Summary
Vi demonstrerar den halvautomatiska radiokemiska syntesen av [ 18 F] 3F4AP och kvalitetskontrollprocedurer.
Abstract
3- [18F] fluor-4-aminopyridin, [18F] 3F4AP, är en radiofluorerad analog av det FDA-godkända läkemedlet för multipel skleros 4-aminopyridin (4AP). Denna förening undersöks för närvarande som ett PET-spårämne för demyelinering. Vi har nyligen beskrivit en ny kemisk reaktion för att producera metafluorerade pyridiner bestående av direkt fluorering av en pyridin-N-oxid och användningen av denna reaktion för den radiokemiska syntesen av [18F] 3F4AP. I den här artikeln demonstrerar vi hur man producerar denna spårare med hjälp av en automatiserad synthesizer och en internt gjord flödeshydrogeneringsreaktor. Vi visar också de standardkvalitetskontrollprocedurer som utförts innan du släpper radiotraceraren för prekliniska djurbildningsstudier. Denna semi-automatiserade procedur kan tjäna som grund för framtida produktion av [ 18 F] 3F4AP för kliniska studier.
Introduction
Förmågan att spåra ett läkemedel med liten molekyl som inte är invasivt i människokroppen har stor potential mot precisionsmedicin. Bland molekylära bildtekniker har positronutsläppstomografi (PET) många gynnsamma egenskaper: PET-detektorns höga känslighet möjliggör detektering och kvantifiering av mycket små mängder radioaktivt material och skannerns egenskaper möjliggör en korrekt geografisk kartläggning av läkemedelslokalisering 1 , 2 , 3 . Till exempel tillåter PET detektion och lokalisering av tumörer och metastaser baserat på upptagningsnivån av en radioaktiv glukosanalog, [ 18 F] FDG 4 . PET kan också tillhandahålla lokalisering och kvantifiering av specifika hjärnreceptorer och deras beläggning som kan vara värdefull för att diagnostisera och förstå neurologiska och psykiatriska störningar 5 . För att utvecklasEn PET-spårämne med liten molekyl, måste föreningen av intresse märkas med en positronemitterande isotop, typiskt 11 C eller 18 F. Mellan dessa två radioisotoper har 18 F en längre halveringstid (109 min vs 20,3 i 11 C) , Vilket möjliggör multidos och offsite produktion. Ändå kan lägga 18 F till en molekyl vara utmanande. 18 F-märkning kräver snabba reaktioner som är kompatibla med automatisering som lindrar kemisten av direkt hantering av aktiviteten och mottagande av högabsorberade strålningsdoser.
Vi har nyligen beskrivit användningen av pyridin-N-oxider som prekursorer för fluorering av pyridiner och användningen av denna kemi i den radiokemiska syntesen av [18F] 3F4AP6, en radiofluorerad analog av det FDA-godkända läkemedlet för multipel skleros, 4- Aminopyridin (4AP) 7 , 8 , 9 . thÄr en ny radiotracer undersöks för närvarande som en PET-spårare för demyelinering 10 , 11 , 12 . I denna videoartikel visar vi den halvautomatiska syntesen av denna förening med användning av en IBA Synthera Synthesis Unit (hädanefter benämnd "syntetiseraren") och en egenhaltig hydreringsanordning. Syntesen är baserad på reaktionen visad i figur 1 . Förberedelse för proceduren tar cirka 1 h, radiomärkning och rening 1,5 h och kvalitetskontrollprocedurer 0,5 h.
Protocol
FÖRSIKTIGT: Alla förfaranden som innebär användning av radioaktiva material måste godkännas av det lokala strålskyddssäkerhetsverket. Vid arbete med radioaktiva material bära en labrock och personliga strålningsmärken. Använd alltid två lager av handskar och kontrollera händerna med en Geiger-räknare efter varje steg som innebär att hantera radioaktivitet. Om handskarna är förorenade med radioaktivitet kassera och byt ut ytterhandskar. Använd lämplig avskärmning, minimera tiden i kontakt med strålkällan och maximera avståndet.
