Summary
We demonstreren de semi-geautomatiseerde radiochemische synthese van [ 18 F] 3F4AP en kwaliteitscontroles.
Abstract
3- [18F] fluor-4-aminopyridine, [18F] 3F4AP, is een radiofluorinated analoog van het FDA-goedgekeurd geneesmiddel voor multiple sclerose 4-aminopyridine (4AP). Deze verbinding wordt momenteel onderzocht als een PET-tracer voor demyelinisatie. We hebben onlangs een nieuwe chemische reactie beschreven om metafluorinated pyridines te produceren die bestaan uit directe fluorinering van een pyridine-N-oxide en het gebruik van deze reactie voor de radiochemische synthese van [18F] 3F4AP. In dit artikel tonen we hoe u deze tracer kunt produceren met behulp van een geautomatiseerde synthesizer en een in-house vloeibare hydrogeneringsreactor. We tonen ook de standaard kwaliteitscontroleprocedures die zijn uitgevoerd voordat de radiotracer wordt vrijgelaten voor preklinische dierenbeeldstudies. Deze semi-geautomatiseerde procedure kan dienen als basis voor de toekomstige productie van [ 18 F] 3F4AP voor klinische studies.
Introduction
Het vermogen om een klein molecuulgeneesmiddel niet-invasieve in het menselijk lichaam op te sporen, heeft een groot potentieel voor precisiegeneeskunde. Onder de moleculaire beeldvormingstechnieken heeft positronemissie-tomografie (PET) veel gunstige eigenschappen: de hoge gevoeligheid van PET-detectors maakt het detecteren en kwantificeren van zeer kleine hoeveelheden radioactief materiaal mogelijk en de eigenschappen van de scanners maken het mogelijk om de ruimtelijke mapping van de lokalisatie 1 , 2 , 3 . PET laat bijvoorbeeld detectie en lokalisatie van tumoren en metastase toe op basis van het niveau van opname van een radioactief glucose analoog, [18F] FDG 4 . PET kan ook lokalisatie en kwantificering van specifieke hersenreceptoren en hun bezettingsgraad bieden die waardevol kunnen zijn voor het diagnosticeren en begrijpen van neurologische en psychiatrische stoornissen 5 . Om te ontwikkelenEen kleine molecuul PET-tracer, moet de verbinding van belang worden gemerkt met een positronemissie-isotoop, typisch 11 C of 18 F. Tussen deze twee radio-isotopen heeft 18 F een langer halveringstijd (109 min tegen 20,3 voor 11 C) , Waardoor multidosis en offsite productie mogelijk is. Niettemin kan het toevoegen van 18 F aan een molecuul uitdagend zijn. 18 V etikettering vereist snelle reacties die compatibel zijn met automatisering die de chemicus verlaagt van directe behandeling van de activiteit en het ontvangen van hoog geabsorbeerde stralingsdoses.
We hebben onlangs het gebruik van pyridine-N-oxiden beschreven als precursoren voor de fluorinering van pyridines en het gebruik van deze chemie bij de radiochemische synthese van [18F] 3F4AP 6 , een radiofluorinated analoog van het FDA-goedgekeurde geneesmiddel voor multiple sclerose, 4- Aminopyridine (4AP) 7 , 8 , 9 . thIs een nieuwe radiotracer momenteel onderzocht als een PET-tracer voor demyelinisatie 10 , 11 , 12 . In dit videoartikel tonen we de semi-geautomatiseerde synthese van deze verbinding aan met behulp van een IBA Synthera Synthesis Unit (hierna aangeduid als "de synthesizer") en een in-house vloeibaar hydrogeneringsapparaat. De synthese is gebaseerd op de reactie getoond in figuur 1 . Voorbereiding voor de procedure duurt ongeveer 1 uur, radiolabeling en zuivering 1,5 uur en kwaliteitscontroleprocedures 0,5 uur.
Protocol
VOORZICHTIG: Alle procedures die het gebruik van radioactieve stoffen betreffen, moeten door het lokale kantoor van stralingsveiligheid worden goedgekeurd. Draag bij het werken met radioactieve stoffen een lab coat en persoonlijke straling badges. Gebruik twee lagen handschoenen te allen tijde en controleer de handen met een Geiger-teller na elke stap die de radioactiviteit met zich meebrengt. Als de handschoenen met radioactieve stoffen zijn besmet, verwijder dan de buitenhandschoenen. Gebruik geschikte afscherming, verminder de tijd in contact met de stralingsbron en maximaliseer de afstand.
