Summary
여기에서는 폐결핵 병변 및 충치에서 caseum에 대한 약물 결합을 측정하기위한 신속한 평형 투석 (RED) 방법에 대해 설명합니다. 프로토콜은 또한 caseum에 효과적인 대리 대리인 거품 마크로파지 파생 매트릭스와 함께 사용됩니다.
Abstract
결핵성 질병 퇴치는 복잡한 폐 병변의 여러 층을 침투 할 수있는 약물 요법을 필요로합니다. 충치 및 병변의 caseous 코어의 약물 분포는 일반적으로 persisters로 알려진 약물 내성 박테리아의 subpopulations을 보유하기 때문에 특히 중요합니다. 결핵 병변에서 약물 침투를 측정하기위한 기존의 방법 은 생체 분석 또는 영상 기술과 결합 된 비용이 많이 들고 시간 소모적 인 생체 내 약물 동태 학 연구를 필요로한다. Caseum macromolecules에 결합하는 약물의 in vitro 측정은 이러한 결합이 caseum을 통한 약물 분자의 수동 확산을 방해하기 때문에 그러한 기술의 대안으로 제안되었다. 신속한 평형 투석은 혈장 단백질 및 조직 결합 연구를 수행하는 빠르고 안정적인 시스템입니다. 이 프로토콜에서 우리는 빠른 평형 투석 (RED) 장치를 사용하여 excis 인 caseum의 균질 액에 대한 약물 결합을 측정했습니다병변 결핵 감염 토끼 공동 에드. 이 프로토콜은 또한 caseum 대신 사용할 THP-1 식세포로드 지질에서 대리 매트릭스를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 이 caseum / 대리 결합 분석은 결핵 신약 개발에 중요한 도구입니다 및 기타 질병으로 인한 병변이나 농양의 약물 분포를 연구하기 위해 적용 할 수 있습니다.
Introduction
폐결핵병의 치료에는 약물을 여러 종류의 병변으로 효과적으로 분배해야합니다. Necrotic 병변과 충치는 약물 내성 또는 '영구'박테리아의 subpopulations을 보유 caseous 센터가 포함되어 있습니다. 1 , 2 공동 질환은 열등한 치료율과 나쁜 예후와 관련이 있습니다. 3 , 4 이전의 연구들은 정량적 및 영상 기법을 사용하여 caseum을 투과시키는 능력이 약물 종류에 따라 크게 다르다는 것을 보여주었습니다. 그러나 이러한 방법은 느리고 지루한 동물 감염 모델을 사용해야합니다. 생체 외 caseum에 대한 약물 결합을 측정하는 in vitro 분석이 설계되었습니다. 이 결합은 육아종 육아종의 약물 침투와 역으로 상관 관계가 있으며, 따라서예측 도구로 사용됩니다. 7
평형 투석은 혈장 단백질 결합 연구에 대한 금 기본 접근법으로 간주됩니다. 빠른 평형 투석 (RED) 장치는 그러한 분석을 수행하는 데 빠르고, 사용하기 쉽고 신뢰할 수있는 시스템을 제공합니다. 8 장치는 두 가지 구성 요소로 이루어져 있습니다. 일회용, 일회용 멤브레인의 수직 실린더로 분리 된 2 개의 챔버로 구성된 일회용 인서트. 한 번에 최대 48 개의 인서트를 고정 할 수있는 재사용 가능한베이스 플레이트가 있습니다. 투석막은 약물 - 고분자 결합 연구에 이상적인 8kDa 분자량 컷오프 (MWCO)를 가지고 있습니다. 멤브레인 격실의 높은 표면적 대 부피 비율은 신속한 투석 및 평형을 가능하게합니다. 인서트와베이스 플레이트는 최소한의 비특이적 결합을 위해 검증되었습니다. RED 장치와 생물 분석 기술의 결합은 p에서 약물의 결합되지 않은 분율을 정확하게 추정합니다lasma. 8 , 9
원래 혈장 단백질 결합을 측정하기 위해 고안되었지만 RED 장치는 균질 물질을 사용하는 여러 조직 결합 연구에 사용되었습니다. 이 프로토콜에서는 괴사 성 병변과 결핵에 감염된 토끼의 충치에서 절제 된 괴사 잔해 인 caseum에 대한 약물 결합을 측정합니다. 소포 성 물질의 무 세포 및 비 - 혈관 성질은 분석과 양립 가능한 균질 현탁액으로 균질화하는 것을 용이하게한다.
