Summary
选择性标记的荧光的GnRH-I，-II和-III衍生物对于跟踪可靠的工具和量化它们的细胞摄取。这个手稿介绍实验来可视化，量化和比较在各种细胞系这些GnRH的缀合物的吸收效率。
Abstract
GnRH类似物是有效的靶向部分和能够提供抗癌剂选择性为恶性肿瘤细胞，其高表达的GnRH受体。然而，GnRH类似物'细胞摄取的定量分析以及基于GnRH的药物递送系统的研究的细胞类型，目前的限制。以前介绍过，选择性荧光标记的GnRH I，-II和-III衍生产品提供了很大的可探测性，和他们有重复性的和健壮的实验合适的化学性质。我们还发现，适当的向上的最新方法与这些标记GnRH类似物能够提供有关基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的新信息。该原稿介绍关于[D-赖氨酸6（FITC）]的细胞摄取了一些简单的和快速的实验-促性腺激素释放激素I，D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH -III在EBC-1（肺），在中BxPC-3（胰腺）和底特律-562-（咽）恶性Ťumor细胞。在与这些的GnRH-FITC缀合物平行，促性腺激素释放激素-1受体的细胞表面水平也之前和促性腺激素释放激素治疗通过共聚焦激光扫描显微镜后检查了这些细胞系。的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取是通过荧光激活细胞分选进行定量。在这些实验中观察到GnRH类似物和细胞类型之间的主要区别之间的微小差别。其中细胞系的显著差异有其独特的细胞表面的GnRH-I受体水平相关。引入的实验包含实用的方法来可视化，量化和在各种粘附细胞培养以时间和浓度依赖的方式进行比较的GnRH-FITC缀合物的吸收效率。这些结果可以预测在给定的细胞培养物的GnRH偶联物的药物靶向效率，并提供用于在基于促性腺激素释放激素的药物递送系统的检查的进一步实验的良好基础。
Introduction
基于肽靶向给药系统已成为癌症治疗中一个快速显影和希望的领域，在过去几年中1,2。人促性腺激素释放激素受体I型（GnRH的-IR）是主要位于脑垂体，但也存在于其他几个它们负责自我繁殖3的组织。的GnRH-IR也表示在许多癌组织中，相关或无关的生殖系统4,5。促性腺激素释放激素-IR的几种恶性肿瘤细胞高表达与正常组织相比，提供了有针对性的治疗5,6的机会。
许多促性腺激素释放激素（GnRH）类似物已在过去的几十年中，它可以用来作为靶向部分开发F“> 7，8，9，这些肽是能够提供以高选择性抗癌剂为恶性肿瘤细胞，其过量表达的GnRH-IR 6。几种的GnRH偶联的抗肿瘤药物具有更高的选择性和更高的效率比相应的未缀合游离药物已经报道了7，8，9。
有关的GnRH肽及其受体以前的出版物报道，GnRH的红外可以假设具有不同的选择性GnRH类似物10的各种构象。高度可变的GnRH-IR已复杂和各种信号通路被赋予了对他们的自然和人工配体11个不同的活动。这些事实使得基于促性腺激素释放激素系统的调查具有挑战性。另一方面，在 Ÿ具有前途的治疗潜力。用放射性标记的GnRH肽几个实验以前报道12， 第13， 第 14，第 15，但实验，其中使用荧光标记的GnRH类似物仍然有限。而放射性标记具有高灵敏度，荧光标记有几个其他的优点，例如容易处理，并用不同的荧光团给染液的能力。已成功地被用于药物递送三种常见GnRH类似物是[D-赖氨酸6] -GnRH-I，D-赖氨酸6] -GnRH-II和GnRH的-Ⅲ，但这些肽的作为靶向部分的有效性是很少相比16，17。另一方面，在其中不同的癌细胞和GnRH类似物被用于从不同的实验结果是多样的。