1. Eén week voor experiment: Bereiding van materialen
- Download [ 18 F] 3F4AP volgorde: Synthera gebruikers kunnen zich aanmelden bij de Gebruikersdatabase (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) en download het sequentiebestand voor 3F4AP. Gebruikers van andere synthesizers kunnen hun eigen script op basis van de volgorde van de stappen moeten schrijven. Blader door de geannoteerde volgorde om vertrouwd te raken met de sTapjes betrokken bij de synthese.
- Zorg ervoor dat er genoeg gas is voor de synthese. De synthesizer vereist gecomprimeerd gas, ofwel helium of stikstof. Het vereist ook> 75 psi perslucht. Zorg ervoor dat de druk binnen de door de fabrikant aanbevolen is.
- Bereid HPLC mobiele fase: Bereid 1 L 50 mM natriumfosfaat en 10 mM triethylamine. Met behulp van een pH meter past u de pH aan op 8,0 ± 0,1 door druppelsgezette natriumhydroxide toe te voegen tijdens roeren. Filter de oplossing door een 0,22 μm fles filter en voeg 5% volume ethanol toe.
- Droog glaswerk in de oven overnacht.
2. Experimentdag: Vóór aankomst van Fluorine-18
- Gebruik 1 ml spuiten, vul de reactieflacons met de juiste reagentia. Voor injectieflacons 2 en 3 gebruiken ovendroog flesjes en watervrije oplosmiddelen die onder argon worden gehouden. Verzegel de flesjes met krimpzegels met behulp van een crimper.
- Vul flacon 1 (11 mm diameter / 2 ml volume viAl) met 400 μl TBA-HCO3 + 800 μl acetonitril (MeCN).
- Vul fles 2 (13 mm / 4 ml flesje) met 50 μl precursoroplossing 1,0 mg / ml + 450 μL MeCN.
- Vul fles 3 (11 mm / 2 ml flesje) met 500 μl MeCN.
- Vul flacon 4 (13 mm / 4 ml flacon) met 4 ml 0,2% oxaalzuur in methanol (MeOH).
- Voorwaarde voor de QMA (sterke anionuitwisseling) en Alumina-N vaste fase extractie cartridges. Gebruik een 10 ml spuit 5 ml 8,4% NaHCO 3 druppelsgewijze door de QMA, gevolgd door 5 ml ultrafijne gedeïoniseerd type I water (18,2 ΜΩ • cm bij 25 ºC). Passeer 5 ml ultraperout water dropwise door middel van Alumina-N cartridge gevolgd door 5 ml MeOH + 0,2% oxaalzuur.
- Zet de HPLC aan en stel de C-18 kolom voor 30 minuten aan met 4 ml per minuut mobiele fase.
- Laad een nieuwe katalysatorpatroon op de houder van de waterstofopnemer en start een stroom van 0,5 ml / min 100% MeOH. SEt de waterstofregelaar tot 50 psi en verzorg de cartridge gedurende 15 minuten ( figuur 2 ).
- Monteer de geïntegreerde vloeistofverwerker (IFP) door de injectie van flacons 1 tot en met 4 in hun posities te plaatsen, waarbij de cartridges en de injectieflacon worden bevestigd, zoals weergegeven in Figuur 3 . Bevestig een collectieflasje met een ontluchtingsnaald aan de uitgangslijn van de waterstof.
- Start de software van de synthesizer. Voer login en wachtwoord in. Voer voorafgaande controles uit op de synthesizer volgens de instructies van de fabrikant.
- Klik op "Sequences" en dan op "Open" om de 3F4AP volgorde te laden.
- Laad de IFP door op de "Load" knop op het scherm te klikken. Typ een bestandsnaam voor de run en start de sequentie door op "Start" te klikken. (De automatische synthesizer zal automatisch pauzeren voor de 18 F laadstap.)
- Kijk als de synthesizer door de routine zelfcontrole stappen gaat (deel een van de volgorde). Kijk naar de schreeuwN om ervoor te zorgen dat er geen waarschuwingen of alarmen zijn. Let op geluiden aangezien de synthesizer lijnen spoelt en voorverwarmen reactievat ter voorbereiding op de looppas. De temperatuurindicator moet stijgen en blijven bij 65 ºC. Wacht op het signaal (auditieve piep) die aangeeft dat de synthesizer klaar is voor de 18 F-overdracht.