1. En vecka före experiment: Framställning av material
- Hämta [ 18 F] 3F4AP-sekvens: Synthera-användare kan logga in i användardatabasen (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) och ladda ner sekvensfilen för 3F4AP. Användare av andra syntetisatorer kan behöva skriva sitt eget skript baserat på stegsekvensen. Bläddra igenom den annoterade sekvensen för att bli bekant med sTeps involverade i syntesen.
- Se till att det finns tillräckligt med gas för syntesen. Syntetiseraren kräver komprimerad gas, antingen helium eller kväve. Det kräver också> 75 psi tryckluft. Kontrollera att trycket ligger inom rekommenderat av tillverkaren.
- Förbered HPLC mobilfas: förbered 1 liter 50 mM natriumfosfat och 10 mM trietylamin. Använd pH-mätaren för att justera pH till 8,0 ± 0,1 genom att tillsätta droppvis mättad natriumhydroxid under omröring. Filtrera lösningen genom ett 0,22 μm flask-filter och tillsätt 5% volym etanol.
- Torrt glasvaror i ugnen över natten.
2. Experimentdag: Före ankomst av Fluor-18
- Använd 1 ml sprutor, fyll in reagensflaskor med lämpliga reagens. För ampuller 2 och 3 använd ugnstorkade ampuller och vattenfria lösningsmedel hållna under argon. Täta injektionsflaskorna med krymptätningar med hjälp av en brännare.
- Fyll ampull 1 (11 mm diameter / 2 ml volym viAl) med 400 | il TBA-HCO3 + 800 | il acetonitril (MeCN).
- Fyllflaskan 2 (13 mm / 4 ml flaska) med 50 μl prekursorlösning 1,0 mg / ml + 450 μl MeCN.
- Fyll ampull 3 (11 mm / 2 ml ampull) med 500 | jL MeCN.
- Fyll ampull 4 (13 mm / 4 ml ampull) med 4 ml 0,2% oxalsyra i metanol (MeOH).
- Konditionera QMA (stark anjonbyte) och Alumina-N fastfas extraktionspatroner. Använd en 10 ml spruta, passera 5 ml 8,4% NaHCO 3 dropwise genom QMA följt av 5 ml ultralätt avjoniserat typ I vatten (18,2 ΜΩ • cm vid 25 ºC). Passera 5 ml ultralätt vatten droppvis genom Alumina-N-patron följt av 5 ml MeOH + 0,2% oxalsyra.
- Slå på HPLC och sätt C-18 kolonnen med 4 ml per min mobil fas i 30 minuter.
- Ladda en ny katalysatorkassett på hydreringspatronhållaren och starta ett flöde på 0,5 ml / min 100% MeOH. SEt väteregulatorn till 50 psi och låt patronen stå i 15 minuter ( Figur 2 ).
- Montera den integrerade fluidprocessorn (IFP) genom att införa injektionsflaskorna 1 till 4 i sina positioner, fästa patronerna och uppsamlingsflaskan som visas i figur 3 . Fäst en injektionsflaska med en ventilationsnål till hydrogenatorns utgångsledning.
- Starta synthesizerprogrammet. Ange inloggning och lösenord. Utför pre-run kontroller på synthesizer enligt tillverkarens instruktioner.
- Klicka på "Sekvenser" och sedan "Öppna" för att ladda 3F4AP-sekvensen.
- Ladda IFP genom att klicka på "Ladda" -knappen på skärmen. Skriv ett filnamn för körningen och starta sekvensen genom att klicka på "Start". (Den automatiska synthesizeren pausar automatiskt innan 18 F-laddningssteget.)
- Titta när syntetiseraren går igenom rutinens självkontroll (steg 1 i sekvensen). Titta på screeN för att säkerställa att det inte finns några varningar eller larm. Var uppmärksam på ljud som syntetiseraren spolar linjer och förvärmer reaktionskärlet som förberedelse för körningen. Temperaturindikatorn bör stiga och stanna vid 65 ºC. Vänta på signalen (auditiv pip) som indikerar att synthesizern är klar för 18 F-överföringen.