ntent“>基于这些考虑，我们集中在肿瘤靶向和药物递送的潜在这些的GnRH肽的，并且由此合成和表征的[D-赖氨酸6（FITC）〕 -的GnRH-I，D-赖氨酸6（FITC ）〕 -的GnRH-II和[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH-III肽缀合物18这些类似物有选择地与FITC标记上的他们的赖氨酸或D-赖氨酸（肽-FITC比率侧链1:1每个。缀合物），其思想是，选择性荧光标记可以提供有关这些肽新颖的信息，并允许他们的良好的跟踪和可靠的定量。这些结合物具有安全处理和可靠探测，这使得它更容易比较他们的肿瘤靶向效率，并且许多类型的恶性肿瘤细胞的筛选，我们希望达至最新的实验与这些肽偶联物可能有助于新型癌症的靶向发展促性腺激素释放激素药物结合物，并有助于发现新的治疗焦油得到为好。本手稿演示用的GnRH-FITC结合物以及一些重复性好，快速实验。的GnRH-R的细胞表面表达是关于GnRH的摄取决定性条件，因此我们同时研究了所测试的细胞系中的GnRH-1R的细胞表面水平。我们可视通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）GnRH的IR和GnRH的-FITC缀合物和使用荧光激活细胞分选（FACS）定量的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。
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Protocol
1.细胞培养和试剂的制备
- 保持在制造商推荐的培养基中的细胞培养物，补充有10％（体积/体积）胎牛血清和抗生素（称为完全培养基）。保持细胞培养烧瓶在湿润的5％CO 2气氛中培养器在37℃。按照倒置显微镜下细胞的增殖和汇合（使用10X相衬物镜）。
- 当细胞达到足够汇合，取出培养基，并用2-3毫升，无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤培养物。移除PBS并加入0.5毫升，无菌0.25％胰蛋白酶-EDTA溶液向细胞培养，并在37℃下孵育直至细胞分离（约10分钟）。
- 暂停细胞3-4毫升无菌完全培养基停止胰蛋白酶和他们转移到无菌离心管中。离心细胞，在150×g离心，在室温（RT）下4分钟。小心弃上清，并暂停在pellet在2-3毫升无菌完全培养基。
- 取出100μL的细胞悬浮液，并用100微升0.4％（M / V）台盼蓝溶液混合，以染色死细胞。负载10微升该混合物成血球和确定存活细胞倒置显微镜的数量。
- 稀释细胞悬浮液，在步骤1.3制得10毫升的无菌的完全培养基的所需量，含有4×10 4个细胞/毫升。
- 加入每孔细胞悬液（步骤1.5准备）的250微升（10 4个细胞/孔）到七口井第一玻璃底部的8孔显微镜载玻片的。在使用促性腺激素释放激素摄入法这张幻灯片。
- 添加每孔的细胞悬浮液（在步骤1.5中制备）的250微升（10 4个细胞/孔）到第二8孔显微镜载玻片的五井。这种滑动将在的GnRH-IR表达的方法中使用。
- 加1，每孔的细胞悬浮液（在步骤1.5中制备）中的溶液（4×10 4个细胞/孔）成七个逢一个12孔板的LS。该板将在GnRH的量化方法中。
- 让细胞附着在两个显微镜载玻片和板。孵育他们在湿润，5％的CO 2气氛中培养器在37℃下48小时。
- 孵化后检查倒置显微镜下细胞（使用10X相衬物镜）。如果细胞是健康和连接，请继续下面的步骤。
- 准备从每三个偶联物18的在二甲亚砜（DMSO）的10mM的GnRH-FITC储液。 （使用这些稀释浓度：16.43微克/μL[D-赖氨酸6（FITC） -的GnRH-I，16.97微克/μL[D-赖氨酸6（FITC） -的GnRH-II和16.47微克/μL[赖氨酸8（ FITC）〕 - 的GnRH-III）中保持这些储备溶液在暗处在室温下并在几周内使用它们。
- 稀释每三个10毫米的GnRH-FITC股票解决方案1.7毫升完全培养基1.7微升。撼动这些解决方案。 （帖e为10μM的GnRH-FITC处理介质。）稀释每三个10μM的GnRH-FITC处理介质的150微升1.35中完全溶液中。摇这些解决方案，以及（这些是1μM的GnRH-FITC处理介质）。
注：含有处理介质的所有的GnRH-FITC应避光和几个小时内用完。 - 预热的六个的GnRH-FITC处理介质（在步骤1.12的方法制备）和4毫升完全培养基中至37℃。
- 稀的5mM的荧光探针溶液3微升在3毫升PBS中（在材料清单中提到核染剂）至5微米。该溶液应避光，其保持在RT，并在几个小时内使用完。
2.激光共聚焦显微镜（CLSM）
- 促性腺激素释放激素摄入法