3. Experimentdag: 18 F Etikettering
- Verplaats de gewenste hoeveelheid door cyclotron geproduceerde 18 F van het cyclotron target naar 18 F injectieflacon. Controleer de hoeveelheid radioactiviteit en laat het opnemen bij de levertijd.
OPMERKING: Als u geen directe lijn voor 18 F - overdracht gebruikt, gebruik dan een voorgevulde spuit met een naald die is aangesloten om de activiteit door de septum naar de injectieflacon over te brengen. De hoeveelheid startende radioactiviteit hangt af van de grenzen die door het Bureau voor Stralingsveiligheid zijn vastgesteld en de gewenste hoeveelheid eindtracers. Typische hoeveelheid tussen 50 en 500 mCi. - Monitor de progressie van de synthese door de geautomatiseerde volgorde op het computerscherm.
- Bekijk de overdracht van de 18 F van de fles op de QMA gedurende 90 s. Na het opvangen van 18 F - op QMA elueert het met TBA-HCO 3 oplossing (injectieflacon 1). (Deel twee van de volgorde)
- Monitor de druk- en temperatuursporen op de synthesizer, terwijl de TBA 18 F gedroogd wordt onder verminderde druk (5 kPa) en verwarming (100 ºC), gevolgd door extra drogen en afkoelen. (Deel 3 van de volgorde)
- Controleer de overdracht van watervrije MeCN (injectieflacon 3) en voorloperoplossing (injectieflacon 2) naar de reactor en hoe het gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur reageert. De oplossing moet kleurloos of erg licht geel zijn. (Deel 4 van de volgorde)
- Bekijk de overdracht van oxaalzuurOplossing (flacon 4) naar de reactor. Kijk als de oplossing is druk overgedragen van de reactor via aluminiumoxide-N cartridge naar het eindproduct flesje. (Deel 5 van de volgorde)
- Aan het eind van de reeks print het rapport af, doe de IFP uit, sluit de gastanks af en sluit de software.
- Meet de radioactiviteit eerst in de aluminiumoxide-N cartridge en de verzamelflesje door de cartridge en het flesje apart in de doseringscalibrator te plaatsen. Noteer de activiteit en de tijd van meting. Plaats de gebruikte cartridge in een geleide afvalbak. Plaats de collectieflacon in een afgeschermde houder voor transport naar de volgende stap.
- Gebruik een 1 ml spuit met een 2 "-negel, die handmatig 100 μL monster van de tussenproduktoplossing in een standaard HPLC-injectieflacon vervoeren voor in-process kwaliteitscontrole. Spuit 10 μL van dit monster in de HPLC om de zuiverheid en Identiteit van de intermeDiaatverbinding.
OPMERKING: HPLC condities: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 kolom. Flow 4 mL / min. Mobiele fase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isocratische 15 min.
4. Experimentdag: Hydrogenatie
VOORZICHTIG: Injectie van het product in de waterstofinrichting moet geschieden met behulp van de juiste beschermingsmaatregelen. Waterstofgas moet goed behandeld en ontlucht worden.
OPMERKING: de hydrogeneringsreactor kan in plaats van de HPLC-kolom op de synthesizer worden aangesloten en gecontroleerd worden met behulp van de synthesizer software.
- Zet de waterstofstroom op 0,5 ml / min door de synthesizer HPLC-sequentie te starten. Manuele waterdruk instellen op 50 psi.
- Na het afronden van de etikettering en blusende stappen zal de synthesizer de tussenproduktoplossing overbrengen in waterstofator / HPLC-lus.
- Wanneer de radioactieve piek op de HPL verschijntC software wisselt de collectieklep om het product te verzamelen. Meet de radioactiviteit van het ruwe product met behulp van een dosis kalibrator.
OPMERKING: Het ruwe product moet worden geïnjecteerd in een geautomatiseerd HPLC-systeem in een hete cel. Na zuivering wordt het eindproduct vervolgens verzameld en in een aseptische ISO klasse 5 laminair luchtstromende heetcel afgegeven volgens USP en FDA regelgeving.
5. Experimentdag: zuivering en bereiding van de dosis
- Spuit ruw product in de HPLC en gebruik de geautomatiseerde fractie collector om de fracties te verzamelen die overeenstemmen met de eindproductpiek. Elke buis bevat 0,66 ml oplossing.
