Summary
Vi demonstrerer den halvautomatiske radiokemiske syntese af [ 18 F] 3F4AP og kvalitetskontrolprocedurer.
Abstract
3- [18F] fluor-4-aminopyridin, [18F] 3F4AP, er en radiofluoreret analog af det FDA-godkendte lægemiddel til multipel sclerose 4-aminopyridin (4AP). Denne forbindelse undersøges for øjeblikket som et PET-spor til demyelinering. Vi har for nylig beskrevet en ny kemisk reaktion til fremstilling af metafluorerede pyridiner bestående af direkte fluorering af et pyridin-N-oxid og anvendelsen af denne reaktion til den radiokemiske syntese af [18F] 3F4AP. I denne artikel demonstrerer vi, hvordan man fremstiller denne sporingsenhed ved hjælp af en automatiseret syntetisator og en internt gennemstrømmet hydrogeneringsreaktor. Vi viser også de standardkvalitetskontrolprocedurer, der er udført, inden der udsendes radiotracer til prækliniske dyredannelsesstudier. Denne semi-automatiserede procedure kan tjene som grundlag for fremtidig produktion af [ 18 F] 3F4AP til kliniske undersøgelser.
Introduction
Evnen til at spore et lægemiddel med små molekyler, der ikke er invasivt i menneskekroppen, har stort potentiale mod præcisionsmedicin. Blandt molekylære billedteknikker har positronemissionstomografi (PET) mange gunstige egenskaber: PET-detektorernes høje følsomhed tillader detektion og kvantificering af meget små mængder radioaktivt materiale, og scannernes egenskaber tillader præcis rumlig kortlægning af lægemiddellokalisering 1 , 2 , 3 . For eksempel tillader PET detektion og lokalisering af tumorer og metastaser baseret på optagelsesniveauet for en radioaktiv glucoseanalog, [ 18 F] FDG 4 . PET kan også tilvejebringe lokalisering og kvantificering af specifikke hjerne receptorer og deres belægning, der kan være værdifuld til diagnosticering og forståelse af neurologiske og psykiatriske lidelser 5 . For at udvikleEt lille molekyl PET-sporstof, skal forbindelsen af interesse mærkes med en positronemitterende isotop, typisk 11 C eller 18 F. Mellem disse to radioisotoper har 18 F en længere halveringstid (109 min vs 20,3 for 11 C) , Som muliggør multidosis og offsite produktion. Ikke desto mindre kan tilføje 18 F til et molekyle være udfordrende. 18 F mærkning kræver hurtige reaktioner, der er kompatible med automatisering, der lindrer kemikeren af direkte håndtering af aktiviteten og modtager højabsorberede strålingsdoser.
Vi har for nylig beskrevet anvendelsen af pyridin-N-oxider som precursorer til fluorering af pyridiner og anvendelsen af denne kemi i den radiokemiske syntese af [18F] 3F4AP6, en radiofluoreret analog af det FDA-godkendte lægemiddel til multipel sklerose, 4- Aminopyridin (4AP) 7 , 8 , 9 . thEr en ny radiotracer i øjeblikket under undersøgelse som et PET-spor for demyelinering 10 , 11 , 12 . I denne videoartikel demonstrerer vi den halvautomatiske syntese af denne forbindelse ved anvendelse af en IBA Synthera Synthesis Unit (herefter omtalt som "synthesizer") og en internt fremstillet flow-hydrogeneringsanordning. Syntesen er baseret på reaktionen vist i figur 1 . Forberedelse til proceduren tager cirka 1 time, radioaktivt mærkning og rensning 1,5 timer og kvalitetskontrolprocedurer 0,5 timer.
Protocol
FORSIGTIG: Alle procedurer, der involverer brug af radioaktive materialer, skal godkendes af det lokale kontor for strålingssikkerhed. Når du arbejder med radioaktive materialer, skal du have en lab coat og personlige stråle badges. Brug to lag af handsker til enhver tid og kontroller hænderne med en Geiger-tæller efter hvert trin, der involverer håndtering af radioaktivitet. Hvis handskerne er forurenet med radioaktivitet, kasseres og udskiftes ydre handsker. Brug passende afskærmning, minimér tid i kontakt med strålekilden og maksimere afstanden.
1. En uge før forsøg: Forberedelse af materialer
- Download [ 18 F] 3F4AP-sekvens: Synthera-brugere kan logge ind på brugerdatabasen (http://www.iba-radiopharmasolutions.com/products/chemistry) og downloade sekvensfilen til 3F4AP. Brugere af andre synthesizers må muligvis skrive deres eget script baseret på trinets rækkefølge. Gennemse den annoterede sekvens for at blive fortrolig med sTeps involveret i syntesen.
- Sørg for, at der er nok gas til syntesen. Syntetisatoren kræver komprimeret gas, enten helium eller nitrogen. Det kræver også> 75 psi trykluft. Sørg for, at trykket ligger inden for det anbefalede af fabrikanten.
