Immunofluorescensanalyse av stress-granulatdannelse etter bakteriell utfordring av mammalceller
Summary
Vi beskriver en metode for kvalitativ og kvantitativ analyse av spenningsgranuldannelse i pattedyrceller etter at cellene er utfordret med bakterier og en rekke forskjellige spenninger. Denne protokollen kan anvendes for å undersøke den cellulære stressgranuleresponsen i et bredt spekter av vertsbakterielle interaksjoner.
Abstract
Fluorescerende avbildning av cellulære komponenter er et effektivt verktøy for å undersøke verts-patogen-interaksjoner. Patogener kan påvirke mange forskjellige egenskaper ved infiserte celler, inkludert organell ultrastruktur, cytoskeletalt nettverk organisasjon, samt cellulære prosesser som Stress Granule (SG) formasjon. Karakteriseringen av hvordan patogener undergraver vertsprosesser er en viktig og integrert del av patogenesen. Mens variable fenotyper kan være lett synlige, er den nøyaktige analysen av de kvalitative og kvantitative forskjellene i cellestrukturene indusert av patogenutfordring viktig for å definere statistisk signifikante forskjeller mellom eksperimentelle og kontrollprøver. SG-dannelse er et evolusjonært konservert stressrespons som fører til antivirale responser og har lenge blitt undersøkt ved hjelp av virusinfeksjoner 1 . SG-formasjon påvirker også signaleringskaskader og kan ha andre fremdeles ukjente konseqUences 2 . Karakteriseringen av dette stressresponset mot andre patogener enn virus, som for eksempel bakterielle patogener, er for tiden et fremvoksende forskningsområde 3 . Foreløpig er kvantitativ og kvalitativ analyse av SG-dannelsen ennå ikke rutinemessig brukt, selv i virussystemene. Her beskriver vi en enkel metode for å indusere og karakterisere SG-dannelse i uinfiserte celler og i celler infisert med et cytosolisk bakterielt patogen, som påvirker dannelsen av SG som respons på ulike eksogene stress. Analyse av SG-formasjon og sammensetning oppnås ved å bruke et antall forskjellige SG-markører og spotdetektor-plugin-modulen til ICY, et open source bildeanalyseværktøy.
Introduction
Visualisering av vertspatogen-interaksjoner på mobilnivå er en kraftig metode for å få innsikt i patogene strategier og for å identifisere nøkkelcellulære veier. Faktisk kan patogener brukes som verktøy for å finne viktige cellulære mål eller strukturer, da patogener har utviklet seg til å undergrave sentrale cellulære prosesser som en strategi for egen overlevelse eller forplantning. Visualisering av cellulære komponenter kan oppnås ved rekombinant uttrykking av fluorescens-merkede vertsproteiner. Selv om dette muliggjør sanntidsanalyse, er genereringen av cellelinjer med spesifikt merkede vertsproteiner svært arbeidskrevende og kan resultere i uønskede bivirkninger. Mer praktisk er deteksjonen av cellulære faktorer ved bruk av spesifikke antistoffer, fordi flere vertsfaktorer kan analyseres samtidig, og en er ikke begrenset til en bestemt celletype. En ulempe er at bare en statisk visning kan bli tatt som immunfluorescensanalyse nødvendiggjør vertscellefiksation. Imidlertid er en viktig fordel ved immunfluorescensimaging at den lett gir seg til både kvalitativ og kvantitativ analyse. Dette kan i sin tur brukes til å oppnå statistisk signifikante forskjeller for å gi ny innsikt i verts-patogen-interaksjoner.
Fluorescerende bildeanalyseprogrammer er kraftige analytiske verktøy for å utføre 3D- og 4D-analyse. Men den høye prisen på programvare og vedlikehold gjør metoder basert på gratis åpen kildekode-programvare mer attraktiv. Forsiktig bildeanalyse ved hjelp av bioanalysesoftware er verdifull som den underbygger visuell analyse, og ved tildeling av statistiske signifikanser øker tilliten til korrektheten av en gitt fenotype. Tidligere har SGs blitt analysert ved hjelp av den gratis ImageJ-programvaren, som nødvendiggjør manuell identifisering av individuelle SG 4 . Her gir vi en protokoll for induksjon og analyse av cellulær SG-dannelse i sammenheng med bacTerielle infeksjoner ved hjelp av gratis åpen kildekode bio-bildeanalyses programvare ICY (http://icy.bioimageanalysis.org). Bio-image analyse programvare har et innebygd spot detektor program som er svært egnet for SG analyse. Det gjør det mulig å finjustere den automatiserte deteksjonsprosessen i bestemte interesserte interesser (ROI). Dette overvinne behovet for manuell analyse av individuelle SG'er og fjerner sampling-bias.