OPMERKING: HPLC condities: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 kolom. Flow 4 mL / min. Mobiele fase (50 mM Na 2 HPO 4 , 10 mM TEA, 5% EtOH). Isocratische 15 min. Verzamel 4-15 min. - Meet de radioactiviteit van elke fractie met behulp van een dosis kalibrator en record het. Combineer de breuken met de hoogste hoeveelheidS van radioactiviteit (typisch buizen 14-18).
- Teken de productoplossing met een 10 ml spuit en steek het monster door een 0,22 μm filter in een steriele injectieflacon. Noteer de hoeveelheid radioactiviteit, eind van de synthese tijd en het volume van de oplossing op het flesje label. Dit is de uiteindelijke dosis voor injectie. Verwijder ~ 0,8 ml van de oplossing voor kwaliteitscontroles.
6. Experimentdag: Kwaliteitscontrole (QC) -tests
- Vóór de afgifte van de dosis:
Controleer de dosis door middel van lood afgeschermd glas. De oplossing moet helder, kleurloos en vrij van deeltjes zijn. - Radiochemische identiteit:
- Voor RadioTLC: spot een druppel van het monster op een TLC-plaat naast elkaar met de referentienorm. Run TLC plaat op een TLC kamer met 95% MeOH: 5% azijnzuur. Visualiseer de referentienorm onder UV-verlichting en markeer de positie ervan met een potlood.
- Tape de TLC-plaat op het podium van de radioTLC-scannerEr en recordtijd van de piek. R f waarden van de referentienorm en de radioactieve piek moeten overeenkomen binnen 5%.
- Voor RadioHPLC: run 10 μL van de dosis met en zonder de referentiestandaard op de HPLC. De retentietijd van de referentienorm en de radioactieve piek moeten overeenkomen. Een enkele spoelpiek moet op het spikmonster worden gezien.
- Voor radiochemische zuiverheid: Meet het gebied onder de kromme voor de radioHPLC en de radioTLC-doelpieken. Het gebied van de doelpunt moet> 95% van het gebied zijn voor alle radioactieve pieken gecombineerd.
- Voor de specifieke radioactiviteit: bereken de specifieke radioactiviteit als de hoeveelheid radioactiviteit in de piek (gemeten op stap 5.2) over de massahoeveelheid die bepaald wordt uit het gebied onder de kromme van het UV HPLC-trace met behulp van een vooraf ingestelde kalibratiekromme. De specifieke radioactiviteit moet hoger zijn dan 50 mCi / μmol.
- Voor de residuele oplosmiddelanalyse: meet de hoeveelheid residuele solvéneTs (MeCN, MeOH) in de dosis met behulp van gaschromatografie. Oplosmiddelen moeten <0,04% voor acetonitril en <3000 ppm voor methanol bevatten. De hoeveelheid EtOH moet minder dan 10% w / v zijn.
- Voor de steriele filterintegriteitstest (bubelpunt): verbind het filter dat in stap 5.3 gebruikt wordt, aan een stikstoftoevoer voorzien van een drukregelaar en onderdompel de naald in water. Open de gasklep geleidelijk terwijl u de drukmeter kijkt. Het filter dient druk te onderdrukken van maximaal 50 psi zonder uitbarsting, zoals blijkt uit het ontbreken van een stroom bellen uit de naald. Verhoog de druk boven 50 psi tot een stroom bellen uit de naald komt. Let op deze druk, het is de burstdruk en het moet> 50 psi zijn.
- Voor de halveringstijd van de radionuclide: meet de radioactiviteit van het product bij twee keer punten ≥10 minuten uit elkaar in een dosis kalibrator. Bereken de halfwaardetijd met behulp van de vergelijking hieronder. De halveringstijd moet overeenkomen met die van 18 F tot binnen 5 minuten (109 ± 5 min):
T ½ berekend = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
Waar t het interval tussen metingen is en A1, A2 de activiteit gemeten op elk tijdstip. - Voor de radionuclide identiteit en zuiverheid: Verkrijg het y-straalspectrum van een monster van het product met behulp van een gamma-teller. Het spectrum zou één enkele fotopiek op een energie van 511 keV moeten tonen. Er mogen geen andere foto-pieken in het spectrum zijn.
- Voor de endotoxine analyse: meet de endotoxine niveaus met behulp van een LAL chromogene endotoxine kwantitatietest. Endotoxine niveaus moeten <1,75 EU / ml zijn voor een verdund product 1:10 met een eindproductvolume van 10 ml.