- Forbered HPLC mobil fase: Fremstil 1 L 50 mM natriumphosphat og 10 mM triethylamin. Ved hjælp af en pH-måler justeres pH til 8,0 ± 0,1 ved tilsætning af dråbevis mættet natriumhydroxid under omrøring. Filtrer opløsningen gennem et 0,2 μm flaskefilter og tilsæt 5% volumen ethanol.
- Tør glas i ovnen natten over.
2. Eksperimentdag: Inden Fluor-18 ankommer
- Brug 1 ml sprøjter, fyld reagensflasker med de relevante reagenser. Til hætteglas 2 og 3 anvendes ovntørrede hætteglas og vandfrie opløsningsmidler, der holdes under argon. Sæt hætteglasene med krympepakninger ved hjælp af en krimper.
- Fyld hætteglas 1 (11 mm diameter / 2 ml volumen viAl) med 400 μl TBA-HCO3 + 800 μl acetonitril (MeCN).
- Fyld hætteglas 2 (13 mm / 4 ml hætteglas) med 50 μl prækursoropløsning 1,0 mg / ml + 450 μl MeCN.
- Fyld hætteglas 3 (11 mm / 2 ml hætteglas) med 500 μl MeCN.
- Fyld hætteglas 4 (13 mm / 4 ml hætteglas) med 4 ml 0,2% oxalsyre i methanol (MeOH).
- Tilstand QMA (stærk anionbytning) og Alumina-N fastfase-ekstraktionspatroner. Brug en 10 ml sprøjte til at passere 5 ml 8,4% NaHCO 3 dropwise gennem QMA efterfulgt af 5 ml ultrapertureret deioniseret type I vand (18,2 ΜΩ • cm ved 25 ºC). Pass 5 ml ultrapure vand dropwise gennem aluminium-N patron efterfulgt af 5 ml MeOH + 0,2% oxalsyre.
- Tænd for HPLC og beting C-18 kolonnen med 4 ml pr. Min mobil fase i 30 minutter.
- Indlæs en ny katalysatorpatron på hydrogenatorpatronholderen og start en strøm på 0,5 ml / min 100% MeOH. SEt hydrogenregulatoren til 50 psi og sæt patronen i 15 minutter ( figur 2 ).
- Saml den integrerede væskeprocessor (IFP) ved at introducere hætteglas 1 til 4 i deres positioner, vedhæfte patronerne og opsamlingsflasken som vist i figur 3 . Vedhæft et hætteglas med en ventilationsnål til hydrogenatorens udgangsledning.
- Start synthesizerens software. Indtast login og adgangskode. Udfør forudgående kontrol af synthesizeren i henhold til producentens anvisninger.
- Klik på "Sekvenser" og derefter "Åbn" for at indlæse 3F4AP-sekvensen.
- Indlæs IFP'en ved at klikke på knappen "Load" på skærmen. Indtast et filnavn for kørslen, og start sekvensen ved at klikke på "Start". (Den automatiske synthesizer standser automatisk før 18 F-indlæsningstrinnet.)
- Hold øje med, at synthesizeren går igennem de rutinemæssige selvkontrolstrin (del en af sekvensen). Se på screeN for at sikre, at der ikke er advarsler eller alarmer. Vær opmærksom på lyde, da synthesizeren spyler linjer og forvarmer reaktionsbeholderen som forberedelse til kørslen. Temperaturindikatoren skal stige og forblive ved 65 ºC. Vent til signalet (lydbip), der angiver, at synthesizeren er klar til 18 F-overførslen.
3. Eksperimentdag: 18 F mærkning
- Fjern overførsel af ønsket mængde cyklotronproduceret 18 F fra cyclotronmålet til 18 F hætteglas. Kontroller mængden af radioaktivitet og optag den med leveringstidspunktet.
BEMÆRK: Hvis du ikke bruger en direkte linje til 18 F-overførsel, skal du bruge en fyldt sprøjte med en nål, der er fastgjort for at overføre aktiviteten til hætteglasset gennem septum. Mængden af startradioaktivitet afhænger af grænserne fastsat af Strålingssikkerhedskontoret og den ønskede mængde slutspor. Typiske mængder mellem 50 og 500 mCi. - Overvåg syntesens progression i hele den automatiserede rækkefølge på computerskærmen.
- Se overførslen 18 F fra hætteglasset til QMA i 90 s. Efter indfangning 18 F - på QMA elueres den med TBA-HCO 3 -opløsning (hætteglas 1). (Del 2 af sekvensen)
- Overvåg tryk- og temperatursporene på synthesizeren, mens TBA 18 F tørres under reduceret tryk (5 kPa) og opvarmning (100 ºC) efterfulgt af yderligere tørring og afkølingstrin. (Del 3 af sekvensen)
- Se overførslen af vandfri MeCN (hætteglas 3) og precursoropløsning (hætteglas 2) til reaktoren, og hvordan det reagerer i 1 min ved stuetemperatur. Opløsningen skal være farveløs eller meget svag gul. (Del 4 af sekvensen)
- Se overførslen af oxalsyreOpløsning (hætteglas 4) til reaktoren. Se da opløsningen er tryk overført fra reaktoren gennem aluminiumoxid-N patron til slutproduktets hætteglas. (Del 5 i sekvensen)
- I slutningen af sekvensen udskriver du rapporten, udskriver IFP'en, lukker gasbeholdere og lukker softwaren.