- 采取步骤准备1.6的第一个显微镜载玻片，并吸取了来自各的七的完全培养基。加入预热完整的中介的250微升微米到第一井。使用此作为阴性对照。添加预热的GnRH-FITC的250微升处理介质（从1.13）到每个未来六井（3个孔用1μM和3与10μM）。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃5小时。
- 吸取出从每个孔的培养基，并用250微升PBS洗涤该细胞。加定影溶液（10％中性缓冲福尔马林）的250微升每孔，并培育在RT滑动，10分钟。
- 吸取出从每个孔定影液，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加250微升含在步骤1.14制备成每孔5微米的荧光探针溶液的PBS并孵育在RT滑动，10分钟。
- 吸取了从每个荧光探针解决好，并用250微升PBS仔细清洗细胞两次。添加安装介质3-4滴到每口井，终于。保持室温在黑暗的幻灯片，直到成像。
- 促性腺激素释放激素-IR表达法
- 取在步骤1.7制得的第二8孔显微镜载玻片和吸取出从各五个井的完全培养基。
- 添加预热的完全培养基的250微升到第一井，用此作为阴性对照。加入预热的完全培养基250μL进入第二也很好，并使用此GnRH的治疗前检查的GnRH-IR表达。
- 加入这三个预热10μM的GnRH-FITC处理介质的250微升到下一个三口井。使用这些井检查的GnRH-IR表达之前，用预处理的GnRH-FITC结合物的细胞。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃1小时。
- 吸取出从每个将被用于检查的GnRH处理后的GnRH-IR表达并用预热完全培养基250μL的洗涤这些孔中的三个孔的处理介质。加入250μL的预热完全培养基到每个三口井的。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中培养器滑动，在37℃1小时。
- 吸取出从每五个孔的培养基，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加250微升定影溶液导入各孔中，并孵育在RT滑动，10分钟。
- 吸取出从每个孔定影液并用PBS 250微升洗细胞。添加的PBS 250微升含5％牛血清白蛋白（BSA）封闭溶液导入各孔中，并孵育在RT滑动，1小时。
- 稀的GnRH-IR初级抗体的10μL的1毫升PBS中（1：100的比例）。将其保持在RT，并在几个小时内使用完。
- 吸取出从每个孔除外阴性对照（第一阱）的BSA封闭溶液。洗净用250微升PBS细胞（除阴性对照好）。加入250包含步骤2.2.7制备成EAC的GnRH-IR一抗的PBS微升ħ井（除了阴性对照）。孵育所述滑动在RT，1小时，在黑暗的地方。
- 稀释的Alexa 546标记的第二抗体的2.5微升在1.25毫升的PBS（1：500的比例）。
注意：此溶液应该避光，其保持在RT，并在几个小时内使用完。 - 吸取出从每五个井的解决方案，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加的PBS 250微升含在步骤2.2.9制备成每个孔的AF 546标记的第二抗体。孵育所述滑动在RT，在黑暗1小时。
- 吸取出从每个孔中的溶液，并用250微升PBS洗涤该细胞。添加包含在步骤1.14制备成每孔5微米的荧光探针溶液的PBS 250微升，孵育滑动10分钟，在RT。
- 吸取出从每个孔的荧光探针溶液，并用250微升的PBS小心洗细胞两次。添加安装介质3-4滴进每口井，后来。避光幻灯片在室温下，直到显微成像。
- 成像
- 图像的单元倒置共聚焦激光扫描显微镜（使用63X油浸物镜）
- 使用下面的激发/发射波长。 GnRH的结合物：五百十四分之四百八十八纳米，Alexa的546标记的抗体：五百四十六分之四百八十八纳米（仅使用促性腺激素释放激素-IR表达法），DRAQ5荧光探针：680分之633纳米。
- 设置使用阴性对照细胞中的摄像参数。使用这些参数来图像处理的细胞（ 图3）。重新调整上在分析的开始每个显微镜载玻片成像参数。微调和出口的图像与在必要时由制造商提供的软件。
- 图像的单元倒置共聚焦激光扫描显微镜（使用63X油浸物镜）
3.荧光激活细胞分选（FACS）
- GnRH的定量方法
