Summary
本発明者らは、細胞が細菌および多数の異なるストレスでチャレンジされた後の哺乳動物細胞におけるストレス顆粒形成の定性的および定量的分析のための方法を記載する。このプロトコルは、広範囲の宿主 - 細菌相互作用における細胞ストレス顆粒応答を調べるために適用することができる。
Abstract
細胞成分の蛍光イメージングは、宿主 - 病原体相互作用を調べるための有効なツールである。病原体は、細胞小器官の超微細構造、細胞骨格のネットワーク構成、ならびにストレス顆粒（SG）形成などの細胞プロセスを含む感染細胞の多くの異なる特徴に影響を及ぼし得る。どのように病原体が宿主プロセスを破壊するかの特徴付けは、病因の分野の重要かつ不可欠な部分である。様々な表現型が容易に目に見えるかもしれないが、病原体チャレンジによって誘発される細胞構造の定性的および定量的差異の正確な分析は、実験試料と対照試料との間に統計学的有意差を定義するために不可欠である。 SGの形成は、進化的に保存されたストレス応答であり、抗ウイルス応答をもたらし、ウイルス感染を用いて長く研究されてきた1 。 SG形成はまた、シグナル伝達カスケードに影響を及ぼし、他の未知のconseq2 。細菌病原体のようなウイルス以外の病原体に対するこのストレス応答の特徴付けは、現在、新たな研究領域3である 。今のところ、ウイルスの系においてさえも、SG形成の定量的および定性的分析はまだ日常的には用いられていない。ここで我々は、様々な外因性ストレスに応答してSGの形成に影響を与える、非感染細胞および細胞質細菌病原体に感染した細胞におけるSG形成を誘発および特徴付けするための簡単な方法を記載する。 SGの形成および組成の分析は、多数の異なるSGマーカーおよびオープンソース画像分析ツールであるICYのスポット検出器プラグインを使用することによって達成される。
Introduction
細胞レベルでの宿主 - 病原体相互作用の可視化は、病原性戦略への洞察を獲得し、主要な細胞経路を同定するための強力な方法である。事実、病原体は、自身の生存または増殖のための戦略として中央細胞プロセスを破壊するように進化しているので、病原体を重要な細胞標的または構造を特定するためのツールとして使用することができる。細胞成分の可視化は、蛍光標識された宿主タンパク質を組換え発現することによって達成することができる。これはリアルタイム分析を可能にするが、特異的に標識された宿主タンパク質を有する細胞株の生成は非常に面倒であり、望ましくない副作用をもたらし得る。複数の宿主因子を同時に分析することができ、特定の細胞型に限定されないため、特異的抗体を用いた細胞因子の検出がより便利である。欠点は、免疫蛍光分析が宿主細胞固定化を必要とするので、静的視野のみを捕捉できることであるイオン。しかしながら、免疫蛍光イメージングの重要な利点は、それが定性分析および定量分析の両方に容易に役立つことである。これは、次に、宿主 - 病原体相互作用への新しい洞察を提供するために統計的に有意な差異を得るために使用することができる。
蛍光画像解析プログラムは、3Dおよび4D解析を実行するための強力な解析ツールです。しかし、ソフトウェアの高コストとそのメンテナンスは、フリー・オープンソース・ソフトウェアに基づく方法をより広く魅力的にしています。バイオ分析ソフトウェアを使用した慎重な画像分析は、視覚分析を実証し、統計的有意性を割り当てるときに、所与の表現型の正確性に対する信頼性を高めるので有益である。これまで、SGは、個別のSG 4の手動識別を必要とする無料のImageJソフトウェアを使用して分析されていました。ここでは、bacの文脈における細胞SG形成の誘導および分析のためのプロトコルを提供するフリーオープンソースのバイオイメージ分析ソフトウェアICY（http://icy.bioimageanalysis.org）を使用して、腸内感染を検出した。バイオイメージ解析ソフトウェアには、SG解析に非常に適したスポット検出プログラムが組み込まれています。これにより、指定された関心領域（ROI）での自動検出プロセスの微調整が可能になります。これは、個々のSGの手動分析の必要性を克服し、サンプリングバイアスを除去する。
多くの環境ストレスは、直径0.2-5μmの相密度の高いサイトゾル、非膜構造であるSGの形成を誘発する5,6 。この細胞応答は、酵母、植物および哺乳動物において進化的に保存され、全身タンパク質翻訳が阻害される場合に起こる。これは、失活した翻訳開始複合体のSGへの凝集を含み、翻訳的に不活性なmRNAの保持場所と考えられ、細胞mRNAのサブセットの選択的翻訳を可能にする。ストレスを除去すると、SGが溶解し、タンパク質合成の全体的な速度が再開する。 SGは、翻訳伸長開始因子、RNA代謝に関与するタンパク質、RNA結合タンパク質、ならびに宿主細胞シグナリング2に関与するスカフォールドタンパク質および因子からなるが、正確な組成は適用されるストレスに依存して変化し得る。 SG形成を誘発する環境因子には、アミノ酸飢餓、UV照射、熱ショック、浸透圧ショック、小胞体ストレス、低酸素症およびウイルス感染が含まれる2,7,8。ウイルスがどのように誘導され、SGの形成を破壊するかについての理解が進んだが、細菌、真菌、原生動物病原体などの他の病原体がこの細胞ストレス応答にどのように影響するかについてはほとんど知られていない。
シゲIIフレクスナーは、ヒトのグラム陰性通性細胞質ゾル病原体であり、重度の下痢またはシゲラ症の原因物質である。シゲロシスは重大な公衆衛生上の負担であり、5歳未満の小児では毎年28,000人の死亡を引き起こす。 フレックスネリは結腸上皮に感染し、宿主の細胞骨格成分11,12をハイジャックすることにより細胞間拡散を起こす 。上皮の感染は、サイトゾル内でのフレクスネリ（ flexneri）の複製を支持するが、感染マクロファージは、熱中症と呼ばれる炎症性細胞死プロセスによって死ぬ。感染は、熱、酸化ストレスおよび組織破壊を伴う好中球および重度の炎症の大規模な動員につながる。したがって、感染細胞は、ゴルジ破壊、遺伝毒性ストレスおよび細胞骨格再編成などの感染によって誘導される内部ストレスを受ける炎症過程に起因する環境ストレスにさらされる。