3. Experimentdag: 18 F-märkning
- Överför den önskade mängden cyklotronproducerad 18 F från cyklotronmålet till 18 F-ampull. Verifiera mängden radioaktivitet och registrera den med leveranstiden.
OBS! Om du inte använder en direktlinje för 18 F - överföring, använd en förfylld spruta med en nål som är fäst för att överföra aktiviteten till flaskan genom septum. Mängden startradioaktivitet beror på gränserna som fastställts av strålningssäkerhetskontoret och önskad mängd slutspårare. Typiska mängdintervall mellan 50 och 500 mCi. - Övervaka syntesens progression genom den automatiska sekvensen på datorskärmen.
- Se överföringen 18 F från flaskan på QMA i 90 s. Efter trapping 18 F - på QMA elueras den med TBA-HCO 3- lösning (injektionsflaska 1). (Del två i sekvensen)
- Övervaka tryck- och temperaturspår på syntetiseraren medan TBA 18 F torkas under reducerat tryck (5 kPa) och uppvärmning (100 ºC), följt av ytterligare torknings- och nedkylningssteg. (Del 3 i sekvensen)
- Titta på överföringen av vattenfri MeCN (flaska 3) och prekursorlösning (flaska 2) till reaktorn och hur den reagerar i 1 min vid rumstemperatur. Lösningen ska vara färglös eller mycket svag gul. (Del 4 i sekvensen)
- Se överföringen av oxalsyraLösning (flaska 4) till reaktorn. Titta när lösningen är tryck överförd från reaktorn genom aluminiumoxid-N-patron till slutproduktens flaska. (Del 5 i sekvensen)
- I slutet av sekvensen skriv ut rapporten, skjut ut IFP, stäng av gasbehållare och stäng programvaran.
- Medan du först fastställer proceduren, mäter du radioaktiviteten i aluminiumoxid-N-patronen och uppsamlingsflaskan genom att separat införa patronen och ampullen i doskalibratorn. Spela in aktiviteten och tidpunkten för mätningen. Placera den använda patronen i en blyfri avfallsbehållare. Placera injektionsflaskan i en avskärmad behållare för transport till nästa steg.
- Använd en 1 ml spruta med en 2-tums nål, och överför ca 100 μL prov av mellanproduktlösningen manuellt till en standard HPLC-ampull för kvalitetskontroll. Injicera 10 μL av detta prov i HPLC för att utvärdera renheten och Interme identitetDiatförening.
OBS: HPLC-betingelser: XDB 5 | im, 9,4 x 250 mm C18 kolonn. Flöde 4 ml / min. Mobilfas (50 mM Na2HP04, 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min.
4. Experimentdag: Hydrogenering
FÖRSIKTIGT: Injektion av produkten i hydrogenatorn måste utföras med lämpliga skyddsåtgärder. Vätgasen måste hanteras ordentligt och ventileras.
OBS: Hydrogeneringsreaktorn kan anslutas i stället för HPLC-kolonnen på syntetiseraren och regleras med hjälp av synthesizerprogrammet.
- Ställ in hydrogenatormängden vid 0,5 ml / min genom att starta syntetiserings-HPLC-sekvensen. Manuell inställning av vätetryck till 50 psi.
- Efter avslutning av märkning och släckningssteg kommer syntetiseraren att överföra mellanproduktlösningen till hydrogenator / HPLC-slinga.
- När den radioaktiva toppen visas på HPLC-programvaran växlar uppsamlingsventilen för att samla produkten. Mät radioaktiviteten hos den råa produkten med en doskalibrator.
OBS: Råprodukten ska injiceras i ett automatiserat HPLC-system inuti en hetcell. Efter rening uppsamlas den slutliga produkten och doseras sedan in i en aseptisk ISO-klass 5-laminär luftflödes varmcell enligt USP och FDA-föreskrifter.