- 采取步骤准备1.8板，并吸取了来自EA的完全培养基七口井的通道。添加1毫升预热的完全培养基到第一井。使用此作为阴性对照。加入1毫升每个预热六个处理介质（3口井1μM和3口井，10μM）进入下一个六口井的。孵育在湿润，5％的CO 2气氛中孵化该板在37℃5小时。
- 吸取出从每个孔的介质。用2毫升的PBS仔细清洗细胞两次。加的胰蛋白酶-EDTA溶液500微升到每个孔中。在37℃孵育板，直至细胞分离（约10分钟）。
- 加入1毫升完全培养基到每口井停止胰蛋白酶。摇板。轻轻悬浮细胞用吸管，并从各孔转移悬浮液到FACS管。离心管，在150×g离心4分钟，在4℃。
- 小心倒出上清液，用一招。添加冰冷的PBS 500微升到每个FACS管中，轻轻地重新悬浮细胞。保持冰管，直到结束的实验。
- 分析计算
- 分析通过流式细胞术细胞。激发，使用488nm的氩激光器波长和用于检测使用530nm的波长。通过运行阴性对照细胞建立细胞仪参数的流动。使用这些参数来分析处理的细胞（ 图4A）。用制造商的软件对数据进行评估，确定平均荧光强度（MFI）值，并且计算相对的MFI值。
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Representative Results
激光共聚焦扫描显微镜（CLSM）获得的图像提供有关的GnRH-FITC结合物在给定的细胞培养的时间和浓度依赖性摄取壮观信息。在与这些的GnRH-FITC缀合物的同时，促性腺激素释放激素-1R的细胞表面上的存在也由CLSM实验验证。另外，通过使用一远红DNA染色荧光探针，能够为了对细胞的细胞核以外的GnRH和GnRH的-1R。然而，虽然共焦图像不是量化的，简单的“GnRH的摄入法”可以容易地估计所测试的细胞是否含有较高或较低量的GnRH-FITC缀合物。所施加的GnRH-FITC缀合物，它们的浓度和处理的时间是可变的在该方法中，根据需要。正如图1所示不同的癌细胞含有以浓度依赖性的方式不同级别的GnRH-FITC的。 先进“的GnRH-IR的表达方法”描述了细胞表面的GnRH-IR的可视化免疫细胞化学，前后的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理前）的第一部分中，我们通过免疫细胞化学形象化的GnRH-IR，而不的GnRH-FITC治疗。在此方法（GnRH的FITC处理之后）的第二部分，我们把细胞与10μM的GnRH的-FITC 1小时。在处理后，我们孵育在完全培养基中的细胞用于进一步1小时，并通过免疫细胞化学形象化的GnRH-1R。 如图2A中所示，不同的癌细胞中的GnRH-FITC治疗前在其表面上表现出不同水平的GnRH-1R的。 如图2B所示，促性腺激素释放激素-FITC处理后，表达细胞的GnRH的红外保持（EBC-1）或增加（底特律-562）的GnRH-IR上它们的膜的水平。在这一点上，注意，我们先前确认的BxPC-3细胞还表达的GnRH-IR，但不呈现在他们的膜18。的GnRH-IR可以的BxPC-3细胞内免疫细胞化学可视化，如果他们的膜透。这一现象说明的BxPC-3细胞的相对较低的GnRH吸收效率。基于这些说法我们只专注于细胞表面的GnRH-IR在这里。比较图1至图2证实了细胞表面的GnRH-IR的水平的GnRH-FITC在相应的细胞的量相关。此外， 图3C澄清的GnRH-FITC被内化进入细胞，因为促性腺激素释放激素-FITC的定位是从细胞表面的GnRH-I-拉夫特1的GnRH-FITC治疗h的信号中分离出来。我们的结论是“的GnRH-IR表达的方法”支持从“GnRH的摄入法”所获得的信息。
这是用好调整的重要组在成像过程中吊环。截至FITC（514纳米），荧光标记的第二抗体（546纳米）的发光波长在图3A中所示，未经处理的阴性对照细胞也有轻微的自体荧光。这意外的荧光可以提供假阳性结果。从而，在成像的开始到调整的对照细胞的荧光强度， 如图3B是重要的。据预计，一会在其他两个波长的核染色（680纳米）的发光波长观察细胞核的明确的信号，与荧光信号仅仅是可见或接近零。所有其他细胞样品应与这些精心调整并固定参数进行成像。这样，在514处观察到的信号是从仅FITC标记的GnRH的信号中导出，在546处从GnRH的红外尤其，在从细胞核的信号680毫微米的信号， 如图3C所示 。图像可以连接如果有必要使用软件成像后，NE-调整。