多数のSGマーカーを用いて環境ストレスに応答する細胞の能力に対するS.フレックスネリ感染の特徴付けは、感染がSG組成3の定性的および定量的差異をもたらすことを実証した。しかしながら、他の細菌病原体についてはほとんど知られていない。ここでは、異なる環境ストレスを有する細胞のストレス、SG成分の標識、および感染の文脈におけるSGの形成および組成の定性的および定量的分析を含む、細胞質病原菌S.フレックスネリによる宿主細胞の感染のための方法論を説明する。および非感染細胞が含まれる。この方法は、他の細菌病原体に広く適用可能である。さらに、SG形成の画像分析は、ウイルスまたは他の病原体による感染のために使用され得る。それはSGを分析するために使用することができます外因性のストレスに応答したSG形成に対する感染の影響または感染の効果。
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Protocol
1.細菌および宿主細胞の調製
- 実験条件ごとに1ウェルをカウントして、滅菌ピンセットを用いて、それぞれ24ウェルプレートまたは12ウェルプレートの12または14 mmガラスカバースリップを移す。組織培養フード内でUV処理により15分間滅菌する。
注：外因性ストレスによる細菌誘発およびSG誘導のための対照ウェルを含む。 - 12mmのカバースリップを有する24ウェルプレートについては、カバースリップ上に1×10 5個の哺乳動物細胞（ 例えば、 HeLa細胞）を植え付ける;滅菌ピペットチップでカバースリップを押し下げます。細胞を各細胞タイプに適した培地で5％CO 2組織培養インキュベーター内で37℃で一晩接着させます。
注：細胞のコンフルエンスが翌日に40〜60％になるようにプレート細胞を接種する。- HeLa細胞の場合、非必須アミノ酸（NEAA）および10％の胎生胎仔血清（FCS）を含むダルベッコ改変イーグル培地（DMEM）中でインキュベートする。56℃の水浴中で30分間加熱することによりFCSを解読し、15分後に血清を1回旋回させる。
- 細菌を繁殖させるために、滅菌ピペットチップを使用して、-80℃冷凍庫に保存された細菌グリセロールストック（20％グリセロール）から少量を除去し、それを標識プレートに置きます。バクテリアをプレートの約10％に広げるために滅菌ループを使用してください。新しい無菌ループを使用し、スミアを通してドラッグして、プレートの半分の長さの3本の平行線を作成します。これらの線を通って残りのプレートを覆っている。 37℃でプレートO / Nをインキュベートする。
- 新鮮な縞模様のプレートから単一の細菌コロニー（ 例えば、フレクスネリ （ S. flexneri ））を選択する。 1週間以上経過した細菌コロニーでの作業は避けてください。
- S. flexneri株M90Tについては、15mLのチューブ内で、新たに縞状になったTryptic Soy Agar-0.1％Congo赤寒天プレートからの赤色コロニーを8mLのTryptic Soyブロスに接種する。蓋をしっかり締め、30分で222 rpm O / Nで振とうする。6; C。
注意：ビルレンスプラスミドを失っており、非感染性であるため、大きな白いコロニーを使用しないでください。
宿主細胞の細菌チャレンジ
- 感染力を最大にするために細菌を準備する。
- S.フレックスネリについては、150μLのO / N培養液を8mLのトリプシン・ソイ寒天培地に加え、37℃で222rpmで37℃で後期指数期（約2時間）振とうしてインキュベートし、ビルレンス遺伝子発現を誘導し、感染を増強する。
- 培養物が0.6~0.9の光学濃度（600nmで測定）である場合、培養物1mLを1.5mLチューブに移す。 OD 600 = 1で感染培地（NEAAを含むDMEM、FCSを欠く）中に再懸濁する。したがって、OD 600が0.85である場合、850μLで再懸濁する。
注： フレックスネリ（flexneri）については 、OD 600 = 1で、1mLあたり8×10 8細菌が存在する8mL培地で培養した。 20の多重感染（MOI）が適切です。他の病原体については、OD 600における1mLあたりの細菌数および適切なMOIを経験的に決定する必要がある。
- 培養物が0.6~0.9の光学濃度（600nmで測定）である場合、培養物1mLを1.5mLチューブに移す。 OD 600 = 1で感染培地（NEAAを含むDMEM、FCSを欠く）中に再懸濁する。したがって、OD 600が0.85である場合、850μLで再懸濁する。
- 細菌 - 宿主相互作用を高めるために、ポリ-L-リシン（PLL）で細菌をコートする。
注： フレックスネリの PLL処理はSGダイナミクスに影響を与えませんでした。その他の病原体は、PLL処理の順応性を評価する必要があります。- PLLで細菌をコートするには、1mLの細菌培養液を8,000 xgで2分間遠心分離し、ペレットをリン酸緩衝生理食塩水（PBS）中の10μg/ mL PLLにOD 600 = 1で再懸濁する。
- 12ウェルプレート内のウェルなどの小さなディッシュに細菌溶液を添加し、プレートシェーカー上で穏やかに攪拌しながら10分間室温（約20℃）でインキュベートする。
- ペレットバクテリアを8,000 xgで2分間、余分なPLLを除去する。ペレットを1mLのPBSに再懸濁し、dこの洗浄工程を2回繰り返す。最終洗浄後、OD 600 = 1で感染培地に再懸濁する。
注：ここで、 フレクスネリ菌の感染培地は、20mM HEPES w / o FCSを含む宿主細胞培地である。
- S.フレックスネリについては、150μLのO / N培養液を8mLのトリプシン・ソイ寒天培地に加え、37℃で222rpmで37℃で後期指数期（約2時間）振とうしてインキュベートし、ビルレンス遺伝子発現を誘導し、感染を増強する。
- 細菌のチャレンジのために細胞を準備する。
- 吸引ポンプを使用して哺乳動物HeLa細胞から培地を除去する。 500μLのRT HeLa細胞培地を添加して細胞を洗浄し、吸引し、吸引ポンプを用いて培地を除去し、500μLRTの適切な感染培地（ 例えば 、20mM HEPES w / o FCSを含む宿主細胞培地）と交換する。
- 注：すべての洗浄工程では、素早く作業し、細胞が乾燥しないように一度に4枚までカバースリップを処理してください。
- チャレンジでは、HeLa細胞に細菌を感染させ、細胞の20〜50％を感染させました。