- Ved først at etablere proceduren måler du radioaktiviteten i aluminiumoxid-N patronen og opsamlingsflasken ved separat indføring af patronen og hætteglasset i dosekalibratoren. Optag aktiviteten og tidspunktet for måling. Anbring den brugte patron i en blybeholder. Anbring hætteglasset i en afskærmet beholder til transport til det næste trin.
- Ved hjælp af en 1 ml sprøjte med en 2 "nål fastgjort, overføres man manuelt ca. 100 μL prøve af mellemproduktopløsningen til et standard HPLC hætteglas til kvalitetskontrol i processen. Indsæt 10 μL af denne prøve i HPLC for at vurdere renheden og Identitet af intermeDiatforbindelse.
BEMÆRK: HPLC betingelser: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 søjle. Flow 4 mL / min. Mobil fase (50 mM Na2HP04, 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min.
4. Eksperimentdag: hydrogenering
FORSIGTIG: Injektion af produktet i hydrogenatoren skal udføres ved hjælp af passende beskyttelsesforanstaltninger. Brintgas skal håndteres korrekt og udluftes.
BEMÆRK: Hydrogeneringsreaktoren kan tilsluttes i stedet for HPLC-søjlen på synthesizeren og styres ved hjælp af synthesizer-softwaren.
- Indstil hydrogenatorstrømmen ved 0,5 ml / min ved at starte syntetiserings-HPLC-sekvensen. Manuel opsætning af hydrogentryk til 50 psi.
- Efter færdiggørelse af mærkning og slukningstrin vil syntetisatoren overføre mellemproduktopløsningen til hydrogenator / HPLC-sløjfe.
- Når den radioaktive top vises på HPLC-software skifte kollektionsventilen for at indsamle produktet. Mål radioaktivitet af råprodukt ved hjælp af en dosekalibrator.
BEMÆRK: Råproduktet skal injiceres i et automatiseret HPLC-system inde i en varmecelle. Efter rensning opsamles det endelige produkt derefter og dispenseres i en aseptisk ISO klasse 5 laminær luftstrøm-hotcelle ifølge USP og FDA regulativer.
5. Eksperimentdag: Rensning og forberedelse af dosen
- Injicer råprodukt i HPLC og brug den automatiserede fraktionskollektor til at samle fraktioner svarende til slutproduktet top. Hvert rør indeholder 0,66 ml opløsning.
BEMÆRK: HPLC betingelser: XDB 5 μm, 9,4 x 250 mm C18 søjle. Flow 4 mL / min. Mobil fase (50 mM Na2HP04, 10 mM TEA, 5% EtOH). Isokratisk 15 min. Saml 4-15 min. - Mål radioaktiviteten af hver fraktion ved hjælp af en dosis kalibrator og optag den. Kombiner fraktionerne med højeste mængdeS af radioaktivitet (typisk rør 14-18).
- Tegn produktopløsningen med en 10 ml sprøjte og send prøven gennem 0,22 μm filter i et sterilt hætteglas. Optag mængden af radioaktivitet, slutningen af syntesetid og opløsningsmængde på hætteglassetiketten. Dette er den endelige dosis til injektion. Sæt til side ~ 0,8 ml af opløsningen til kvalitetskontrolprøvninger.
6. Eksperimentdag: Kvalitetskontrol (QC) test
- Inden dosis frigives:
Undersøg dosis gennem blyafskærmet glas. Opløsningen skal være klar, farveløs og fri for partikler. - Radiochemisk identitet:
- For RadioTLC: Spot en dråbe af prøven på en TLC plade side om side med referencestandarden. Kør TLC-plade på et TLC-kammer ved anvendelse af 95% MeOH: 5% eddikesyre. Visualiser referencestandarden under UV-belysning og markér dens position med blyant.
- Tape TLC-pladen til scenen i radioTLC-scannetEr og optagelsestidspunktet for toppen. Rf- værdierne i referencestandarden og den radioaktive top skal svare inden for 5%.
- Til RadioHPLC: Kør 10 μL af dosen med og uden referencestandarden på HPLC. Retentionstid for referencestandarden og den radioaktive top skal stemme overens. En enkelt coelution peak skal ses på den spiked prøve.
- Til radiokemisk renhed: måle området under kurve for radioHPLC og radioTLC-måltoppene. Måltoppen skal være> 95% af arealet for alle radioaktive toppe kombineret.
- For den specifikke radioaktivitet: Beregn den specifikke radioaktivitet som mængden af radioaktivitet i toppen (målt i trin 5.2) over massebeløbet bestemt fra området under kurven for UV HPLC-sporet ved anvendelse af en forud fastlagt kalibreringskurve. Den specifikke radioaktivitet skal være højere end 50 mCi / μmol.
