной более высокой концентрацииэто короткое время инкубации (1 час) и относительно высокий сигнал флуоресценции меченого антитела, по сравнению с ГнРГ-FITC конъюгатов. С другой стороны, незначительное перекрытие между двумя флуоресцентными выбросами красителя (514 нм и 546 нм) найдено, что происходит только при 546 нм, и выводится из сигнала ГнРГ-FITC конъюгатов. Тем не менее, относительно выше флуоресцентного сигнала Alexa 546 и хорошо приспособленный параметры могут минимизировать этот эффект, как показано на рисунке 3. Другим возможным решением, чтобы избежать дублирования, заключается в применении меченого вторичного антитела, которое имеет различную длину волны возбуждения и / или более отделенной спектр излучения по сравнению с FITC (если технические параметры CLSM позволяют это). Эта возможность предлагает большое преимущество для метода CLSM, что позволяет с помощью дополнительных флуоресцентных зондов параллельно с ГнРГ-FITC конъюгатов. Например, эти альтернативные флуоресцентные зонды могут быть использованы для counterstaining других органеллах, как это необходимо.
Применяемая концентрация GnRH-FITC конъюгатов имеет следующие ограничения. Максимальный предел концентрации гонадолиберина-FITC конъюгатов на основе их растворимости в 18. Эти значения являются следующие в PBS при комнатной температуре: GnRH-I: 90 мкМ; GnRH-II: 40 мкМ; ГнРГ-III: 200 мкМ. С другой стороны, в предыдущих экспериментах мы предполагали, что поглощение этих ГнРГ пептидов может происходить другими, чем рецепторы GnRH-I рецепторы человека; это поглощение , как представляется, более значительным при более высоких концентрациях (выше 10 мкМ) 18. Нижний предел обнаружения ГнРГ-FITC конъюгатов на основе различных параметров, но в идеальных параметрах он приблизительно 1 мкМ для CLMS экспериментов. Мы обнаружили, что проточной цитометрии обеспечивает более высокую чувствительность, чем конфокальной микроскопии. В идеальных условиях, предела количественного ГнРГ-FITC конъюгатов может быть ниже, чем 1 мкМ. Предел обнаружения или количественного определения можетбыть разными в каждом эксперименте, так как они зависят от типа клеток и времени инкубации. Следует отметить, что данные, полученные с помощью FACS является более надежным, чем CLSM, так как он обнаруживает тысячи клеток на образец, а средний сигнал ячеек вычисляется. Тем не менее, в протоколе, FACS не содержит информацию о клеточной локализации ГнРГ-FITC конъюгатов и экспрессию на клеточной поверхности ГнРГ-IR. Исходя из этих соображений, мы приходим к выводу, что, то CLSM и эксперименты FACS имеют определенные преимущества, и они дополняют друг друга. С другой стороны, высокое содержание анализа изображения может быть интересной и хорошей альтернативой для FACS и анализа CLSM.
Таким образом, данные, полученные в результате этих экспериментов подтверждают, что каждый из трех ГнРГ-ФИТЦ конъюгаты могут входить в клетки, которые экспрессируют на поверхности клеток ГнРГ-IR. Эти аналоги ГнРГ имеют одинаковую эффективность нацеливания при тех же концентрациях. Тем не менее, уровень ГнРГ-ИК на поверхности различную можетCER клетки сильно варьирует. Результаты, рассчитанные по данным проточной цитометрии анализа позволяет сравнивать клеточных линий или аналогов ГнРГ. В то же время, изображения, полученные с помощью конфокальной микроскопии может выявить уровень экспрессии ГнРГ-IR на поверхности клеток и подтвердить, что эти конъюгаты усваиваются в клетки. Основываясь на этих результатах, можно утверждать, что введенные эксперименты содержат практические и переменные методы для исследования на основе GnRH систем доставки лекарственных средств и предлагают хорошую основу для дальнейших экспериментов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
- Gilad, Y., Firer, M., Gellerman, G. Recent Innovations in Peptide Based Targeted Drug Delivery to Cancer Cells. Biomedicines. 4 (2), 11 (2016).
- Majumdar, S., Siahaan, T. J.
- Ramakrishnappa, N., Rajamahendran, R., Lin, Y. M., Leung, P. C. K.
- Schally, A. V., et al.
- Limonta, P., et al. GnRH receptors in cancer: From cell biology to novel targeted therapeutic strategies. Endocr Rev. 33 (5), 784-811 (2012).
- Ma, Y. T., Zhou, N., Liu, K. L. Targeting drug delivery system based on gonadotropin-releasing hormone analogs: Research advances. J of Int Pharm Res. 41 (2), 140-148 (2014).
- Manea, M., et al. In-vivo antitumour effect of daunorubicin-GnRH-III derivative conjugates on colon carcinoma-bearing mice. Anti-Cancer Drugs. 23 (1), 90-97 (2012).
- Argyros, O., et al. Peptide-Drug conjugate gnrh-sunitinib targets angiogenesis selectively at the site of action to inhibit tumor growth. Cancer Res. 76 (5), 1181-1192 (2016).
- Karampelas, T., et al. GnRH-Gemcitabine conjugates for the treatment of androgen-independent prostate cancer: pharmacokinetic enhancements combined with targeted drug delivery. Bioconjug Chem. 25 (4), 813-823 (2014).
- Millar, R. P., Pawson, A. J., Morgan, K., Rissman, E. F., Lu, Z. -L. Diversity of actions of GnRHs mediated by ligand-induced selective signaling. Front Neuroendocrinol. 29 (1), 17-35 (2008).
- Millar, R. P., et al. Gonadotropin-releasing hormone receptors. Endocr Rev. 25 (2), 235-275 (2004).
- Olberg, D. E., et al. Synthesis and in vitro evaluation of small-molecule [18F] labeled gonadotropin-releasing hormone (GnRH) receptor antagonists as potential PET imaging agents for GnRH receptor expression. Bioorg Med Chem Lett. 24 (7), 1846-1850 (2014).
- Zoghi, M., et al. Development of a Ga-68 labeled triptorelin analog for GnRH receptor imaging. Radiochimica Acta. 104 (4), 247-255 (2016).
- Guo, H., Gallazzi, F., Sklar, L. A., Miao, Y. A novel indium-111-labeled gonadotropin-releasing hormone peptide for human prostate cancer imaging. Bioorg Med Chem Lett. 21 (18), 5184-5187 (2011).
- Nederpelt, I., et al. Characterization of 12 GnRH peptide agonists - A kinetic perspective. Br J Pharmacol. 173 (1), 128-141 (2016).
- Szabo, I., et al. Comparative in vitro biological evaluation of daunorubicin containing GnRH-I and GnRH-II conjugates developed for tumor targeting. J Pept Sci. 21 (5), 426-435 (2015).
- Leurs, U., et al. GnRH-III based multifunctional drug delivery systems containing daunorubicin and methotrexate. Eur J Med Chem. 52, 173-183 (2012).
- Murányi, J., et al. Synthesis, characterization and systematic comparison of FITC-labelled GnRH-I, -II and -III analogues on various tumour cells. J Pept Sci. 22 (8), 552-560 (2016).