Mange miljøbelastninger induserer dannelsen av SG, som er fasete cytosoliske, ikke-membranøse strukturer på 0,2 – 5 um i diameter 5 , 6 . Denne cellulære responsen blir evolusjonært konservert i gjær, planter og pattedyr, og oppstår når global protein-oversettelse hemmes. Det innebærer aggregering av stalled translation initiation komplekser i SG, som anses å holde steder for translasjonelt-inaktive mRNAer, slik at selektiv oversettelse av en delmengde av cellulære mRNAer.Ved fjerning av spenningen oppløses SG og globale hastigheter av proteinsyntese gjenopptas. SG er sammensatt av translasjonsforlengelsesinitieringsfaktorer, proteiner involvert i RNA-metabolisme, RNA-bindende proteiner, samt stillasproteiner og faktorer involvert i vertscellesignalering 2 , selv om den eksakte sammensetningen kan variere avhengig av påført spenning. Miljøfaktorer som induserer SG-dannelse inkluderer aminosyre sult, UV-bestråling, varmestokk, osmotisk sjokk, endoplasmatisk retikulumspenning, hypoksi og virusinfeksjon 2 , 7 , 8 . Mye fremgang har blitt gjort for å forstå hvordan virus induserer og undergraver også SG-dannelse, mens lite fortsatt er kjent om hvordan andre patogener, som bakterielle, sopp- eller protozoanpatogener, påvirker dette cellulære stressrespons 1 , 7 .
ShigeLla flexneri er et gram-negativt fakultativt cytosolisk patogen av mennesker og det forårsaker av alvorlig diaré eller shigellose. Shigellose er en stor folkehelsen byrde og fører til 28.000 dødsfall årlig hos barn under 5 år 9 , 10 . S. flexneri infiserer kolonepitelet og sprer cellen til cellen ved å kapre vertsens cytoskeletalkomponenter 11 , 12 . Infeksjon av epitelet støtter replikasjonen av S. flexneri i cytosolen, men infiserte makrofager dør gjennom en inflammatorisk celledødsprosess kalt pyroptose. Infeksjon fører til en massiv rekruttering av nøytrofiler og alvorlig betennelse som er ledsaget av varme, oksidativt stress og ødeleggelse av vev. Således, mens infiserte celler er gjenstand for interne spenninger fremkalt av infeksjon, slik som Golgi-forstyrrelse, genotoksisk stress og cytoskeletisk omleggingS, infiserte celler blir også utsatt for miljøbelastninger på grunn av den inflammatoriske prosessen.
Karakterisering av effekten av S. flexneri- infeksjon på cellers evne til å reagere på miljøbelastninger ved bruk av et antall SG markører har vist at infeksjon fører til kvalitative og kvantitative forskjeller i SG-sammensetning 3 . Imidlertid er lite kjent med andre bakterielle patogener. Her beskriver vi en metode for infeksjon av vertsceller med cytosolisk patogen S. flexneri , stress av celler med forskjellige miljøbelastninger, merking av SG-komponenter og kvalitativ og kvantitativ analyse av SG-dannelse og sammensetning i sammenheng med infiserte Og ikke-infiserte celler. Denne metoden er allment gjeldende for andre bakterielle patogener. I tillegg kan bildeanalysen av SG-formasjonen brukes til infeksjoner av virus eller andre patogener. Det kan brukes til å analysere SGDannelse ved infeksjon eller effekten av infeksjon på SG-dannelse som respons på eksogene stress.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen som er skissert her beskriver induksjon, lokalisering og analyse av SG i ikke-infiserte celler og celler infisert med cytosolisk patogen S. flexneri i nærvær eller fravær av eksogen stress. Ved hjelp av gratis bildebehandling, tillater protokollene nøyaktig kvalitativ og kvantitativ analyse av SG-formasjonen for å identifisere og statistisk adressere forskjeller i gitt fenotyper.