流式细胞术实验提供关于哪个是由细胞吸收的GnRH-FITC缀合物的量可量化的信息。所施加的GnRH-FITC缀合物，它们的浓度和处理的时间也是可变的在该方法中，根据需要。未处理的细胞被用作阴性对照，用于调节流式细胞参数和在分析的一开始，以确定他们的中位荧光强度（MFI）。如关于图4A所示的MFI是为使用相同的参数来对每个样品确定。相对的MFI值是从使用图4B中的计算式的MFI值计算。使用这个公式，控制细胞的相对的MFI值始终为0。计算出的相对的MFI值量化的GnRH-FITC缀合物，这是成比例的其一个的荧光强度verage浓度在细胞中。正如图5所示，与这些数据，可以表现出与比较这些癌细胞如何有效占用的GnRH-FITC缀合物。因此，通过流量获得的结果流式细胞仪补充和支持通过共聚焦显微镜获得的图像。
图1：未经处理的和[赖氨酸8（FITC）]的共聚焦图像-的GnRH-Ⅲ治疗的癌症细胞。蓝染色：核;绿染色：[8赖氨酸（FITC） -的GnRH-III。使用“的GnRH摄取方法”获得这些图像。 （A）中的未经处理的细胞的荧光信号在每个细胞系514纳米（绿）调节到接近零。所述DRAQ5远红荧光探针被用来染色细胞的核。 （ 二 ）应用设置，EBC-1肺癌和底特律的562人后咽癌细胞显示检测，但与1μM[8赖氨酸（FITC）5 h后514纳米（绿色）低信号-促性腺激素释放激素-III。 （C）与10μM的5小时处理后[赖氨酸8（FITC）〕 -的GnRH-III分别在三个细胞系的本更高的荧光信号。从该实验结果表明，胰腺癌BxPC-3胰腺癌细胞拿起的GnRH-FITC与低得多的效率相比，是容易靶向由GnRH的缀合物的其他两种细胞系。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：细胞表面的GnRH-IR之前和之后的[D-赖氨酸6（FITC）的共聚焦图像-促性腺激素释放激素-I治疗。蓝染色：核;绿染色：[D-赖氨酸6（FITC） -的GnRH-I;红染色 ：促性腺激素释放激素-IR。这些图像是使用“的GnRH-IR表达法”产生的。 （A）中的GnRH-FITC治疗前的BxPC-3细胞不具有的GnRH-IR在膜上，然而EBC-1细胞表现出高和某些底特律-562细胞表现出的GnRH-1R的中等水平。 （ 二 ）的GnRH-FITC处理后的BxPC-3细胞仍然不其膜促性腺激素释放激素表现出-IR。 EBC-1细胞保持自己的GnRH-IR表达的GnRH-FITC出现他们的内部。底特律-562细胞似乎参展治疗后更高水平的GnRH-IR和它们占用的GnRH-FITC，以及。该实验揭示了不同类型的恶性肿瘤细胞在其表面上表现出不同水平的GnRH-1R的，以及促性腺激素释放激素-FITC吸收似乎密切相关的细胞表面的GnRH-IR表达。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3：EBC-1肺癌细胞的共聚焦图像。蓝染色：核;绿染色：[8赖氨酸（FITC） -的GnRH-III;红染色：促性腺激素释放激素-IR。这些图像被“的GnRH-IR表达的方法”进行。 （ 一 ）未经处理的阴性对照组（没有的GnRH-FITC和Alexa 546）采用过度放大仪器设置时，必须在514 nm和546 nm的检测和不需要的荧光。 （B）在未经处理的阴性对照细胞调整仪器设置，绿（514nm）和红色（546纳米）信号接近零。 （ 三 ）调整参数，导致对GnRH的-FITC处理，促性腺激素释放激素-IR染色细胞清晰可靠的信号。 GnRH的FITC处理后，促性腺激素释放激素-FITC（绿色）的定位是从细胞表面的GnRH-IR（红色）分离。529fig3large.jpg“目标=”_空白“>点击此处查看该图的放大版本。
图4：流式细胞仪数据的评估。 （A）未处理和处理底特律-562细胞的直方图。的细胞样品的MFI值从直方图确定。 x轴示出了细胞的荧光强度，而Y轴示出计数。黑线：MFI GnRH的-FITC治疗前;绿色虚线：MFI 1μM[8赖氨酸（FITC）5 h后-促性腺激素释放激素-III;红色虚线：MFI 10μM[8赖氨酸（FITC）5 h后-的GnRH-III。 （B）相对MFI值的计算公式。相对的MFI值从MFI值计算。使用这个计算，未处理的对照样品的相对MFI值始终为0。该RELAT处理过的样品的IVE MFI值代表的GnRH-FITC缀合物它们在细胞内的量。 请点击此处查看该图的放大版本。