- Til den resterende opløsningsmiddelanalyse: måle mængden af resterende solvensTs (MeCN, MeOH) i dosen ved anvendelse af gaskromatografi. Opløsningsmiddelniveauerne skal være <0,04% for acetonitril og <3000 ppm for methanol. Mængden af EtOH skal være mindre end 10% vægt / volumen.
- Til den sterile filterintegritetstest (boblepunkt): Tilslut filteret, der blev anvendt i trin 5.3, til en nitrogenforsyning udstyret med en trykregulator og nedsænk nålen i vand. Åben gasventilen gradvis, mens du ser trykmåleren. Filtret skal modstå tryk på op til 50 psi uden at sprænge som det fremgår af manglen på en strøm af bobler fra nålen. Forøg trykket ud over 50 psi indtil en strøm af bobler kommer ud af nålen. Optag dette tryk, det er bursttrykket, og det skal være> 50 psi.
- For halveringstiden for radionuklid: måler produktets radioaktivitet ved to tidspunkter ≥ 10 min. Fra hinanden i en dosis kalibrator. Beregn halveringstiden ved hjælp af ligningen nedenfor. Halveringstiden skal svare til den på 18 F til inden for 5 minutter (109 ± 5 min):
T ½ beregnet = 0.693 t ÷ ln (A 1 / A 2 )
Hvor t er intervallet mellem målinger og A1, A2, måles aktiviteten målt på hvert tidspunkt. - For den radionuklidiske identitet og renhed: opnå y-strålespektret af en prøve af produktet ved anvendelse af en gammatæller. Spektret skal udvise en enkelt foto-top ved en energi på 511 keV. Der bør ikke være andre fotospidser i spektret.
- Til endotoxinanalysen måles endotoxinniveauerne ved anvendelse af en LAL-kromogen endotoxin-kvantitativ test. Endotoxinniveauer skal være <1,75 EU / ml for et 1:10 fortyndet produkt med et slutproduktvolumen på 10 ml.
- Dokumentér resultaterne fra hver QC-test. Frigør kun dosen til dyreforsøg, hvis alle testene er gået.
- Udgivelse efter dosis:
Til sterilitetstesten: Tilsæt en prøve af dosen til både fluidthioglycolat og trypticaseSoja bouillon. Der må ikke ses vækst på medierne efter 14 dage.
7. Eksperimentdag: Beregninger (tabel 1)
- For det ikke-forfaldne korrigerede radiokemiske udbytte (ndc RCY): beregne ndc RCY som mængden af radioaktivitet i slutproduktet over start-radioaktiviteten.
- For radiomærkningseffektiviteten: Beregn mærkning udbytte som forholdet mellem radioaktivitet i opsamlingshætteglaset over radioaktivitet i aluminiumoxid-N patronen (ikke-inkorporeret [ 18 F] F-) og opsamlingshætteglasset.
- For hydrogeneringsudbyttet beregnes hydrogeneringsudbyttet som mængden af radioaktivitet i den ønskede top over radioaktiviteten injiceret i HPLC.
- For filtreringstabet: beregning af filtrering taber, da radioaktiviteten forbliver i filteret og sprøjten over radioaktivitet inden filtrering.
Representative Results
Den radiokemiske syntese af [18F] 3F4AP omfatter to trin ( figur 1 ). Det første trin udføres på en fuldt automatiseret måde ved hjælp af syntesenheden ( figur 3 ). Dette kassettebaserede system bruger fire reagensflasker og et reaktionsflaske og har computerstyrede ventiler, der tillader overførsel og blanding af reagenser såvel som opvarmning, trykning og evakuering af reaktoren. Derudover understøtter den standard fastfase-ekstraktionspatroner til separation af reagenser. Computergrænsefladen giver brugerne mulighed for at skrive og ændre scripts for at kunne køre deres egne syntheser. I tilfælde af [18F] 3F4AP består synteseproceduren af fem basale dele. I den første del udfører synthesizeren selvkontrolstrin, forvarmer reaktoren og venter på operatørens signal, at 18 F er klar. Under den anden del overføres [18F] fluoridet froM 18 F-hætteglasset i anionbyteskassetten og elueres fra patronen til reaktoren under anvendelse af et opløsningsmiddel tetrabutylammoniumbicarbonat. Den tredje del tørrer syntetisatoren azeotropisk [18F] fluoridet under vakuum for at gøre det reaktivt over for nukleofil forskydning. I fjerde del tilføjes precursoren automatisk til reaktoren, hvor den reagerer med 18 F - for at danne den mærkede forbindelse. Endelig afbrydes reaktionen ved tilsætning af 0,2% oxalsyre i methanol, hvilket forhindrer baseprøvet dekomponering af produktet, og den endelige opløsning overføres tryk til opsamlingshætteglasset efter passage gennem en aluminiumoxid-N patron, der fælder nogen Uomsat fluorid.