Det er flere kritiske skritt innen protokollen for infeksjonen, SG-induksjon og bildebe…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PS er mottaker av Bill og Melinda Gates Grand Challenge Grant OPP1141322. PV ble støttet av et sveitsisk nasjonalt vitenskapsstiftelse tidlig postdoc mobilitet fellesskap og et Roux-Cantarini postdoktoralt fellesskap. PJS støttes av et HHMI-tilskudd og ERC-2013-ADG 339579-Decrypt.
Materials
| Primary Antibodies | |||
| eIF3b (N20), origin goat | Santa Cruz | sc-16377 | Robust and widely used SG marker. Cytosolic staining allows cell delineation. Dilution 1 in 300 |
| eIF3b (A20), origin goat | Santa Cruz | sc-16378 | Same target as eIF3b (N20) and in our hands was identical to eIF3b (N20). Dilution 1 in 300 |
| eIF3A (D51F4), origin rabbit (MC: monoclonal) | Cell Signaling | 3411 | Part of multiprotein eIF3 complex with eIF3b . Dilution 1 in 800 |
| eIF4AI, origin goat | Santa Cruz | sc-14211 | Recommended by (Ref # 13). Dilution 1 in 200 |
| eIF4B, origin rabbit | Abcam | ab186856 | Good stress granule marker in our hands. Dilution 1 in 300 |
| eIF4B, origin rabbit | Cell Signaling | 3592 | Recommended by Ref # 13. Dilution 1 in 100 |
| eIF4G, origin rabbit | Santa Cruz | sc-11373 | Widely used SG marker. (Ref # 13): may not work well in mouse cell lines. Dilution 1 in 300 |
| G3BP1, origin rabbit (MC: monoclonal) | BD Biosciences | 611126 | Widely used SG marker. Dilution 1 in 300 |
| Tia-1, origin goat | Santa Cruz | sc-1751 | Widely used SG marker. Can also be found in P bodies when SG are present (Ref # 13). Dilution 1 in 300 |
| Alexa-conjugated Secondary Antibodies | |||
| A488 anti-goat , origin donkey | Thermo Fisher | A-11055 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-goat, origin donkey | Thermo Fisher | A-11057 | Cross absorbed. Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A-21202 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A10037 | Dilution 1 in 500 |
| A647 anti-mouse, origin donkey | Thermo Fisher | A31571 | Dilution 1 in 500 |
| A488 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A-21206 | Dilution 1 in 500 |
| A568 anti-rabbit, origin donkey | Thermo Fisher | A10042 | Dilution 1 in 500 |
| Other Reagents | |||
| Shigella flexneri | Available from various laboratories by request | ||
| Tryptone Casein Soya (TCS) broth | BD Biosciences | 211825 | Standard growth medium for Shigella, application – bacterial growth |
| TCS agar | BD Biosciences | 236950 | Standard growth agar for Shigella, application – bacterial growth |
| Congo red | SERVA Electrophoresis GmbH | 27215.01 | Distrimination tool for Shigell that have lost the virulence plasmid, application – bacterial growth |
| Poly L lysine | Sigma-Aldrich | P1274 | Useful to coating bacteria to increase infection, application – infection |
| Gentamicin | Sigma-Aldrich | G1397 | Selective killing of extracellular but not cytosolic bacteria, application – infection |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | PH buffer useful when cells are incubated at room-temperature, application – cell culture |
| DMEM | Life Technologies | 31885 | Standard culture medium for HeLa cells, application – cell culture |
| Fetal calf serum | Biowest | S1810-100 | 5% supplementation used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 | 1/100 dilution used for HeLa cell culture medium, application – cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | Reagent diluent, application – cell culture |
| Sodium arsenite | Sigma-Aldrich | S7400 | Potent stress granule inducer (Note: highly toxic, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| Clotrimazole | Sigma-Aldrich | C6019 | Potent stress granule inducer (Note:health hazard, special handling and disposal required), application – stress inducer |