图5：用的GnRH-FITC缀合物的1μM5小时治疗后肿瘤细胞的相对的MFI值。相对MFI值具有可比性，并确定给定的细胞类型可以如何有效占用GnRH类似物。 GnRH的-IR非参展的BxPC-3细胞只含有这些GnRH类似物的痕迹。表达EBC-1肺癌细胞GnRH的-IR含有中度和底特律-562咽癌细胞含有GnRH类似物含量高。结果表示为平均值±SD，N = 3。“_blank”>请点击此处查看该图的放大版本。
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Discussion
本文所述实验中使用的选择性标记GnRH类似物进行筛选粘附 细胞培养体外 。共聚焦显微镜和流式细胞仪方法适合于跟踪和量化以时间和浓度依赖的方式，这些的GnRH-FITC缀合物的细胞摄取。这些实验有以下关键步骤：1）保持无菌的，健康的细胞培养物; 2）的GnRH肽必须是高质量的; 3）合理的浓度和孵育时间必须遵循; 4）一种治疗和洗涤步骤; 5）以及调整仪器设置。
细胞保持在（V / V）胎牛血清和抗生素（完全培养基）补充有10％的生产商推荐的介质。细胞应保持并在无菌环境中进行处理，直到处理步骤（与的GnRH-FITC缀合物）。实验前，检查使用倒置显微镜细胞。他们应该是健康的，连接必须达到规定的数量。
使用的GnRH肽以高品质和纯度是重要的。我们合成这些肽纯化他们超过98％的18岁 。所述肽可以储存在-25℃冰箱中作为冻干粉末。在10毫的GnRH-FITC储液在DMSO应保持在室温下暗处和几周内用完。我们研究了这些缀合物的稳定性，发现它们是稳定的在DMSO和其荧光强度都1个月适当的储存后保持不变。的GnRH-FITC缀合物的浓度和治疗的时间，在这些实验中，这提供了巨大的优势可变的，但有一定的限制（见下文）。所施加的浓度和温育时间在这个协议中仅建议，但是它们提供了初始实验的良好基础。
激光共聚焦显微镜实验要求断绝人洗涤步骤。这些步骤应该仔细地进行。不要直接转移液体到细胞。相反，使用侧或孔用于此目的的角。这可以最大限度地减少洗掉，失去粘附的细胞。此外，还建议在整个实验过程中，避免光线直射，因为它可以脱敏荧光样品（漂白作用）。保持经处理的样品在黑暗的地方或覆盖有在实验过程中的一块铝箔。基于以前的研究结果，我们注意到，在所施加的处理介质中的最终DMSO浓度是可以忽略的（0.1％（V / V）的DMSO中的10μM的处理介质），并且对结果没有任何影响， - 自由DMSO从而完全培养基是也适合作为阴性对照。
它是CLSM和FACS实验过程中使用精心调校仪器参数非常重要。这些参数需要重新校准的每个细胞类型，既分析之前。在CLSM实验中，SI共焦图像的gnal强度取决于以下参数：激光强度，检测器的增益和偏移，以及针孔的大小。当调整这些参数，使用最低的激光功率，以取得令人满意的图像，避免光漂白。设置成像参数来调整未染色的阴性对照细胞到接近零（ 图3B）的背景荧光。这些调整的参数图像处理的细胞，以避免假阳性结果。从514纳米和546纳米包含有关促性腺激素释放激素或促性腺激素释放激素-IR所需的信息处理后的细胞发出的附加信号。这些步骤需要在CLSM实验经验。在FACS实验中，创建一个标准的前向散射边散点图（直线光栅尺），并设置电压的情节中间以调整为主活细胞群。周围画活细胞的区域。创建直方图，设定横轴，以信道1（FL1-530纳米，对数标度），并设置先前定义的区域作为栅这个柱状图。设置FL1电压使未染色的阴性对照细胞的信号下10 1（ 图4A）。分析处理的细胞与这些调整的参数。
另外，为了检查细胞培养物的支原体状态不时是很重要的。各种测定可用于该目的。支原体阳性的情况下，丢弃电池和启动一个新的文化合作。建议在其中被优化以防止支原体培养基中使用抗生素混合物。的GnRH-FITC缀合物的施用浓度，和治疗的时间是在这些试验中的变量，但是施加低浓度和短的温育时间，可能会导致对荧光检测太弱信号。