Når mærkningstrinnet er gennemført, kan der tages en lille prøve for kvalitetskontrol. Kørsel af en prøve på HPLC giver en bekræftelse på, at mærkningstrinnet har fungeret og et estimatPå den radiokemiske renhed ( figur 4 ). Fra UV-sporet på HPLC kan massemængden af produktet også beregnes ved anvendelse af en forud fastlagt kalibreringskurve.
Mens HPLC-kvalitetenskontrollen kører i drift, udføres det andet reaktionstrin, reduktion af N-oxid- og nitrogrupperne. For at gøre dette injiceres det mærkede produkt automatisk i en intern hydrogeneringsanordning baseret på metoden udgivet af Yoswathananont et al. 13 ( figur 2 ). Denne enhed består af en HPLC-pumpe og en komprimeret hydrogentank forbundet til strømningshydrogeneringsanordningen gennem ledninger udstyret med kontrolventiler for at forhindre tilbagestrømning. Produktet skubbes af HPLC-pumpen og blandes med hydrogen i en T-formet blander. Denne blanding ledes derefter gennem en lille patron indeholdende 10% Pd / C katalysator på en fast bærer. Efter at have passeret gennem cataDet reducerede produkt opsamles derefter i små fraktioner.
Efter hydrogenering transporteres råproduktet og injiceres manuelt i HPLC til oprensning af slutproduktet ( Figur 5 ). Den mobile fase af HPLC er blevet udvalgt til at være kompatibel med dyrinjektion. Toppen svarende til produktet opsamles derefter og filtreres steriliseret for at opnå slutdosis.
Inden dosis frigives til PET-billedstudier, udføres kvalitetskontrolforsøg. Disse test udføres for at sikre, at sporen er den kemiske enhed, som den skal være, og at den er sikker til injektion. Nogle af disse tests er muligvis ikke nødvendige til injektion i dyr, men det anbefales generelt at følge retningslinjerne for mennesker. Dette gør det muligt at sikre produkternes kvalitet, hvilket øger tilliden til resultaterne og meget stærktIliterer fremtidig overgang til fremstilling af produktet til human injektion.
Tabel 1 indeholder de typiske synteseparametre, indbefattende initialmængde-radioaktivitet, indledende mængde forstadie, udbytte for hvert trin, specifik aktivitet, filtrering taber osv. Disse parametre er nyttige fejlfinding af lejlighedsvise fejl og fremtidig optimering af proceduren.
Figur 1. Reaktionsskema. Radiochemisk syntese består af mærkning ved 19 F / 18 F udveksling efterfulgt af palladiumkatalyseret hydrogenering. Klik her for at se en større version af denne figur.
Src = "/ files / ftp_upload / 55537 / 55537fig2.jpg" />
Figur 2. Hydrogeneringssystem. Skematisk af enheden. Denne enhed er baseret på udgivelsen af Yoswathananont et al. (Ref 13).
Figur 3. Skema af synthesizer integreret fluid processor (IFP) og reagenser. IFP indeholder fire reagens hætteglas, en QMA patron og et reaktions hætteglas. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4. UV og radioHPLC sporstoffer til mellemprodukt. 3-fluor-4-nitropyridin-N-oxid har en karakteristisk absorption ved 313 nm.E.jove.com/files/ftp_upload/55537/55537fig4large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5. UV og radioHPLC sporstoffer til slutprodukt. 3-fluor-4-aminopyridin absorberes ved en 254 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Koncept | Middel (n = 4) | SD | Kommentarer |
| Indledende 18 F aktivitet (mCi) | 148,0 | 44,9 | Start af syntesen |
| Forløbsmængde (μg) | 50 | Brug 50 μl 1,0 mg / ml stamme | |
| Aktivitet tilbage i QMA (mCi) | 3.0 | 1.7 | Målt i slutningen af mærkningstrinnet |
| Radiolabelling udbytte | 29,7% | 6,3% | Act_collection_vial ÷ (Act_collection_vial + Act_AluN) |
| Radiochemisk renhed (HPLC-1) | > 98% | Fra HPLC-1 QC | |
| Spec. handling. Mellemprodukt (mCi / μmol) | 122,9 | 29,7 | Fra HPLC-1 ved hjælp af kalibreringskurve |
| Hydrogeneringsgendannelse (dc) | 74% | 9,0% | Korrigeret for henfald |
| HPLC-radiokemisk renhed (HPLC-2) | 90,7% | 2,9% | Beregnet fra HPLC-2 |
| Tørreffektivitet | > 98% | Korrigeret for henfald | |
| Filtrering af genopretning | 93,5% | 1,7% | Korrigeret for henfald |
| Dosevolumen (ml) | 3.3 | Saml fraktioner med højeste radioaktivitet | |
| Spec. handling. Slutprodukt (mCi / μmol) | 75,5 | 30,0 | Fra HPLC-3 ved hjælp af kalibreringskurve |
| Synteseffektivitet | 8,5% | 3,6% | Ikke-forfald korrigeret |
| Syntese tid (min) | 104 | 11.2 |
Tabel 1. Radiochemiske synteseparametre.