注：各細菌種について、適切な時間およびMOIを決定する必要がある。一般的に、良いスタートは37分30分です10のMOIで℃。- フレックスネリ（flexneri）については、2つの方法（ステップ2.3.1.1または2.3.1.2）のうちの1つを用いてHeLa細胞にチャレンジする。
- 13000×gで10分間細胞に非PLL処理細菌（20μLのOD 600 =500μL培地中24ウェルプレートの1ウェル）をスピンさせる。
- RTで15分間、PLLコーティングされた細菌（OD 600の15μL= 1ウェル/ウェルの24ウェルプレート500μL）を添加して、細菌を細胞に定着させる。
- 沈降細菌を含む細胞を37℃の組織培養インキュベーターに30分間入れて感染させる。
注：短時間の間は、組織培養インキュベーターの代わりにプレートを37℃の水浴に15分間入れてS.フレックスネリ感染を同期させます。
- フレックスネリ（flexneri）については、2つの方法（ステップ2.3.1.1または2.3.1.2）のうちの1つを用いてHeLa細胞にチャレンジする。
- 細胞を洗浄して感染を止める。
- 細胞を洗浄し、過剰の細菌を除去するために、吸引ポンプを用いて培地を除去し、1mL（37℃）HeLa培養培地（DMEM、10％FCS、NEAA）で予め温めた。培地を渦巻き、新しい培地を除去して交換する。 2回繰り返し、細胞上に新鮮な培地を残す。
- S.フレックスネリまたは他の細胞内細菌については、HeLa細胞および洗浄液の感染後、培地を、50μg/ mLのゲンタマイシンを含む標準組織培養培地で置き換えて、細胞外細菌を殺し、さらなる細胞侵襲を防ぐ。
注：細胞外細菌の培地に抗生物質を添加しないでください。
- S.フレックスネリまたは他の細胞内細菌については、HeLa細胞および洗浄液の感染後、培地を、50μg/ mLのゲンタマイシンを含む標準組織培養培地で置き換えて、細胞外細菌を殺し、さらなる細胞侵襲を防ぐ。
- 細胞を洗浄し、過剰の細菌を除去するために、吸引ポンプを用いて培地を除去し、1mL（37℃）HeLa培養培地（DMEM、10％FCS、NEAA）で予め温めた。培地を渦巻き、新しい培地を除去して交換する。 2回繰り返し、細胞上に新鮮な培地を残す。
- 組織培養インキュベーター内で細菌を細胞と所望の時間インキュベートする。
注： フレックスネリ（flexneri ）については、細胞の種類によっては6時間もの感染があります。 HeLa細胞では、外因性のストレスを加えてSGの形成を誘導する前に、感染を1.5〜2時間進行させます。 赤痢菌が細胞間に広がるCaco-2感染については、外因性ストレスを加える前に30分〜6時間感染させる。 Ceこの時点で、細菌感染の結果としてSGの形成を評価する外因性のストレスを加えることなくこの時点で固定することができる（その場合、第4節に進む）。
3.外因性ストレス因子の添加によるストレス顆粒形成の誘導
- 吸引ポンプを使用して感染したHeLa細胞と感染していないHeLa細胞から培地を除去し、培地をストレッサーの有無にかかわらず適切な培地500μLに交換してインキュベートする。
注：ストレス誘導条件には以下が含まれます（下記参照）。さらなる治療については、Kedersha et al 。 13 。- 熱ショック処理のために、20mMのHEPESを含む通常の培地を使用し、プレートを44℃の水浴に30分間入れる。
- クロトリマゾール（ミトコンドリアストレス誘導）処理のためには、20μMのクロトリマゾールを含むFCSを含まない標準培地を用い、組織培養インキュベータで1時間インキュベートする。
注：1回分のアリコートを20m保存するMクロトリマゾールストックをジメチルスルホキシド（DMSO）中、-20℃で最大4ヶ月間保存する。コントロール細胞にはDMSOビヒクルを使用する。 - ヒ酸（酸化ストレスを誘導する）処理のために、0.5μM亜ヒ酸ナトリウムを含む標準培地を用い、組織培養インキュベーター中で1時間インキュベートする。
注：-20℃で0.5mM亜ヒ酸ナトリウムの1回分のアリコートを6ヶ月間保存する。
注意：クロトリマゾールと亜ヒ酸は環境に有害で危険であり、適切に処分する必要があります。 - Des-Methyl Des-Amino（DMDA） - パパミン処理（真核生物の翻訳開始を阻害する）のために、50〜200nM DMDA-パテミンを含む標準培地を用い、組織培養インキュベーターで1時間インキュベートする。
注：DMDA-pateamineは-80℃で保管してください。試薬を凍結融解を避けるために少量ずつ分注する。
4.ストレス顆粒形成の固定化および免疫蛍光分析
注：コントロールと実験的カバースリップを同時に使用して、その後のステップで画像解析に影響を与える可能性のある染色の違いを避けることができます。対照試料には、SG誘発処理を伴うおよび伴わない感染および感染を誘導したSGが処置を誘導するまたは伴わない試料が含まれる。
- 吸引ポンプを使用して培地を完全に除去し、0.5mLのRT 4％パラホルムアルデヒド（PFA）をPBSに加えてサンプルを固定する。 RTで30分間インキュベートする。
注意：PFAは、ハンドラと環境に有害です。取扱い者を保護するための適切な処置を行い、化学廃棄物を処分する。
注：代わりに、15分間固定し、-20℃で予冷したメタノールで10分間置換して、SGマーカーのより多くの細胞質局在を保持する。 - ピペットでPFAを取り出し、液体を適切な廃棄容器に入れてください。 Tris-Buffered生理食塩水（TBS：25 mM Tris、pH 7.3; 15 mM NaCl）1 mLでカバースリップを洗浄する。穏やかに振盪しながら2分間カバースリップをインキュベートする。洗浄中のプレートシェーカー上で。
- 吸引ポンプを用いてTBSを完全に除去し、TBS中の500μLの0.3％Triton-X100を10分間加えて細胞を透過させる。
- 吸引ポンプで透過性溶液を除去する。 1mLのTBSと交換し、プレートを静かに渦巻き、TBSを吸引除去し、1mLのブロッキング溶液（TBS中5％FCS）を室温で1時間加える。
- TBS中の5％FCS中の一次抗体溶液（1：300希釈）を調製する。 12mmのカバースリップにつき50μLを計算し、すべてのカバースリップを1つのバッチで十分に作ります。