当GnRH类似物成像并行的GnRH-IR，更高的GnRH-FITC浓度推荐（10μM是最优的）。其原因为较高浓度是短的温育时间（1小时），并作为比较对GnRH-FITC缀合物的标记抗体的相对高的荧光信号。另一方面，这两个荧光染料的排放量（514纳米和546纳米）之间的较小的重叠被发现，这仅在546纳米的发生，并且是从的GnRH-FITC缀合物的信号中导出。然而，Alexa的546和阱调整参数的相对较高的荧光信号可以减少这种影响，如在图3证实。另一种可能的解决方案，以避免重叠，是应用标具有相比FITC（如果CLSM技术参数允许此）不同的激发波长和/或更好的分离发射光谱的二级抗体。这种可能性在激光共聚焦显微镜法，使与促性腺激素释放激素-FITC结合物平行使用另购的荧光探针提供了巨大的优势。例如，可用于根据需要复染其它细胞器这些替代荧光探针。
的GnRH-FITC缀合物的施用浓度具有以下限制。的GnRH-FITC缀合物的最大浓度限值是根据它们的溶解度18。这些值的在PBS中于室温下：的GnRH-I：90微米;促性腺激素释放激素-II：40微米;促性腺激素释放激素-III：200微米。另一方面，在以前的实验中，我们假定这些的GnRH肽的摄取可以通过比人GnRH-1受体其他受体发生;此吸收似乎是在较高浓度更显著（以上10μM）18。的GnRH-FITC缀合物的检测下限是基于各种参数，但在理想的设置是为CLMS实验大约1微米。我们发现，流式细胞仪提供了比激光共聚焦显微镜更好的灵敏度。在理想的设置，促性腺激素释放激素-FITC结合物的定量限可能会低于1微米。检测或定量限可能在每一个实验中不同，因为它们依赖于细胞类型和培养时间。注意，通过FACS获得的数据比CLSM更可靠，因为其检测每个样品的细胞的数以千计并计算细胞的平均信号。然而，在该协议，流式细胞仪不提供有关的GnRH-FITC缀合物的细胞定位和GnRH的-1R的细胞表面表达的信息。基于这些考虑，我们的结论是，在CLSM和FACS实验有明显的优势，并且它们相互补充。另一方面，高内涵图像分析可以是一个有趣的和用于FACS和CLSM分析一个很好的选择。
综上所述，从这些实验中获得的数据证实，每三个的GnRH-FITC缀合物的可进入其中表达的细胞表面的GnRH-IR细胞。这些GnRH类似物在同一浓度相似定位的效力。然而，不同的罐的表面上的的GnRH-IR水平CER细胞是高度可变的。结果从流式细胞分析的数据计算出的允许的细胞系或GnRH类似物的比较。与此同时，通过共聚焦显微镜获得的图像可以揭示细胞表面的GnRH-IR表达的水平，并确认这些缀合物内在化到细胞中。基于这些结果，可以确认该引入实验包含用于基于GnRH的药物递送系统的调查实际和可变的方法，并提供用于进一步实验的良好基础。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EBC-1 | JCRB Cell Bank | JCRB0820 | Human lung squamous cell carcinoma |
| BxPC-3 | ATCC | CRL-1687 | Human pancreatic adenocarcinoma |
| Detroit-562 | ATCC | CCL-138 | Human pharyngeal carcinoma |
| RPMI-1640 Medium with L-glutamine | Lonza | BE12-702F | Culture medium for BxPC-3 cells |
| Eagle's Minimum Essential Medium | Lonza | BE12-611F | Culture medium for EBC-1 cells, and complemented with 0.1% sodium pyruvate for Detroit-562 cells |
| Fetal Bovine Serum | Euro Clone | ECS0180L | Complements the culture medium |
| MycoZap Plus-CL | Lonza | VZA-2012 | Complements the culture medium (antibiotics) |
| Standard Line Cell Culture Flasks | VWR | 10062-872 | Provide consistent, sterile growth environment for cells |