5. Experimentdag: Rening och beredning av dosen
- Injicera råprodukt i HPLC och använd den automatiska fraktionssamlaren för att samla fraktionerna motsvarande den slutliga produkttoppen. Varje rör innehåller 0,66 mL lösning.
OBS: HPLC-betingelser: XDB 5 | im, 9,4 x 250 mm C18 kolonn. Flöde 4 ml / min. Mobilfas (50 mM Na2HP04, 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min. Samla 4-15 min. - Mät radioaktiviteten hos varje fraktion med en dos kalibrator och spela in den. Kombinera fraktionerna med högsta mängdS av radioaktivitet (typiskt rör 14-18).
- Rita produktlösningen med en 10 ml spruta och passera provet genom 0,22 μm filter i en steril flaska. Anteckna mängden radioaktivitet, slutet på syntestid och lösningsvolym på flaskans etikett. Detta är slutdosen för injektion. Lägg åt sidan ~ 0,8 ml av lösningen för kvalitetskontroll.
6. Experimentdag: Kvalitetskontroll (QC) -test
- Innan dosfrisättning:
Kontrollera dosen genom blyskyddat glas. Lösningen måste vara klar, färglös och fri från partikelformiga ämnen. - Radiochemisk identitet:
- För RadioTLC: placera en droppe av provet på en TLC-platta sida vid sida med referensstandarden. Kör TLC-plattan på en TLC-kammare med användning av 95% MeOH: 5% ättiksyra. Visualisera referensstandarden under UV-belysning och markera dess position med penna.
- Tape TLC-plattan till scenen i radioTLC-scannanEr och rekordtid på toppen. Rf- värdena i referensstandarden och den radioaktiva toppen måste matcha inom 5%.
- För RadioHPLC: kör 10 μl av dosen med och utan referensstandarden på HPLC. Retentionstiden för referensstandarden och den radioaktiva toppen måste matcha. En enda samlingsspids måste ses på spikprovet.
- För radiokemisk renhet: mäta området under kurvan för radioHPLC och radioTLC-måltopparna. Måltoppens område måste vara> 95% av arean för alla radioaktiva toppar kombinerat.
- För den specifika radioaktiviteten: beräkna den specifika radioaktiviteten som mängden radioaktivitet i toppen (mätt i steg 5.2) över massmängden bestämd från området under kurvan för UV HPLC-spåret med användning av en förutbestämd kalibreringskurva. Den specifika radioaktiviteten måste vara högre än 50 mCi / μmol.
- För analys av resterande lösningsmedel: mäta mängden resterande solvensTs (MeCN, MeOH) i dosen med användning av gaskromatografi. Lösningsmedelsnivåerna måste vara <0,04% för acetonitril och <3000 ppm för metanol. Mängden EtOH måste vara mindre än 10% vikt / volym.
- För det sterila filterintegritetstestet (bubbelpunkt): Anslut filtret som används i steg 5.3 till en kväveförsörjning utrustad med en tryckregulator och nedsänk nålen i vatten. Öppna gasventilen gradvis medan du tittar på tryckmätaren. Filtret ska stå emot tryck upp till 50 psi utan att spränga, vilket framgår av bristen på bubblor från nålen. Öka trycket bortom 50 psi tills en ström av bubblor kommer ut ur nålen. Spela in detta tryck, det är sprängtrycket och det måste vara> 50 psi.
- För halveringstiden för radionuklid: mäta produktens radioaktivitet vid två tidspunkter ≥ 10 min från varandra i en doskalibrator. Beräkna halveringstiden med hjälp av ekvationen nedan. Halveringstiden måste överensstämma med 18 F till 5 minuter (109 ± 5 min):
T ½ beräknad = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
Där t är intervallet mellan mätningar och A1, A2 mäts aktiviteten vid varje tidpunkt. - För den radionuklidiska identiteten och renheten: erhålla y-strålspektrumet för ett prov av produkten med användning av en gammateller. Spektret bör uppvisa en enda fotostopp vid en energi av 511 keV. Det borde inte finnas några andra fotopunkter i spektret.