注：使用される一般的な一次抗体は、G3BP1、eIF3b、およびTIA1を標的とする。 - 50μLの一次抗体を、ベンチまたはチャンバーにしっかりとテープされたプラスチックパラフィン膜（パラフィルム）上に混合する。
注：標準的なSGマーカーの一覧は表の表に記載されていますが、SGの組成は適用されるストレスによって異なる場合があります。他のSGマーカーはKedersha et al。 13 フレクスネリ感染症に対する多数のSGマーカーの期待される結果を表1に示す 。 - ピンセットでカバースリップを拾い、カバースリップの端を組織の上に置いて、ピンセットをしばらく外して余分な液体を除去し、静かに顔の上に滴下する。カバースリップをRTで1.5時間または湿ったチャンバー内で4℃で一晩インキュベートする。
注：湿ったチャンバーを準備するには、あらかじめ湿らせた組織を、プラスチックのパラフィルムで裏打ちされたしっかりと閉じたチャンバーの端に沿って置きます。 - 1mLのTBSで満たされた新しい24ウェルプレートのウェルにピンセットで各カバースリップを移す。プレートシェーカー上で穏やかに振とうしながら5分間インキュベートする。吸引ポンプを用いて各ウェルのTBSを吸引除去し、1mLのTBSと交換し、プレートシェーカー上に5分間戻す。もう一度洗ってください。
注：余分な液体を組織で取り除き、表面を水で洗浄することによってパラフィルムを再利用します。パラフィンフィルムが使用前に完全に乾燥していることを確認する次の染色工程のためにそれをg。 - 二次抗体溶液をTBS（希釈1：500-1：2000）に調製する。核および細菌を染色するために、2μg/ mL DAPIを混合物に加える。アクチンを染色するには、蛍光ファロイジンを加える。 50μLの二次抗体混合物をプラスチックパラフィン膜上にピペットで移す。
注：G3BP1（ヤギ抗体）を使用する場合、異なるSGマーカーの共局在研究のために、高度に精製された交差吸収ロバ二次抗体の使用を推奨します。非重複スペクトルを有する蛍光標識二次抗体を選択する。 eIF3bは明らかに細胞の細胞質を染色し、したがって細胞を描写するのに良いマーカーである。アクチン染色は、細胞間接触部位および細菌侵入領域で細胞を描写するのにさらに役立つ。 - ピンセットでカバースリップをピックアップし、カバースリップの端を組織上に置いて、ピンセットを短時間離して余分な液体を除去する。静かにカバーガラスを下に向けて滴下し、カバースリップをインキュベートする暗所で室温で1時間インキュベートする。
- ピンセットを使用して、新鮮な1mLのPBSで満たされた24ウェルプレートにカバースリップを戻します。カバースリップがPBSによって完全に覆われていることを確認します。穏やかに振とうしながら各回5分間3回細胞を洗浄する。
注意：二次抗体の発蛍光団は光感受性であるため、洗浄の間にプレートを光から保護するためにカバーの下に置いてください。 - 簡単に塩を除去するために脱イオン水にカバースリップを浸し、組織の端から乾燥し、ガラススライド上の蛍光マウント媒体の5μL上にカバースリップをマウントする。ネイルポリッシュを使用してイメージングする前に、カバースリップをシールします。短期間（週）の場合は4℃、長期（月）の場合は-20℃で保存してください。
注記：シールするときに気泡を避けると、画質が損なわれます。
5.蛍光イメージング
注：セットアップの最適化については、顕微鏡のユーザーマニュアルを参照してください。
- 共焦点顕微鏡を使用して40または63Xの油浸レンズのいずれかを使用して画像を取得します。画像取得に必要な蛍光チャンネルを選択します。複数の蛍光チャンネルを使用する場合は、連続取得モードを選択してください。
注：次のサンプルで過度露出を避けるためにSGが最も強く誘導された実験サンプルから始めます。セルの深さ全体に渡って過剰露出SGを持たないようにしてください。- 画像解析の精度を保証するために、顕微鏡の設定内でビットサイズを12以上に設定します。
- セルの深さ全体をカバーするようにイメージスタックを設定します。さまざまなチャンネルをチェックインし、さまざまなSGマーカーをチェックして、すべての範囲が含まれていることを確認します。スタックの先頭をセルのベースに、スタックの最上部をセルの上部の高さに設定し、SGマーカーがそれ以上観察されないようにします。
- スタックを取得します。すべての画像でスタックの高さを同じにします。
注：しないでください後続の比較に使用される対照試料と実験試料との間で取得設定を変更する。
6.画像解析
注：ここでは、フリーウェアICYを使用した折り畳みスタックのSG解析について説明します。 3D再構成の画像解析は、他の専用ソフトウェアを使用して行うこともできます。 SG検出は、このプロトコル（http://icy.bioimageanalysis.org/protocol/Stress_granule_detection_in_fluorescence_imagingで入手可能）で確立された完全に自動化されたワークフローを介して行うことができる。このプロトコルを使用するには、細胞の中心を見つけるためにソフトウェアがDNA染色で染色される必要があり、細胞縁はソフトウェアの細胞質マーカー（eIF3bなど）またはアクチン染色のいずれかで標識する必要がありますセル境界を識別する。自動ワークフローを使用すると、手作業で派生した結果を検証したり、セル境界が高い信頼度で検出された場合に分析のために直接使用することができます。細胞の密度および細胞境界を検出するために使用されるマーカーに依存する。
- ImageJまたはFijiを使用して、イメージスタックを折りたたみ（Image> Stacks> Z projection）、.tiffファイルとして保存します。
注：イメージ分析ソフトウェアが結果を元のイメージのサイトにリンクするので、各イメージ用に新しいフォルダを作成します。 - コントロールと実験的な.tiff画像を画像解析プラットフォームにロードします（ファイル>開く）。シーケンスウィンドウに移動します。 "ルックアップテーブル"をチャンネルパラメータにスクロールダウンします。
- すべてのチャンネルタブのチェックボックスをクリックして、すべてのチャンネルを無効にします。チャネル0をクリックし、上記のカラーバーをクリックして優先カラーを選択します。必要に応じてチャンネルの輝度を上げて、輝度フィールドのラインをクリックして移動してすべての構造を表示します。すべてのチャンネルでこれを繰り返します。