- Documenteer de resultaten van elke QC-test. Laat de dosis uitsluitend voor dierstudies vrij, als alle tests geslaagd zijn.
- Post-dosis vrijgave:
Voor de steriliteitstest: voeg een monster van de dosis toe aan zowel vloeibaar thioglycolaat als trypticaseSoja bouillon. Na 14 dagen mag geen groei op de media worden gezien.
7. Experimentdag: Berekeningen (tabel 1)
- Voor de niet-vervalgerde radiochemische opbrengst (ndc RCY): bereken de ndc RCY als de hoeveelheid radioactiviteit in het eindproduct over de startradioactiviteit.
- Voor de radioactieve effectiviteit: bereken de opbrengst van de etikettering als de verhouding van de radioactiviteit in de injectieflacon over de radioactiviteit in de alumina-N-cartridge (niet-geïncorporeerde [ 18 F] F-) en de collectieflacon.
- Voor de hydrogeneringsopbrengst: bereken de hydrogeneringsopbrengst als de hoeveelheid radioactiviteit in de gewenste piek over de radioactiviteit die in de HPLC is geïnjecteerd.
- Voor de filterverliezen: verlies filtering verliezen, aangezien de radioactiviteit in de filter en spuit over radioactiviteit voor het filteren blijft.
Representative Results
De radiochemische synthese van [18F] 3F4AP omvat twee stappen ( Figuur 1 ). De eerste stap wordt op een volledig geautomatiseerde manier uitgevoerd met behulp van de synthese-eenheid ( Figuur 3 ). Dit cassette gebaseerde systeem maakt gebruik van vier reactiemiddelen en een flesje met een reactor en heeft computer gestuurde kleppen die overdracht en mengen van reagentia mogelijk maken, alsmede verhitting, druk en evacueren van de reactor. Daarnaast ondersteunt het standaard vaste-extractiepatronen voor het scheiden van reagentia. De computerinterface stelt gebruikers in staat om scripts te schrijven en te wijzigen om hun eigen syntheses te kunnen uitvoeren. In het geval van [18F] 3F4AP bestaat de synthese procedure uit vijf basisdelen. In het eerste deel voert de synthesizer zelfcontrole stappen uit, verwarmt de reactor en wacht op het signaal van de bediener dat de 18 F klaar is. Tijdens het tweede deel wordt het [ 18 F] fluoride overgebrachtM de 18 F-injectieflacon in de anionuitwisselingspatroon en eluteer uit de patroon in de reactor onder gebruikmaking van een oplossing tetrabutylammoniumbicarbonaat. Het derde deel, de synthesizer droog het [ 18 F] fluoride onder vacuüm azeotroop om het reactief te maken tegen nucleofiele verplaatsing. In het vierde deel wordt de voorloper automatisch toegevoegd aan de reactor waar het reageert met de 18 F - om de gelabelde verbinding te genereren. Tenslotte wordt de reactie geblokkeerd door toevoeging van 0,2% oxaalzuur in methanol, die de basisversterkte afbraak van het product voorkomt en de uiteindelijke oplossing wordt overgedragen aan de opnameglas nadat ze door een alumina-N patroon die Niet gereageerd fluoride.
Nadat de etiketteringsstap is voltooid, kan een kleine steekproef worden genomen voor kwaliteitscontrole. Het uitvoeren van een monster op de HPLC bevestigt dat de labelingstap werkte en een schattingOp de radiochemische zuiverheid ( figuur 4 ). Vanuit het UV-trace op de HPLC kan ook de massa hoeveelheid product worden berekend aan de hand van een vooraf ingestelde kalibratiekromme.
Terwijl de in-proces kwaliteitscontrole HPLC loopt, wordt de tweede reactiestap, reductie van de N-oxide en nitrogroepen uitgevoerd. Om dit te doen wordt het gelabelde product geautomatiseerd geïnjecteerd in een in-house hydrogeneringsapparaat gebaseerd op de methode gepubliceerd door Yoswathananont et al. 13 ( figuur 2 ). Dit toestel bestaat uit een HPLC-pomp en een gecomprimeerde waterstoftank die verbonden is met het stroomstof-hydrogeneringsapparaat via lijnen die zijn uitgerust met controleventielen om terugstroom te voorkomen. Het product wordt geduwd door de HPLC-pomp en gemengd met waterstof in een T-vormige mixer. Dit mengsel wordt dan door een kleine patroon die 10% Pd / C katalysator op een vaste drager bevat, doorgevoerd. Na het doorlopen van de cataHet verlaagde product wordt dan in kleine fracties verzameld.