- För endotoxinanalysen: mäta endotoxinnivåerna med hjälp av ett LAL-kromogent endotoxin-kvantitativtest. Endotoxinhalter måste vara <1,75 EU / mL för en utspädd produkt med en slutprodukt på 10 ml.
- Dokumentera resultaten från varje QC-test. Släpp dosen endast för djurstudier om alla prov har passerat.
- Frisättning efter dosering:
För sterilitetstestet: tillsätt ett prov av dosen till både flytande tioglykolat och tryptikasSojabuljong. Ingen tillväxt måste ses på media efter 14 dagar.
7. Experimentdag: Beräkningar (Tabell 1)
- För det icke-sönderfallskorrigerade radiokemiska utbytet (ndc RCY): beräkna ndc RCY som mängden radioaktivitet i slutprodukten över utgångsradioaktiviteten.
- För radiomärkningseffektiviteten: beräkna märkningsutbytet som förhållandet mellan radioaktivitet i uppsamlingsflaskan över radioaktivitet i aluminiumoxid-N-patronen (ej inkorporerad [ 18 F] F-) och uppsamlingsflaskan.
- För hydrogeneringsutbytet: beräkna hydrogeneringsutbytet som mängden radioaktivitet i den önskade toppen över radioaktiviteten injicerad i HPLC.
- För filtreringsförlusterna: Förlora filtreringsförlusten som den radioaktivitet som återstår i filtret och sprutan över radioaktivitet före filtrering.
Representative Results
Den radiokemiska syntesen av [18F] 3F4AP innefattar två steg ( Figur 1 ). Det första steget utförs på ett helt automatiserat sätt med hjälp av syntesenheten ( Figur 3 ). Detta kassettbaserade system använder fyra reagensflaskor och en reaktionsflaska och har datorstyrda ventiler som tillåter överföring och blandning av reagens såväl som uppvärmning, trycksättning och evakuering av reaktorn. Dessutom stöder den vanliga patronerna för fastfasutsugning för separation av reagens. Datorgränssnittet tillåter användare att skriva och modifiera skript för att kunna sköta sina egna synteser. I fallet med [18F] 3F4AP består syntesproceduren av fem grundläggande delar. I den första delen utförs syntetiseraren självkontroll, föruppvärmer reaktorn och väntar på operatörens signal att 18 F är klar. Under den andra delen överförs [18F] fluoriden froM 18 F-ampullen in i anjonbytarkassetten och elueras från patronen till reaktorn med användning av en lösning av tetrabutylammoniumbikarbonat. Den tredje delen torkar syntetiseraren azeotropiskt [18F] fluoriden under vakuum för att göra den reaktiv mot nukleofil förskjutning. I den fjärde delen läggs prekursorn automatiskt till reaktorn där den reagerar med 18F - för att alstra den märkta föreningen. Slutligen släckes reaktionen genom tillsats av 0,2% oxalsyra i metanol, vilket förhindrar basförstärkt sönderdelning av produkten och den slutliga lösningen trycks överförs till uppsamlingsflaskan efter att ha passerat genom en aluminiumoxid-N-patron som fäller eventuella Oreagerad fluorid.
Efter det att märkningsteget är klart kan ett litet prov tas för kvalitetskontroll. Körning av ett prov på HPLC ger bekräftelse på att märkningsteget fungerade och en estimationPå den radiokemiska renheten ( Figur 4 ). Från UV-spåret på HPLC kan massmängden av produkten också beräknas med användning av en förutbestämd kalibreringskurva.
Medan HPLC körs i kvalitetskontroll, utförs det andra reaktionssteget, reduktion av N-oxid- och nitrogrupperna. För att göra detta injiceras den märkta produkten automatiskt i en in-house hydrogeneringsanordning baserat på metoden som publiceras av Yoswathananont et al. 13 ( figur 2 ). Denna anordning består av en HPLC-pump och en komprimerad vätsketank ansluten till flödeshärdningsanordningen genom ledningar utrustade med backventiler för att förhindra återströmning. Produkten drivs av HPLC-pumpen och blandas med väte i en T-formad mixer. Denna blandning passeras därefter genom en liten patron innehållande 10% Pd / C katalysator på en fast bärare. Efter att ha passerat genom cataDen reducerade produkten uppsamlas sedan i små fraktioner.