| Almindelige problemer | Potentielle grunde og løsninger |
| [18F] fluorid elueres ikke effektivt fra QMA | · TBA-HCO 3 blev ikke forberedt korrekt. Sørg for koncentrationen er tilstrækkelig. |
| · Der er lækager på TBA-HCO 3 hætteglasset. Sørg for, at krympeforseglingen er stram, og septumet er ikke gennemboret før installationen på IFP'en. | |
| · TBA-HCO 3 er ikke i god stand. Bestil et nyt parti. | |
| Mærkningsudbyttet er lavt | · Der er fugt i forløberopløsningen. Tør forstadie og opløsningsmidler. |
| · Temperaturen er for lav. | |
| Reaktionsopløsningen er gul | · Produktet dekomponerer på grund af base. Brug mindre TBA-HCO 3 . |
| · Der er tOgså meget forløber. Brug mindre forstadie. | |
| · Der er for lidt opløsningsmiddel for mængden 18 F - . Brug mere opløsningsmiddel. | |
| Yderligere toppe på radioHPLC | · Nitrogruppe erstattes: reducere reaktionstemperaturen eller forkorte reaktionstiden. |
| Hydrogeneringsreaktionen virker ikke | · Katalysator er ikke god. Brug en ny patron. |
| · Flow er for hurtig og tillader ikke tilstrækkelig kontakt mellem katalysator og substrat. Sænk strømmen. | |
| · Hydrogentrykket er for lavt. Forøg H 2 tryk. | |
| Brinttrykket stiger dramatisk under proceduren | · Kassettintegriteten er kompromitteret, og solid støtte er tilstopning af linjerne. Stop strømmen og sluk for gassen. Lad radioaktivitet forfalde. Fjern katalysatorpatronen og skyl systemet. Sæt enEw patron. |
| Hydrogeneringsudbyttet er lavt | · For mange urenheder, der konkurrerer om katalysatoren (MeCN, oxalsyre). Reducer mængden af urenheder eller øg massen af precursor (Advarsel: stigende forstadium vil reducere specifik aktivitet). |
| Genopretning af radioaktivitet fra hydrogeneringstrin er lav | · Der er en lækage i systemet. Kontroller for lækager og tilbagespoling i brintledningen. |
| · Forbindelse er defluorinerende i reaktoren. Vurdere forskellige reaktionsbetingelser (tryk, temperatur, flow osv. ). | |
| For meget radioaktivitet går tabt under filtrering | · Våd filteret før brug. |
| · Brug filter med lavere dødvolumen. | |
| Den endelige produkttop på HPLC ser bredt ud | · For meget volumen injiceret. Injicer lavere amount. Brug kolonne med større diameter. |
| · Søjlen er ikke godt konditioneret. Tilstand kolonnen for mindst 30 kolonnevolumener. | |
| · Den mobile fases pH er lav. Sørg for, at pH ≥ 8. | |
| · Kolonne er ikke i god stand. Udskift kolonne. Brug kolonne kompatibel med basisk pH. |
Tabel 2. Fejlfinding guide.
Discussion
Fremstillingen af PET-sporstoffer kræver effektiv mærkning med minimal brugerintervention for at minimere strålingseksponering 14 . Her beskrev vi den første semi-automatiserede procedure til den radiokemiske syntese af [ 18 F] 3F4AP, en PET-sporingsenhed, der for øjeblikket er under undersøgelse for afbildning af demyelinering. Denne semi-automatiserede metode producerer radiotracer med høj renhed og tilstrækkelig specifik aktivitet til dyreforsøg. Tidligere fremgangsmåder til syntesen af denne forbindelse er baseret på manuel syntese 6 , som signifikant begrænser mængden af radioaktivt sporstof, som kan fremstilles. At have en automatiseret metode til syntesen giver også mere reproducerbare udbytter og letter det at overføre proceduren til andre laboratorier med lignende udstyr. Fremtidige bestræbelser på at automatisere proceduren fuldt ud vil medvirke til produktion af sporen i store mængder til undersøgelser hos store dyr eller mennesker.
19 F til 18 F for at indarbejde radioisotopen i molekylet af interesse. Fordelene ved denne reaktion er, at den er hurtig og næsten udelukkende producerer det ønskede produkt uden behov for at udføre et potentielt langt rensningstrin for at fjerne overskud af forstadie. En begrænsning ved anvendelse af fluorbyttermærkningsreaktioner som den her anvendte er, at på grund af den indledende masse af kold forbindelse kan den endelige specifikke aktivitet defineret som mængden af radioaktivitet i mCi over mængden af forbindelse i μmol være begrænset. Under vores standardbetingelser, der starter med 100-200 mCi på 18 F og 50 μg forstadium, er den typiske specifikke aktivitet ved slutningen af syntesen op til 100-200 mCi / μmol, hvilket synes at være tilstrækkeligt til prækliniske PET-billedstudier . Ikke desto mindre kan den specifikke aktivitet forbedres ved at øge startmængden for 18 F - 15 , 16 .