Na het hydrogeneren wordt het ruwe product vervoerd en manueel geïnjecteerd in de HPLC voor zuivering van het eindproduct ( Figuur 5 ). De mobiele fase van de HPLC is geselecteerd om compatibel te zijn met dierlijke injectie. De pieken die overeenstemmen met het product worden vervolgens verzameld en gefiltreerd om de einddosis te verkrijgen.
Voorafgaand aan het vrijgeven van de dosis voor PET beeldvormende studies worden kwaliteitscontroles uitgevoerd. Deze tests worden uitgevoerd om ervoor te zorgen dat de tracer de chemische entiteit is die hij moet zijn en dat het veilig is voor injectie. Sommige van deze tests zijn mogelijk niet nodig voor injectie in dieren, maar het wordt algemeen aanbevolen om de richtlijnen voor menselijk gebruik te volgen. Daardoor garandeert u de kwaliteit van het product, wat het vertrouwen in de resultaten sterk verhoogtBelemmert de toekomstige overgang naar het product voor menselijke injectie.
Tabel 1 bevat de typische syntheseparameters inclusief initiële hoeveelheid radioactiviteit, initiële hoeveelheid voorloper, opbrengst voor elke stap, specifieke activiteit, filterverlies, enz. Deze parameters zijn handig bij het oplossen van incidentele storingen en toekomstige optimalisatie van de procedure.
Figuur 1. Reactie schema. Radiochemische synthese bestaat uit etikettering door 19 F / 18 F uitwisseling gevolgd door palladiumgekatalyseerde hydrogenering. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" />
Figuur 2. Hydrogenatie systeem. Schematisch van het apparaat. Dit apparaat is gebaseerd op de publicatie door Yoswathananont et al. (Ref 13).
Figuur 3. Schema van synthesizer geïntegreerde vloeibare processor (IFP) en reagentia. IFP bevat vier injectieflacons, een QMA-patroon en een reactieflacon. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4. UV- en radioHPLC-tracers voor intermediair product. 3-fluor-4-nitropyridine N-oxide heeft een karakteristieke absorptie bij 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5. UV- en radioHPLC-tracers voor eindproduct. 3-fluor-4-aminopyridine absorbeert bij een 254 nm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| Concept | Gemiddelde (n = 4) | SD | Comments |
| Initiële 18 F activiteit (mCi) | 148,0 | 44.9 | Begin van de synthese |
| Voorloper hoeveelheid (μg) | 50 | Gebruik 50 μL 1,0 mg / ml voorraad | |
| Activiteit overgelaten in QMA (mCi) | 3.0 | 1.7 | Gemeten aan het eind van de labelingstap |
| Radiolabeling opbrengst | 29,7% | 6,3% | Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) |
| Radiochemische zuiverheid (HPLC-1) | > 98% | Van HPLC-1 QC | |
| Spec. handelen. Intermediair (mCi / μmol) | 122,9 | 29.7 | Van HPLC-1 met behulp van de kalibratiekromme |
| Hydrogenatie herstel (dc) | 74% | 9,0% | Gecorrigeerd voor verval |
| HPLC-radiochemische zuiverheid (HPLC-2) | 90,7% | 2,9% | Berekend uit HPLC-2 |
| Droog efficiëntie | > 98% | Gecorrigeerd voor verval | |
| Filteren herstel | 93,5% | 1,7% | Gecorrigeerd voor verval |
| Dosisvolume (mL) | 3.3 | Verzamel fracties met de hoogste radioactiviteit | |
| Spec. handelen. Eindproduct (mCi / μmol) | 75.5 | 30.0 | Van HPLC-3 met behulp van de kalibratiekromme |
| Synthese efficiëntie | 8,5% | 3,6% | Niet-bederf gecorrigeerd |
| Synthesis tijd (min) | 104 | 11.2 |
Tabel 1. Radiochemische synthese parameters.