Efter hydrogenering transporteras den råa produkten och sprutas manuellt i HPLC för rening av slutprodukten ( Figur 5 ). Den mobila fasen hos HPLC har valts för att vara kompatibel med djurinjektion. De toppar som motsvarar produkten uppsamlas sedan och filtreras steriliseras för att erhålla slutdosen.
Innan dosen frisätts för PET-bildningsstudier, utförs kvalitetskontrolltest. Dessa test utförs för att säkerställa att spårämnet är den kemiska enheten som den ska vara och att den är säker för injektion. Några av dessa test kan inte vara nödvändiga för injektion i djur, men det rekommenderas generellt att följa riktlinjerna för användning av människor. Genom att göra så säkerställs produktens kvalitet, vilket ökar förtroendet för resultaten och starkt ansenetIlitates framtida övergång till tillverkning av produkten för human injektion.
Tabell 1 innehåller de typiska syntesparametrarna innefattande initial mängd radioaktivitet, initial mängd prekursor, utbyte för varje steg, specifik aktivitet, filtrering förlorar etc. Dessa parametrar är användbara felsökning av tillfälliga fel och framtida optimering av proceduren.
Figur 1. Reaktionsschema. Den radiokemiska syntesen består av märkning vid 19 F / 18 F utbyte följt av palladiumkatalyserad hydrogenering. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" />
Figur 2. Hydrogeneringssystem. Schematisk av enheten. Denna enhet är baserad på publiceringen av Yoswathananont et al. (Ref 13).
Figur 3. Schema av syntetiseringsintegrerad fluidprocessor (IFP) och reagenser. IFP innehåller fyra reagensflaskor, en QMA-patron och en reaktionsflaska. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4. UV- och radioHPLC-spårämnen för mellanprodukt. 3-fluor-4-nitropyridin-N-oxid har en karakteristisk absorption vid 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 5. UV- och radioHPLC-spårämnen för slutprodukt. 3-fluor-4-aminoopyridin absorberas vid en 254 nm. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
| Begrepp | Medelvärde (n = 4) | SD | kommentarer |
| Inledande 18 F-aktivitet (mCi) | 148,0 | 44,9 | Början av syntesen |
| Föregångarmängd (μg) | 50 | Använd 50 μL 1,0 mg / ml lager | |
| Aktivitet kvar i QMA (mCi) | 3,0 | 1,7 | Mätt vid slutet av märkningsteget |
| Radiolabelande utbyte | 29,7% | 6,3% | Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) |
| Radiokemisk renhet (HPLC-1) | > 98% | Från HPLC-1 QC | |
| Spec. spela teater. Mellanprodukt (mCi / μmol) | 122,9 | 29,7 | Från HPLC-1 med kalibreringskurva |
| Hydrogeneringsåtervinning (dc) | 74% | 9,0% | Korrigeras för förfall |
| HPLC-radiokemisk renhet (HPLC-2) | 90,7% | 2,9% | Beräknat från HPLC-2 |
| Torkningsverkningsgrad | > 98% | Korrigeras för förfall | |
| Filtrering av återhämtning | 93,5% | 1,7% | Korrigeras för förfall |
| Dosvolym (ml) | 3,3 | Samla fraktioner med högsta radioaktivitet | |
| Spec. spela teater. Slutprodukt (mCi / μmol) | 75,5 | 30,0 | Från HPLC-3 med kalibreringskurva |
| Syntesverkningsgrad | 8,5% | 3,6% | Korrigerande icke-sönderfall |
| Syntestid (min) | 104 | 11,2 |
Tabell 1. Radiochemiska syntesparametrar.