Som med alle radiochemiske synteser af PET-sporstoffer er det vigtigt at arbejde hurtigt for at minimere radioaktivt henfald. Det er også vigtigt at minimere tiden, der håndterer de radioaktive materialer, brug korrekt afskærmning og maksimere afstanden mellem det radioaktive materiale og brugeren for at minimere strålingseksponeringen. Disse aspekter er særligt vigtige i anden halvdel af protokollen (rensning og kvalitetskontrol), hvor brugeren manuelt skal injicere opløsningen i HPLC, opsamle fraktionerne og filtrere slutproduktet.
Som med alle radiokemiske synteser af PET-sporstoffer er det vigtigt at arbejde hurtigt for at mInimize radioaktivt henfald. Det er også vigtigt at minimere tiden, der håndterer de radioaktive materialer, brug korrekt afskærmning og maksimere afstanden mellem det radioaktive materiale og brugeren for at minimere strålingseksponeringen. Disse aspekter er særligt vigtige i anden halvdel af protokollen (hydrogenering og oprensning), hvor brugeren manuelt skal injicere opløsningen i hydrogenatoren, opsamle fraktionerne, oprette tørringsproceduren, genopløse produktet i buffer og filtrere det. Under filtreringstrinnet er det let at miste en stor mængde radioaktivt materiale i væggene på hætteglassene. Således er det vigtigt at forsøge at samle al væsken forud for filtrering. Anvendelse af en større mængde af puffer til opløsning kan forbedre udbyttet af nyttiggørelse, men dets anvendelse modvirkes, fordi det vil kræve indsprøjtning af et større volumen på HPLC, hvilket får toppen til at udvide og øge volumenet af den endelige dosis.
For at fejlsøge enFor at optimere proceduren er det vigtigt at holde styr på udbyttet af hvert trin. For de fleste trin sker dette blot ved at måle mængden af radioaktivitet før og efter et hvilket som helst trin. I tilfælde af reaktionen kan udbyttet beregnes ved kvantificering af HPLC-toppe. Tabel 1 i resultatafsnittet viser de typiske udbytter for hvert trin. Tabel 2 nedenfor viser mange af de almindeligt forekommende fejl med potentielle årsager til fejlen og hvordan man retter dem.
Endelig er den generelle arbejdsgang og mange af de enkelte trin almindeligt til syntesen af andre forbindelser 17 , selv om proceduren demonstreret her er specifik for syntesen af [18F] 3F4AP. I denne artikel demonstrerede vi også de typiske QC-tests, der blev udført på ethvert PET-spor.
Disclosures
Forfattere har intet at afsløre.
Acknowledgments
Dette projekt blev støttet af tilskud NIH / NIBIB 1K99EB020075 til Pedro Brugarolas og en Innovation Fund Award fra Chicago Innovation Exchange til Brian Popko og Pedro Brugarolas. Prof. Brian Popko er taknemmeligt anerkendt for hans mentorskap og økonomisk støtte til projektet. Prof. Chin-Tu Chen og Integrated Small Animal Imaging Research Resource ved University of Chicago er anerkendt for generøst at dele laboratorierum og udstyr. IBA er anerkendt for at sponsorere åben adgang for denne artikel.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cyclotron produced [18F]fluoride | House supplied/Zevacor | IBA Cyclone 18 | 100-200 mCi |
| Integrated fluid processor for production FLT/FDG | ABX | K-2715SYN | Cassette used for nucleophilic substitution |
| Anhydrous acetonitrile | Janssen | 36431-0010 | Transfer under nitrogen |
| Methanol | Janssen | 67-56-1 | |
| ultrapure water | house supplied | Millipore MilliQ system | |
| TBA-HCO3 | ABX | 808.0000.6 | abx.de |
| QMA | Waters | WAT023525 | Quaternary methyl ammonium: Anion exchange solid phase extraction cartridge for trap and release of 18F- from the target water |
| Sodium bicarbonate | ABX | K-28XX.03 | Prefilled 5 mL syringes |
| Alumina-N | Waters | WAT020510 | Alumina-N solid phase extraction cartridge (for trapping unreacted 18F-) |
| 3-fluoro-4-nitropyridine N-oxide | Synthonix | 76954-0 | Store in desicator. Precursor |
| 3-fluoro-4-aminopyridine | Sigma Aldrich | 704490-1G | Reference standard |
| Oxalic acid | Sigma Aldrich | 75688-50G | |
| Sodium phosphate monobasic | Fisher Scientific | S80191-1 | |
| Triethyl amine | Fisher Scientific | 04885-1 | |
| Ethanol | Decon Labs | DSP-MD.43 | USP |
| Final product vial | ABX | K28XX.04 | |
| Millex Filter Syringe | Millex | SLGVR04NL | |