注：サンプル分析でバイアスを最小限に抑えるために、特定のタスクに必要でないチャネルを無効にします。 - スクロール[キャンバス]タブ内で、ズームタブを調整して、フィールドあたり約10個のセルにズームインします。
- ポリゴン機能ツール（上部バーにあります）を使用して、画像内のセルのセル境界を区切ります。細胞境界の描写（ 例えば、 eIF3b）のために、アクチン染色または細胞質ゾルマーカーを使用する。
- [ファイルとROI]ツール内のポリゴン機能をクリックします。セルをクリックして描画を開始し、セルの境界線を繰り返しクリックしてアンカーを作成して線を延長します。 ROIを終了するには、[ファイルとROI]ツール内のポリゴン機能を再度クリックします。
注：感染している描写された細胞の亜集団を特定します。サンプルは、感染細胞と非感染細胞の混合物で構成されています。細菌を同定するために、DAPI染色または蛍光細菌（GFP発現細菌など）を使用する。すべての細菌が見えるように強度を上げてください。 - ROIの名前を付けるには、右側のROIウィンドウに移動し、cli画像中の関心のある細胞上のck。 ROIタブの対応するROIが強調表示されます。 ROI名をダブルクリックして名前を変更します（ 例：感染細胞＃1）。
注：感染した細胞と感染していない細胞の両方を分析するために1つのイメージを使用する場合は、2つの別々のフォルダにイメージを保存し、感染した細胞と感染していない細胞を別々に描き、分析を容易にする2つの異なるスプレッドシート後で。
- [ファイルとROI]ツール内のポリゴン機能をクリックします。セルをクリックして描画を開始し、セルの境界線を繰り返しクリックしてアンカーを作成して線を延長します。 ROIを終了するには、[ファイルとROI]ツール内のポリゴン機能を再度クリックします。
- [検出とトラッキング]タブ（上部バー）でスポット検出器アプリケーションを開きます。 [入力]タブで、現在の画像が選択されます。何も変更しないでください。 [Pre-Processing]タブで、解析するチャネルを選択します。
注：任意の時点で分析できるチャンネルは1つだけです。バッチ分析は、満足のいく結果を得るためにパラメータがチェックされている完全自動分析シーケンスを使用する場合は、ここで選択することができます。- [Detector]タブで、[De暗い背景の上に明るいスポットを検出する」適切なスケールと感度を選択します。コントロールと実験サンプルの両方で異なる設定とクロスチェックのスポット検出をテストします。
注：2,048×2,048の分解能と0.12μm2のピクセルサイズの画像では、感度が25〜100のレベル2のスレッショルドが一般的に適切ですが、各SGマーカーは経験的にテストする必要があります。未処理対照サンプルではスポットが検出されないようにスポット検出を設定するが、SGを有する実験サンプルでは、すべての小さなSGおよびSGをカウントする。 - [ROI]タブで、[推奨ROI from Sequence]を選択します。 [フィルタリング]タブで、[フィルタリングなし]を選択します。 [出力]タブで、適切な出力を選択します。
注：特定のファイルを有効にするを選択すると、さまざまな検出条件または異なるチャネルを保存するのに役立ちます。 ROIと検出を使用してバイナリイメージと元のイメージをエクスポートすることを選択すると、hel品質管理分析のために十分です。 - [ROIとしてレンダリングされた以前のスポットを削除する]を選択します。 「ファイルが選択されていません」ボタンをクリックして、ファイルを保存するフォルダを選択します。 [表示]タブで、目的のオプションを選択します。[検出を開始]をクリックします。
注：選択した名前と場所のフォルダが、エクスポートされたイメージングオプションを含むフォルダに作成されます。これらの画像は、テストされた新しい条件ごとに上書きされます。イメージを保持するには、フォルダの名前を変更して新しいフォルダを作成するか、イメージを保存フォルダから新しいフォルダに転送します。画像の品質管理のためには、表示検出マーク、ROIの検出数およびROI番号および名前を選択することが有用である。
- [Detector]タブで、[De暗い背景の上に明るいスポットを検出する」適切なスケールと感度を選択します。コントロールと実験サンプルの両方で異なる設定とクロスチェックのスポット検出をテストします。
- テストされた各画像または条件ごとに生成されたスプレッドシートを使用して、さまざまなパラメータのデータを統合して保存します。
注：解析するパラメータには、ROIあたりのSG数、SG表面面積、SG最大値イム、平均および最小強度。 - データを転送し、統計的有意性の分析、グラフ化、および決定が可能な分析プログラムを使用して分析する。
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Representative Results
この原稿で説明されているプロトコルを説明し、実証するために、本発明者らは、サイトゾル病原菌であるフレクスネリ（flexneri）に感染したか否かにかかわらず、HeLa細胞におけるクロトリマゾール誘発SGのイメージを特徴付けた。手順の概要は図1に示されており、コンゴーレッドプレートにストリーミングされた有毒で無害なフレックスネリ 、細菌の調製、感染、環境ストレスの添加、サンプルの固定と染色、サンプルのイメージングと定量、画像分析。 SG形成を誘発するために多数の異なるストレスを使用することができ、様々なSGマーカーが呼び掛けに利用可能である。 eIF3bは、細胞の細胞質区画を明らかに染色する標準的なSGマーカーであり、細胞縁を同定するために使用することができる。 G3BP1は、バックグラウンド染色なしでSGに凝集する広く使用されるSGマーカーである（ 図 2A、B D ）。細胞は、共焦点顕微鏡で最良に撮像され、細胞深度全体をカバーするスタックが、画像解析フリーウェアICYにロードされる（ 図 2A〜C）。感染細胞をよりよく同定し、後の分析のために感染細胞群または非感染群のいずれかに細胞を入れるためには、核酸染色の強度を高めることが有用である（ 図 2D ）。イメージング解析ソフトウェア内で、スポット検出器を使用して、指定されたROI（ 図 2E）のそれぞれ内のSGを識別し、識別されたすべてのSG（ 図 2F ）を表示するバイナリイメージを生成する。