| Vanliga problem | Potentiella skäl och lösningar |
| [18F] fluorid elueras inte effektivt från QMA | · TBA-HCO 3 bereddes inte korrekt. Se till att koncentrationen är tillräcklig. |
| · Det finns läckor på TBA-HCO 3- ampullen. Se till att krymptätningen är tätt och septumet inte genomborras innan du installerar det på IFP. | |
| · TBA-HCO 3 är inte i gott skick. Beställ en ny sats. | |
| Märkning avkastning är låg | · Det finns fukt i prekursorlösningen. Torr föregångare och lösningsmedel. |
| · Temperaturen är för låg. | |
| Reaktionslösningen är gul | · Produkten sönderdelas på grund av basen. Använd mindre TBA-HCO 3 . |
| · Det finns tOj mycket föregångare. Använd mindre precursor. | |
| · Det finns för litet lösningsmedel för mängden 18 F - . Använd mer lösningsmedel. | |
| Ytterligare toppar på radioHPLC | · Nitrogruppen ersätts: reducera reaktionstemperaturen eller förkorta reaktionstiden. |
| Hydrogeneringsreaktionen fungerar inte | · Katalysator är inte bra. Använd en ny patron |
| · Flödet är för snabbt och tillåter inte tillräcklig kontakt mellan katalysator och substrat. Minska flödet. | |
| · Vattentrycket är för lågt. Öka H 2 -trycket. | |
| Vätgastrycket ökar dramatiskt under proceduren | · Kassettintegriteten är äventyrad och solidt stöd är igensatt linjerna. Stoppa flödet och stäng av gasen. Låt radioaktivitet förfallna. Ta bort katalysatorkassetten och spola systemet. Sätt enEw patron. |
| Hydrogeneringsutbytet är lågt | · För många föroreningar som konkurrerar om katalysatorn (MeCN, oxalsyra). Minska mängden orenheter eller öka prekursorns massa (Varning: ökande prekursor mängd minskar specifik aktivitet). |
| Återvinning av radioaktivitet från hydreringssteget är låg | · Det finns läckage i systemet. Kontrollera läckage och bakflöde i väteledningen. |
| · Förening är defluorinerande i reaktorn. Utvärdera olika reaktionsbetingelser (tryck, temperatur, flöde etc. ). | |
| För mycket radioaktivitet förloras under filtrering | · Våt filtret före användning. |
| · Använd filter med en lägre dödvolym. | |
| Slutproduktens topp på HPLC ser bred ut | · För mycket volym injicerad. Injicera lägre amount. Använd kolonn med större diameter. |
| · Kolonnen är inte väl konditionerad. Villkor kolumnen för minst 30 kolonnvolymer. | |
| · Den mobila fasens pH är låg. Se till att pH ≥ 8. | |
| · Kolumn är inte i gott skick. Byt kolumn. Använd kolonn kompatibel med basiskt pH. |
Tabell 2. Felsökningsguide.
Discussion
Förberedelsen av PET-spårämnen kräver effektiv märkning med minimal användarintervention för att minimera strålningsexponering 14 . Här beskrivs det första halvautomatiserade förfarandet för den radiokemiska syntesen av [ 18 F] 3F4AP, en PET-spårare som för närvarande undersöks för avbildning av demyelinering. Denna halvautomatiserade metod producerar radiotraceraren med hög renhet och tillräcklig specifik aktivitet för djurstudier. Tidigare metoder för syntesen av denna förening åberopade manuell syntes 6 , vilken väsentligt begränsar mängden radioaktivt spårämne som kan produceras. Att ha en automatiserad metod för syntesen ger också mer reproducerbara utbyten och gör det lättare att överföra proceduren till andra laboratorier med liknande utrustning. Framtida insatser för att helt automatisera förfarandet kommer att vara avgörande för produktionen av spårämnet i stora mängder för studier hos stora djur eller människor.