| Veel voorkomende problemen | Potentiële redenen en oplossingen |
| [ 18 F] fluoride wordt niet efficiënt geëlueerd uit de QMA | · TBA-HCO 3 is niet correct opgesteld. Zorg ervoor dat de concentratie voldoende is. |
| · Er zijn lekkages op de TBA-HCO 3 injectieflacon. Zorg ervoor dat de krimpzegel stevig is en dat de septum niet doorgaat voordat u deze op de IFP installeert. | |
| · TBA-HCO 3 is niet in goede staat. Bestel een frisse batch. | |
| De opbrengst van de etikettering is laag | · Er is vocht in de voorloperoplossing. Droge voorloper en oplosmiddelen. |
| · Temperatuur is te laag. | |
| Reactieoplossing is geel | · Het product ontbindt door base. Gebruik minder TBA-HCO 3 . |
| · Er is tVeel voorloper. Gebruik minder voorloper. | |
| · Er is te weinig oplosmiddel voor de hoeveelheid 18 F - . Gebruik meer oplosmiddel. | |
| Extra pieken op radioHPLC | · Nitrogroep wordt vervangen: verminder de reactietemperatuur of verkort de reactietijd. |
| Hydrogeneringsreactie werkt niet | · Catalyst is niet goed. Gebruik een nieuwe cartridge. |
| · De stroom is te snel en maakt geen voldoende contact tussen katalysator en substraat mogelijk. Verminder de stroom. | |
| · Waterdruk is te laag. Verhoog H 2 druk. | |
| Waterstofdruk neemt dramaties toe tijdens de procedure | · De integriteit van de cartridges is gecompromitteerd en de stevige ondersteuning sluit de lijnen aan. Stop de stroom en sluit het gas uit. Laat radioactiviteit vervallen. Verwijder de katalysatorpatroon en spoel het systeem af. Zet eenEw cartridge. |
| Waterstofopbrengst is laag | · Te veel onzuiverheden die concurreren voor de katalysator (MeCN, oxaalzuur). Verminder hoeveelheid onzuiverheden of verhoog de massa van precursor (waarschuwing: toenemende precursor hoeveelheid vermindert specifieke activiteit). |
| Herstel van radioactiviteit uit hydrogeneringstap is laag | · Er is een lek in het systeem. Controleer op lekken en terugspoelen in de waterstofleiding. |
| · Verbinding verontreinigt in de reactor. Evalueer verschillende reactieomstandigheden (druk, temperatuur, stroom, etc. ). | |
| Te veel radioactiviteit wordt verloren tijdens filtratie | · Vóór gebruik het filter nat maken. |
| · Gebruik filter met een lager doodvolume. | |
| De uiteindelijke productpiek op de HPLC ziet er breed uit | · Te veel volume geïnjecteerd. Spuit lager amount. Gebruik kolom met grotere diameter. |
| · De kolom is niet goed geconditioneerd. Geef de kolom voor ten minste 30 kolomvolumes aan. | |
| · PH van de mobiele fase is laag. Zorg ervoor dat de pH ≥ 8 is. | |
| · Kolom is niet in goede staat. Vervang kolom. Gebruik kolom die compatibel is met de basis pH. |
Tabel 2. Problemen oplossen gids.
Discussion
De bereiding van PET-tracers vereist een efficiënte etikettering met minimale gebruikersinterventie om de blootstelling aan straling 14 te beperken. Hier beschrijven we de eerste semi-geautomatiseerde procedure voor de radiochemische synthese van [ 18 F] 3F4AP, een PET-tracer die momenteel onderzocht wordt voor het afbeelden van demyelinisatie. Deze semi-geautomatiseerde methode produceert de radiotracer met hoge zuiverheid en voldoende specifieke activiteit voor dierstudies. Voorgaande methoden voor de synthese van deze verbinding waren gebaseerd op handmatige synthese 6 , die de hoeveelheid radioactieve tracer die kan worden geproduceerd aanzienlijk beperkt. Het hebben van een geautomatiseerde methode voor de synthese biedt ook meer reproduceerbare opbrengsten en maakt het makkelijker om de procedure over te brengen naar andere laboratoria met soortgelijke apparatuur. Toekomstige inspanningen om de procedure volledig te automatiseren, zullen instrumenteel zijn in de productie van de sporen in grote hoeveelheden voor studies bij grote dieren of mensen.