caseum이 생산이 어려우며 오기가 어렵다는 것을 감안할 때, 의정서는 포말 성 대 식세포로 준비된 대용 매트릭스와 함께 사용하도록 검증되었습니다. THP-1 단핵 세포 유래 대 식세포는 올레산으로 유도되어 여러 개의 지질을 축적하여 '거품'을 일으 킵니다. 이러한 지질로드 된 세포를 수확하고우리가 caseum에 대한 대용 물로 사용하는 행렬을 생성하기 위해 처리됩니다. 이 연구는이 대용 행렬에 대한 약물 결합이 caseum에 결합하는 것과 잘 연관되어 육아종 및 충치의 중대한 코어에서 약물 침투를 방해하는 생체 내 과정을 효과적으로 모방 함을 보여주었습니다.
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Protocol
모든 동물 연구는 메릴랜드 주 베데스다의 NIAID (NIH) 기관 동물 보호 및 사용위원회의 승인을 받아 국립 보건원의 실험 동물의 관리 및 사용 안내서에 따라 수행되었습니다. 결핵과 관련된 모든 연구는 생물 안전성 봉쇄 수준 3 (BSL-3)의 실험실에서 수행되었습니다.
1. 토끼 감염 모델 및 Caseum 수집
- 이전에 설명한대로 코에 에어로졸 노출 시스템을 사용하여 M. tuberculosis로 뉴질랜드 흰 토끼를 감염시킵니다. 12 , 13 12-16 주 동안 감염이 진행되도록하십시오. 토끼에게 35 mg / kg ketamine과 5 mg / kg xylazine을 근육 내 주사하고, 0.22 mL / kg pentobarbital sodium과 phenytoin sodium을 정맥 내로 안락사시키고 부검을 진행하십시오.
- 족집게와 메스를 사용하여 가슴에서 폐를 제거하십시오.vity. 각 폐 엽으로부터 메스를 사용하여 개별 공동 큰 괴사 육아종 해부. 조심스럽게 캐비티 및 육아종 벽에서 caseum을 긁어. 사용 전까지 -20 ℃에서 2 ㎖의 스크류 캡 튜브에서 기록 및 저장 샘플을 단다.
- BSL-2 실험실에서 사용하기에 uninfectious 안전 렌더링하기 위해 드라이 아이스에 3 MegaRad에 감염 caseum 샘플을 감마 - 조사.
THP-1 세포로부터의 시험 관내 Caseum 대리 2 세대
- (80 ㎖ / 플라스크) T175 세포 배양 플라스크 RPMI 1640 배지 (2 mM의 L- 글루타민 및 10 % 소 태아 혈청)에서 THP-1 단핵 세포 성장. 3-4 일 동안 37 ℃, 5 % CO 2 분위기에서 플라스크를 인큐베이션.
- 5 분 동안 150 XG 두 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 T175 플라스크로부터의 배양 물을 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 RPMI 1640 매체 10ml에 펠렛을 정지.
- t의 45 μL를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브에 피펫이 배양 5 μLrypan 블루. 피펫에 의해 철저하게 섞는다. 혈구 10 μL 전송 및 광학 현미경 (배율 10 배)를 사용하여 (흠) 가능한 THP-1 단핵 세포 수를 계산. 배양액 1 ㎖ 당 생존 세포의 수를 계산한다. 1.25 × 106 세포 / ㎖의 최종 농도로 RPMI 배지로 희석한다.
- 대규모 세포 배양 판 (50 × 106 세포 / 플레이트)에 배양액 40 ㎖의로드. 100 μM PMA (포르 에탄올을 제조 12 myristate13 아세테이트) 40 μL를 첨가하고 세포 배양기에서 밤새도록 부착 할 수있다.