19 F för 18 F för att införliva radioisotopen i molekylen av intresse. Fördelarna med denna reaktion är att den är snabb och producerar nästan uteslutande den önskade produkten utan att behöva utföra ett potentiellt långt reningssteg för att avlägsna överskott av prekursor. En begränsning av användning av fluoridbytarmärkningreaktioner såsom den som användes här är att på grund av den ursprungliga massan av kall förening kan den slutliga specifika aktiviteten definierad som mängden radioaktivitet i mCi över mängden förening i μmol vara begränsad. Under våra standardförhållanden, som börjar med 100-200 mCi av 18 F och 50 μg prekursor, är den typiska specifika aktiviteten vid slutet av syntesen upp till 100-200 mCi / μmol, vilket verkar vara tillräcklig för prekliniska PET-bildningsstudier . Den specifika aktiviteten kan dock förbättras genom att startmängden ökas för 18 F - 15 , 16 .
Som med alla radiokemiska synteser av PET-spårämnen är det viktigt att arbeta snabbt för att minimera radioaktivt sönderfall. Det är också viktigt att minimera tiden som hanterar det radioaktiva materialet, använd lämplig avskärmning och maximera avståndet mellan det radioaktiva materialet och användaren för att minimera strålningsexponeringen. Dessa aspekter är särskilt viktiga under andra halvan av protokollet (rening och kvalitetskontroll) där användaren manuellt måste injicera lösningen i HPLC, samla fraktionerna och filtrera slutprodukten.
Som med alla radiokemiska synteser av PET-spårämnen är det kritiskt att arbeta snabbt för att mInimera radioaktivt förfall. Det är också viktigt att minimera tiden som hanterar det radioaktiva materialet, använd lämplig avskärmning och maximera avståndet mellan det radioaktiva materialet och användaren för att minimera strålningsexponeringen. Dessa aspekter är särskilt viktiga under andra halvan av protokollet (hydrogenering och rening), där användaren manuellt måste injicera lösningen i hydrogenatorn, samla fraktionerna, ställa in torkningsförfarandet, återupplösa produkten i buffert och filtrera den. Under filtreringssteget är det lätt att förlora en stor mängd radioaktivt material i flaskans väggar. Således är det viktigt att försöka samla all vätska före filtrering. Användning av en större mängd buffert för att lösa upp kan förbättra utbytet av återvinning, men dess användning är avskräckt eftersom det kommer att kräva injicering av en större volym på HPLC, vilket medför att toppen ökar och ökar volymen av slutdosen.
För att felsöka enFör att optimera förfarandet är det viktigt att hålla koll på avkastningen i varje steg. För de flesta steg görs detta enkelt genom att mäta mängden radioaktivitet före och efter varje steg. I fallet med reaktionen kan utbytet beräknas genom kvantifiering av HPLC-topparna. Tabell 1 i resultatavsnittet visar de typiska utbytena för varje steg. Tabell 2 nedan visar många av de vanliga misslyckandenna med potentiella orsaker till felet och hur man åtgärdar dem.
Slutligen, även om proceduren som visas här är specifik för syntesen av [18F] 3F4AP, är det allmänna arbetsflödet och många av de enskilda stegen vanliga för syntesen av andra föreningar 17 . I denna artikel visade vi också de typiska QC-tester som utfördes på någon PET-spårare.
Disclosures
Författare har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Detta projekt stöddes av bidrag NIH / NIBIB 1K99EB020075 till Pedro Brugarolas och ett Innovation Fund Award från Chicago Innovation Exchange till Brian Popko och Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko är tacksamt tacksam för hans mentorskap och ekonomiskt stöd till projektet. Prof. Chin-Tu Chen och Integrated Small Animal Imaging Research Resource vid University of Chicago erkänns för generöst att dela laboratorierum och utrustning. IBA är bekräftad för att sponsra öppen tillgång till denna artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counter | Pinestar | ||
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , Springer. (2003).
- Phelps, M. E. PET: molecular imaging and its biological applications. , Springer. (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A.
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K.
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , Amer Chemical Soc. (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, Springer Science & Business Media. (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).
![Automatiserad radiokemisk syntes av [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: En ny PET-tracer för bildbehandling av demyeliniserande sjukdomar](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/55537.jpg)