19 F voor 18 F om de radio-isotoop in het molecuul van belang op te nemen. De voordelen van deze reactie zijn dat het snel is en bijna uitsluitend het gewenste product produceert zonder dat er een potentieel lange zuiveringsstap nodig is om de overmaat van voorloper te verwijderen. Eén beperking van het gebruik van fluoride-uitwisselingsreacties zoals die welke hier gebruikt wordt, is dat door de initiële massa van de koude verbinding de definitieve specifieke activiteit gedefinieerd als hoeveelheid radioactiviteit in mCi over de hoeveelheid verbinding in μmol beperkt kan zijn. Onder onze standaardomstandigheden, beginnend met 100-200 mCi van 18 F en 50 μg precursor, is de typische specifieke activiteit aan het eind van de synthese tot 100-200 mCi / μmol, wat voldoende lijkt voor preklinische PET beeldvormende studies . Niettemin kan de specifieke activiteit verbeteren door het startbedrag voor 18 F te verhogen - 15 , 16 .
Net als bij alle radiochemische syntheses van PET-tracers is het van groot belang om snel te werken om radioactieve verval te minimaliseren. Het is ook belangrijk om de tijdsbehandeling van de radioactieve materialen te minimaliseren, de juiste afscherming te gebruiken en de afstand tussen het radioactieve materiaal en de gebruiker te maximaliseren om de blootstelling aan straling te beperken. Deze aspecten zijn bijzonder belangrijk tijdens de tweede helft van het protocol (zuivering en kwaliteitscontrole) waarin de gebruiker de oplossing manueel in de HPLC moet injecteren, de fracties verzamelen en het eindproduct filteren.
Net als bij alle radiochemische syntheses van PET-tracers is het van cruciaal belang om snel te werken om m te kunnen mInactiveren radioactieve verval. Het is ook belangrijk om de tijdsbehandeling van de radioactieve materialen te minimaliseren, de juiste afscherming te gebruiken en de afstand tussen het radioactieve materiaal en de gebruiker te maximaliseren om de blootstelling aan straling te beperken. Deze aspecten zijn in het bijzonder belangrijk tijdens de tweede helft van het protocol (hydrogenering en zuivering) waarin de gebruiker de oplossing manueel in de waterstof moet injecteren, de fracties verzamelen, de droogprocedure opstellen, het product opnieuw oplossen in buffer en filteren. Tijdens de filterstap is het gemakkelijk om een groot aantal radioactieve stoffen in de muren van de injectieflacons te verliezen. Zo is het belangrijk om te proberen alle vloeistof te verzamelen alvorens te filtreren. Het gebruik van een grotere hoeveelheid buffer om op te lossen kan de opbrengst van herstel verbeteren, maar het gebruik ervan wordt ontmoedigd omdat het een groter volume op de HPLC vereist, waardoor de piek het volume van de uiteindelijke dosis verbrengt en verhoogt.
Om een probleem op te lossenOm de procedure te optimaliseren is het belangrijk om de opbrengsten van elke stap bij te houden. Voor de meeste stappen wordt dit gewoon gedaan door de hoeveelheid radioactiviteit te meten vóór en na elke stap. In het geval van de reactie kunnen de opbrengsten worden berekend door kwantificering van de HPLC pieken. Tabel 1 in de resultaten sectie toont de typische opbrengsten voor elke stap. Tabel 2 hieronder bevat veel van de vaak geconfronteerde fouten met mogelijke redenen voor het falen en hoe u ze kunt corrigeren.
Ten slotte, hoewel de procedure die hier wordt aangetoond, specifiek is voor de synthese van [18F] 3F4AP, zijn de algemene werkstromen en veel van de individuele stappen gebruikelijk voor de synthese van andere verbindingen 17 . In dit artikel hebben we ook de typische QC-tests die op een PET-tracer zijn uitgevoerd, aangetoond.
Disclosures
Auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit project werd ondersteund door subsidies NIH / NIBIB 1K99EB020075 aan Pedro Brugarolas en een Innovation Fund Award van de Chicago Innovation Exchange naar Brian Popko en Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko wordt dankbaar erkend voor zijn mentorschap en financiële steun voor het project. Prof. Chin-Tu Chen en het Geïntegreerde Onderzoeksonderzoek voor Kleine Diervoederonderzoek aan de Universiteit van Chicago worden erkend voor het ruim delen van laboratoriumruimte en -apparatuur. IBA is erkend voor het sponsoren van open toegang van dit artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counter | Pinestar | ||
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , Springer. (2003).
- Phelps, M. E. PET: molecular imaging and its biological applications. , Springer. (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A.
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K.
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , Amer Chemical Soc. (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, Springer Science & Business Media. (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).
![Geautomatiseerde Radiochemische Synthese van [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: Een nieuwe PET Tracer voor het imiteren van demyeliniserende ziekten](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/55537.jpg)