| PFA | Electron Microscopy Scences | 15714 | 4% PFA is used for standard fixation of cells, application – fixation |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Used at 0.03% for permeabilizationof host cells before immunofluorescent staining, application – permeabilization |
| A647-phalloidin | Thermo Fisher | A22287 | Dilution is at 1/40, best added during 2ary antibody staining, application – staining |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | Nucleid acid stain used to visualize both the host nucleus and bacteria, application – staining |
| Parafilm | Sigma-Aldrich | BR701501 | Paraffin film useful for immunofluorescent staining of coverslips, application – staining |
| Prolong Gold | Thermo Fisher | 36930 | Robust mounting medium that works well for most fluorophores , application – mounting |
| Mowiol | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and robust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| 24-well cell culture plate | Sigma-Aldrich | CLS3527 | Standard tissue culture plates, application – cell culture |
| 12-mm glass coverslips | NeuVitro | 1001/12 | Cell culture support for immunofluorescent applications, application – cell support |
| forceps | Sigma-Aldrich | 81381 | Cheap and obust mounting medium that works well for most fluorophores, application – mounting |
| Programs and Equipment | |||
| Prism | GraphPad Software | Data analysisand graphing program with robust statistical test options, application – data analysis | |
| Leica SP5 | Leica Microsystems | Confocal microsope, application – image acquisition | |
| Imaris | Bitplane | Professional image analysis program, application – data analysis | |
| Excel | Microsoft | Data analysis and graphing program, application – data analysis | |
References
- Reineke, L. C., Lloyd, R. E. Diversion of stress granules and P-bodies during viral infection. Virology. 436 (2), 255-267 (2013).
- Kedersha, N., Ivanov, P., Anderson, P. Stress granules and cell signaling: more than just a passing phase. Trends Biochem Sci. 38 (10), 494-506 (2013).
- Vonaesch, P., Campbell-Valois, F. -. X., Dufour, A., Sansonetti, P. J., Schnupf, P. Shigella flexneri modulates stress granule composition and inhibits stress granule aggregation. Cell Microbiol. 18 (7), 982-997 (2016).
- Kolobova, E., Efimov, A., et al. Microtubule-dependent association of AKAP350A and CCAR1 with RNA stress granules. Exp Cell Res. 315 (3), 542-555 (2009).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stress granules: the Tao of RNA triage. Trends in biochemical sciences. 33 (3), 141-150 (2008).
- Anderson, P., Kedersha, N. Stressful initiations. J Cell Sci. 115, 3227-3234 (2002).
- Mohr, I., Sonenberg, N. Host translation at the nexus of infection and immunity. Cell Host Microbe. 12 (4), 470-483 (2012).
- Hu, S., Claud, E. C., Musch, M. W., Chang, E. B. Stress granule formation mediates the inhibition of colonic Hsp70 translation by interferon- and tumor necrosis factor. Am J Physiol Gastointest Liver Physiol. 298 (4), 481-492 (2010).
- Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B., Fasano, A., Kotloff, K. L., Levine, M. M. Progress and pitfalls in Shigella vaccine research. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10 (4), 245-255 (2013).
- Lanata, C. F., Fischer-Walker, C. L., et al. Global Causes of Diarrheal Disease Mortality in Children. PloS One. 8 (9), 72788 (2013).
- Ashida, H., Ogawa, M., et al. Shigella deploy multiple countermeasures against host innate immune responses. Curr Opin Microbiol. 14 (1), 16-23 (2011).
- Ashida, H., Ogawa, M., Mimuro, H., Kobayashi, T., Sanada, T., Sasakawa, C. Shigella are versatile mucosal pathogens that circumvent the host innate immune system. Curr Opin Immunol. 23 (4), 448-455 (2011).
- Kedersha, N., Anderson, P. Mammalian stress granules and processing bodies. Methods Enzymol. 431, 61-81 (2007).
- Ray, K., Marteyn, B., Sansonetti, P. J., Tang, C. M. Life on the inside: the intracellular lifestyle of cytosolic bacteria. Nat Re. Micro. 7 (5), 333-340 (2009).