SG分析は、分析された各SGマーカーに合わせて調整する必要があり、適切な分析設定を慎重に選択する必要があります。 SG maを中心に検出されたスポットのサイズ要件を変更したり、検出パラメータの感度を変更したりすると、 図3A -Cに示すように、結果が変化することになります 。スケールの選択（スケールは追加できますが、1〜3）はピクセルサイズに基づいているため、より高いスケールでは、小さなSGはカウントされず、SGの数は減少します（ 図 3C ）。感度は1から100まで測定され、100が最も感度が高い。感度を増加させることにより、検出されたSGの数が増加した（ 図 3C ）。したがって、誤った陽性および偽陰性を最小限に抑えるために、正しい設定を見つける必要があります。これは、各設定で得られたビジュアルを慎重に分析することによって最も効果的です。 G3BP1については、100の感度（2〜100、赤で強調表示）を有する2の尺度が最良の結果を与えた。より低い感度（50または25）を有する2のスケールは、SGはカウントされません（オレンジ色の矢印を参照）。同様に、3のスケールは小さなSGを残していないが、1のスケールはオーバーサンプリングした。重要なのは、大規模なSGのみに焦点を当てるために追加のスケールを追加することができます（これが正当なものである場合）。 eIF3bについては、感度が55（2〜55）の2のスケールはeIF3b（赤で強調表示）で最良の結果を示しましたが、赤い矢印はそれぞれ2〜50および2〜55のスケールでアンダーサンプリングまたはオーバーサンプリングを示します。
SG分析のパラメータが適切に設定されると、データをさまざまな方法で分析できます（ 図4 ）。スポット検出器は、感染していない細胞と感染した細胞を比較できるように、各ROI内で検出されたSGの数を示します（ 図 4A ）。同様に、サイズ（この場合はピクセル数）が与えられ、そこから表面積を計算することができる（ 図 4B ）。周波数分布plotsは、異なる細胞集団で見出されるSGのサイズのシフトを強調するためにも有用である。ここでは、 S.フレックスネリ感染細胞における大きなSGの完全な欠如、ならびに分布における明確なシフトがより明確になる（ 図 4C ）。さらに、強度（ここでは最小強度と最大強度）は、分析されるSGの品質に関する情報を提供します。 S.フレックスネリ感染細胞では、SGsは有意により低い強度である。これらの分析は、細胞がS.フレックスネリ（flexneri）の有無にかかわらず感染した場合の外因性ストレスに応答して形成されるSGの定性的および定量的性質の両方に関する統計的に関連する情報を提供する。
図1 ： フレックスネリ（S. Flexneri）細胞を感染させるための実験手順の概要感染の影響を分析するSGの形成。コンゴ - 赤色コロニーおよび非毒性コンゴ - 赤色 - ネガティブコロニーを採取し、トリプシン大豆ブロス中でO / N栽培する。一晩の培養物を後期指数期に継代培養し、細菌をPLLでコーティングして接着を促進する。 12ウェルプレートのガラスカバースリップ上で増殖させた宿主細胞を細菌に30分間感染させる。コントロール細胞は感染していません。細胞を洗浄し、ストレス誘導物質で処理して、培地をストレス含有培地で置き換えるか、または細胞を熱などのストレス条件にかけることによってSG形成を誘導する。次いで、細胞を固定し、透過性にし、免疫蛍光SG特異的マーカーで染色し、共焦点顕微鏡法を用いて画像化する。 Z投影はImageJを使用して作成され、画像解析ソフトウェアのスポット検出器を使用して解析されます。次に、データを分析する。 ラージを表示するにはここをクリックしてくださいこの図の
図2 ：Clotrimazoleを1時間添加する1.5時間前にS.フレックスネリに感染したHeLa細胞のスポット検出器分析。 A。 SGマーカーeIF3bおよびG3BP1、DAPIおよびアクチンで染色された細胞を示すz-投影の免疫蛍光画像。 B。 （A）と同じイメージであるが、細胞境界を描写するためにeIF3bの使用を強調するアクチン染色はない。 C。スポット検出器モジュールを用いた画像分析ソフトウェアのスクリーンショット。 D。異なるチャネルを用いて見られるように、感染細胞および非感染細胞のゲーティング。全ての細菌を見るために、強度が増加する。細胞内に1つ以上の細菌が存在する細胞は、赤い星で標識される。 E。スポットdetecの出力ROI名、スポットの数およびその位置を示す、個々のROIのトータル分析。 F。 ROIで検出されたスポットの画像。スケールバー=30μm。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
図3 ：異なるSGマーカーによるSGの検出のためのスポット検出器の異なるスケールおよび感度設定の比較。 A。 S. flexneriを感染させたHeLa細胞をDAPIおよびSGマーカーG3BP1で染色し、異なるスケール（ピクセルサイズカットオフ、1-3）および感度（1-100）で分析した。異なるスケールで分析された非感染細胞および感染細胞におけるSG数のグラフ表示
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図4 ： S. Flexneriに感染したクロトリマゾール処置HeLa細胞から得られたスポット検出器生成SGデータの分析。 A。感染したHeLa細胞および感染していないHeLa細胞の細胞あたりのG3BP1 SGの数。 B。感染細胞および非感染細胞におけるG3BP1-SGの表面積およびその分布頻度（ C ）。 D。 G3BP1-SGの最小強度値と最大強度値（任意）。値には平均誤差が含まれます。選択された統計的分析は、左側のウィルコクソン順位和検定p値および右側の分散F検定を使用して明瞭にするために含めた。 * = <0.05、** = <0.01、*** = <0.001、ns =有意ではない。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
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Discussion