| 10% Pd/C cartridge | Sigma Aldrich | THS-01111-12EA | |
| 11 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 03-250-618, 06-451-117, or equivalent | |
| 13 mm vials + crimp seals | Fisher Scientific | 06-718-992, 06-718-643, or equivalent | |
| HPLC vials | Fisher Scientific | 03-391-16, 03-391-17, or equivalent | |
| SEMIPREP C18 column | Agilent | 990967-202 | |
| V-vials | Alltech | ||
| Syringes: 1, 3, 10 mL | Fisher Scientific | 14-829-10D, 14-829-13Q, 14-829-18G, or equivalent | |
| Compressed gases: N2, He, H2 | Airgas | UHP N300, UHP HE300, UHP H300, or equivalent | |
| TLC plates | Sigma Aldrich | Z193275, or equivalent | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| Synthera automated synthesizer | IBA SA, Belgium, iba-worldwide.com | Synthera, 250.001 | Automatic synthesis unit |
| In-house hydrogenator | See picture | See text description | |
| Hot cells | Comecer | For manipulating radioactive materials | |
| RadioTLC scanner | Eckert and Ziegler | For handling sterile materials | |
| HPLC | Dionex | Ultimate 3000 | |
| Dose calibrator | Capintec | CRC15 | Or equivalent |
| Gamma counter | Capintec, 7 Vreeland Road, Florham Park, NJ 07932 | CRC 15, PET-CRC25, or equivalent | For measuring radioactivity |
| Personal dosimeters | Packard | Cobra II | For measuring gamma spectrum |
| Personal radiation badges and rings | Atlantic Nuclear | Rados Rad-60 Electronic Dosimeter, or equivalent | |
| Rotavap + vacuum pump | Landauer | ||
| Lead pigs + syringe shields | Heidolph | Or equivalent | |
| Geiger counter | Pinestar | ||
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 + Pancake GM detector, 4801605, 47-1539, or equivalent |
References
- Valk, P. E. Positron emission tomography : basic science and clinical practice. , Springer. (2003).
- Phelps, M. E. PET: molecular imaging and its biological applications. , Springer. (2004).
- Ametamey, S. M., Honer, M., Schubiger, P. A.
- Oriuchi, N., et al. Present role and future prospects of positron emission tomography in clinical oncology. Cancer Sci. 97 (12), 1291-1297 (2006).
- Heiss, W. D., Herholz, K.
- Brugarolas, P., Freifelder, R., Cheng, S. -H., DeJesus, O. Synthesis of meta-substituted [18F]3-fluoro-4-aminopyridine via direct radiofluorination of pyridine N-oxides. Chemical Communications. , (2016).
- Jones, R. E., Heron, J. R., Foster, D. H., Snelgar, R. S., Mason, R. J. Effects of 4-aminopyridine in patients with multiple sclerosis. J Neurol Sci. 60 (3), 353-362 (1983).
- Davis, F. A., Stefoski, D., Rush, J. Orally administered 4-aminopyridine improves clinical signs in multiple sclerosis. Ann Neurol. 27 (2), 186-192 (1990).
- Goodman, A. D., et al. Sustained-release oral fampridine in multiple sclerosis: a randomised, double-blind, controlled trial. Lancet. 373 (9665), 732-738 (2009).
- Brugarolas, P., et al. Abstracts Of Papers Of The American Chemical Society. , Amer Chemical Soc. (2016).
- Brugarolas, P., et al. Development of a PET tracer for MS. J Nucl Med Meeting Abstracts. 55 (1), 1124 (2014).
- Brugarolas, P., et al. Fluorinated 4-aminopyrdines as PET tracers for MS. Journal of Nuclear Medicine. 56, Suppl 3. 493 (2015).
- Yoswathananont, N., Nitta, K., Nishiuchi, Y., Sato, M. Continuous hydrogenation reactions in a tube reactor packed with Pd/C. Chem Comm. (1), 40-42 (2005).
- Stöcklin, G., Pike, V. W. Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography-Methodological Aspects. 24, Springer Science & Business Media. (1993).
- Liu, Z., et al. Preclinical evaluation of a high-affinity 18F-trifluoroborate octreotate derivative for somatostatin receptor imaging. J Nucl Med. 55 (9), 1499-1505 (2014).
- Liu, Z., et al. 18F-trifluoroborate derivatives of [des-arg(10)]kallidin for imaging bradykinin b1 receptor expression with positron emission tomography. Mol Pharm. 12 (3), 974-982 (2015).
- Scott, P. J. H., Hockley, B. G., Kilbourn, M. R. Radiochemical Syntheses, Volume 1: Radiopharmaceuticals for Positron Emission Tomography. , Wiley. (2012).
![Automatiseret radiokemisk syntese af [<sup> 18</sup> F] 3F4AP: En ny PET-tracer til billeddannelse af demyeliniserende sygdomme](https://cloudfront.jove.com/CDNSource/teasers/55537.jpg)