| Trypsin-EDTA Mixture | Lonza | BE17-161E | Remove attached cells |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Lonza | BE17-516F | Solvent |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | D8418-100ML | Solvent |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Thermo Fisher Scientific | 15250061 | Used to counting cells |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-I | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [D-Lys6(FITC)]-GnRH-II | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| [Lys8(FITC)]-GnRH-III | made by us | - | Purity ≥98% (HPLC) |
| glass bottom 8-well microscopic slide | Ibidi | 80826 | Use in CLSM experiment |
| Corning Costar cell culture plate, 12 well | Sigma-Aldrich | CLS3513-50EA | Use in FACS experiment |
| Fixing solution (10% neutral buffered formalin) | Bio-Optica | 01V60P | Fix adherent cells |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7906-10G | Prevent the nonspecific binding of the antibodies |
| GnRHR Antibody | Proteintech | 19950-1-AP | Immunocytochemistry reagent, bind to the human type-I GnRH receptors |
| Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A11035 | Immunocytochemistry reagent, bind to the primary antibody |
| Fluorescent probe solution (Draq5) | Thermo Fisher Scientific | 62254 | Counterstain nuclei |
| Fluoromount Aqueous Mounting Medium | Sigma-Aldrich | F4680-25ML | Use in CLSM experiment, preserving fluorescence |
| Inverted microscope | Elektro-Optika Ltd. | Alpha XDS-2T | Check the phenotype and confluency of cell cultures |
| Inverted confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM-710 | Use in CLSM experiment |
| Flow cytometer | BD Biosciences | BD FACSCalibur | Use in FACS experiment |
References
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