本明細書に概説されたプロトコルは、外因性ストレスの存在下または非存在下で、非感染細胞および細胞質病原体S.フレクスナーネに感染した細胞におけるSGの誘導、局在化および分析を記載する。フリーイメージングソフトウェアを使用することにより、このプロトコルにより、SG形成の正確な定性および定量分析が可能となり、与えられた表現型の差異を同定および統計的に取り扱うことができます。
感染、SG誘導および画像化のためのプロトコルにはいくつかの重要なステップがあります。感染のためには、ここで概説したような侵襲のような宿主細胞との細菌相互作用が可能な限り同調することが重要である。これは、感染プロセスの初期に細菌チャレンジの影響を調べる際に特に重要です。私たちは以前に、 フレックスネリ感染後のeIF3b局在化などのいくつかの表現型が、野生型の初期に摂動されることを示した他の表現型、例えばG3BP1含有SGの凝集は、後の時点3でより影響を受けるが、 S.フレックスネリのチャレンジ。したがって、細菌チャレンジの時間的効果を正確に記述するために、感染の同期化が推奨される。注目すべきことに、SG形成を分析するためには、細胞は指数増殖期でなければならず、従ってストレス添加時の細胞密度も重要なパラメータである。また、非コンフルエント細胞感染モデルに対するSG分析を制限する。もう1つの重要な側面は、イメージングのためのサンプルの処理中および画像取得中の両方のコントロールサンプルおよび実験サンプルの共処理である。免疫蛍光処理のためには、同一の時間および同一条件（ すなわち RT 対 4 ℃ ）で同じ抗体希釈液で染色し、同様に洗浄段階で各カバースリップを処理するように注意しなければならない。マウントoカバースリップ。これは、定性的および定量的に分析できる同等の免疫蛍光染色を確実にする。装着媒体の違いは、画像取得中の試料の漂白に大きな影響を及ぼし、従って一定に保たれるべきである。同様に、分析において比較されるべき全てのサンプルの画像取得は、レーザー強度又はサンプル設定から生じる差異を最小にするために、同じ設定で1つの座席内で実行されるべきである。
外因性のストレスを使用する場合、試薬を適切に保管し、頻繁に新しい作業ストックを作ることが重要です。長期間（例えば、クロトリマゾンの4ヶ月超）、薬物の効力が低下し、SG形成に影響を及ぼす。試薬は、細胞に添加する直前に培地に添加する必要があります。対照細胞におけるSG形成の減少が観察されるか、またはSGの凝集が異常であると思われる場合、試薬はそれらのACについて試験されるべきである新しい株式が作られなければなりません。
1つの制限は、スポット検出器を使用するSG識別が、あまりにも多くのバックグラウンド蛍光が存在する場合、信頼性が低くなることである。これは多くのSGマーカーでは問題ではありませんが、SG誘導性および非誘導性の両方の条件下で明確なサイトゾルマーカーであるeIF3bのようなものは、 図3に示すように解析が困難です。さらに、スケールおよび感度は、各SGマーカーについて経験的に決定される必要がある。もう1つの制限は、画像解析ソフトウェアによる解析が2D画像に最も適しているため、光学スライスや折りたたまれたスタックでうまくいきますが、結果として3D情報が失われることです。したがって、z射影の分析は、SGのサイズを過大評価し、SGの数を過小評価する傾向があります。特定の表現型に必要と思われる場合には、より正確な空間的特徴付けを与えるために、SGの3D解析をImarisで行うことができる。 SGのキャラクタリゼーションは、画像分析ソフトウェアの自動スポット検出器を使用して迅速かつ標準化された方法で実行できます。対照的に、以前に実行されたようにSGを識別して描写する手動の方法は、解析をより偏った状態にしておき、かなり時間がかかる。スポット検出器を使用するSG分析はまた、異なる感度およびサイズ閾値を選択することによって小さなSG凝集物を包含または排除するように調整することができ、それによってSG形成の異なる側面を評価する際の柔軟性を可能にする。 SG分析は、確立された自動ワークフロー3を使用して完全に自動化された方法で実行することもできます。このワークフローでは、細胞の中心がDAPI染色で同定され、プログラムは細胞質染色（eIF3bなど）またはアクチンのいずれかに基づいて細胞境界を描写するために可撓性球体を外側に成長させる。それと同時に、分析のために個々の細胞を手動で描写することは、細胞がクラスタで増殖し、細胞境界が自動化されたプログラムが明確に描写することが困難な場合に有利であり得る。このような状況では、手動でセル境界を定義することで、偽陽性値または陰性値を排除できます。
このプロトコルは、他のSG誘導条件およびウイルス、細菌、酵母および原生動物を含む他の病原体に適応させることができる。特に興味深いのは、 リケッチア種、 フランシラ・トラレンシス （ Francisella tularensis） 、 ブルクホルディア・シュード マーレ （ Burkholdieria pseudomallei）およびリステリア種（ Listeria spp。）などの他のサイトゾル病原体である。各感染因子、場合によっては異なる細胞株について、感染プロトコールを適合させ、外因性ストレスのサンプル時間を経験的に決定しなければならない。さらに、画像解析ソフトウェアを用いたSGのキャラクタリゼーションは、将来、生細胞イメージングにも拡張される可能性がある。リアルタイムSG解析が必要宿主細胞中の1つまたは複数の蛍光標識SGマーカーの発現を評価するが、異なる実験条件下で対処されるべきSG形成の時間的および特別な動態に関する質問を可能にする。次に、感染した細胞および感染していない細胞におけるリアルタイムSG分析を補うために、蛍光標識された細菌が必要となるであろう。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
PSはBill and Melinda Gates Grand Challenge助成金OPP1141322の受領者です。 PVは、スイス国立科学財団早期ポストドックモビリティフェローシップとRoux-Cantarini博士後援フェローシップによって支えられました。 PJSはHHMIグラントとERC-2013-ADG 339579-Decryptによってサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1:300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1:300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1:800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1:200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1:300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1:100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1:300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1:300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1:300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1:500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1:500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1:500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1:500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1:500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application - bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application - bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application - bacterial growth |
| Poly-L-Lysine (PLL) | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application - infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application - infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at RT, application - cell culture |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application - cell culture |
| Fetal Calf Serum (FCS) | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| Non-Essential Amino Acids (NEAA) | Life Technologies | 11140 | 1:100 dilution used for HeLa cell culture medium, application - cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application - cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application - stress inducer |
| Paraformaldehyde (PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application - fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application - permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1:40, best added during secondary antibody staining, application - staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application - staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application - staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application - mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application - cell culture |
| 12 mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application - cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application - mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application - data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application - image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application - data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application - data analysis |
References
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