참고 : PMA의 최종 농도는 100 nm의입니다. - 0.1 M (968.3 μL 에탄올 즉 31.7 μL OA)의 농도로 순수 에탄올 올레산 (OA) (0.89 g / ml)로 희석. 10 mM의 농도로 신선한 예열 RMPI 매체에 상기 용액을 희석. RPMI 배지에서 0.4 밀리미터 (최종 작업 농도)이 OA 현탁액을 희석하여 37 ℃로 예열.
- 기존의 미디어와 비를 제거세포 배양 플레이트에서 첨부 된 세포와 부드럽게 THP - 1 macrophages (THP - M)에 0.4 MM OA 40 ML을 추가합니다. 하룻밤 인큐베이터에서 37 ° C에서 품어.
- 40 배 배율의 광학 현미경을 사용하여 각 THP-M에서 수많은 지질 바디 함유 물의 존재를 시각적으로 확인합니다. 세포 배양 플레이트에서 모든 RPMI 매체를 제거하고 부드럽게 50 ML 혈청 피펫을 사용하여 인산염 완충 식염수 (PBS)로 두 번 접착 세포를 씻으십시오.
참고 : 지질 체는 THP-M의 세포질에 작고 깨끗한 구형 구조로 나타납니다. - 각 플레이트에 5 MM ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) 40 mL를 넣는다. 37 ° C에서 15 분 동안 품어 라.
- 10 ML 혈청 피펫을 사용하여 전체 접시의 표면 위에 반복적으로 pipetting하여 거품 macrophages (FM)를 분리하십시오. 세포 현탁액을 50 ML 원추형 튜브에 전송하고 5 분 150 XG에서 스핀 다운.
- PBS (세 번째 PBS 세척) 10 ML에 세포 펠렛을 Resuspend사전 칭량 된 15-mL 원뿔 튜브로 옮긴다. 5 분 동안 150 xg에서 다시 스핀 다운하십시오. 조심스럽게 혈청 피펫을 사용하여 뜨는을 기음과 폐기하십시오.
- FM 펠렛을 3 회 동결 - 해동시켜 세포를 녹이고 75 ° C에서 20-30 분 동안 배양하여 매트릭스의 단백질을 변성시킵니다. 사용 준비가 될 때까지 -20 ℃에서 알약을 보관하십시오.
3. 신속한 평형 투석 (RED) 분석
- DMSO (dimethyl sulfoxide)에 모든 시험 화합물의 10 mM 저장 용액을 준비하십시오. 각 분석 전에 DMSO에서 500 μm의 작업 솔루션으로 희석.
- caseum 대리 대리인을 포함하는 튜브의 무게를 단다. 빈 튜브의 무게를 빼서 펠렛의 무게만을 뽑아 낸다. 튜브 당 2-3 금속 구슬을 추가하고 1 분 동안 1,200 스트로크 / 분의 조직 균질기를 사용하여 각 매트릭스의 10 배 희석 된 현탁액을 달성하기 위해 1 분 동안 caseum 또는 대리모 매트릭스를 PBS (1 : 9 w / v)에서 분출하십시오.
- 스파이크 6.5 μL의 5005 μM (≤1 % DMSO) 및 와동의 최종 농도를 달성하기 위해 643.5 μL의 균질 액에 시험 화합물의 μM 용액.
- RED 인서트를베이스 플레이트에 놓습니다. 각 RED 인서트의 기증자 챔버 (빨간 링)와 각 수신기 챔버에 PBS 350 μL에 마약 스파이크 매트릭스의 200 μL를 추가합니다. 각 시험 화합물에 대해 3 개의 인서트를 준비하십시오 (3 중 샘플). 플레이트를 접착 플레이트 씰로 밀봉하고 37 ° C에서 200 rpm (1 xg)으로 4 시간 동안 Thermomixer에서 배양합니다.
- 부화 후, 2-3 회 위 아래로 pipetting하여 기증자 및 수신기 챔버의 내용을 부드럽게 섞는다. 기증자 챔버에서 homogenate의 20 μL aliquots을 피펫과 1.5 ML 튜브 (1시 1 분)에 깨끗한 PBS 20 μL에 추가하십시오. 마찬가지로, 리시버 챔버에서 PBS 샘플의 20 μL aliquots을 피펫 깨끗한 homogenate (매트릭스 일치) 20 μL에 추가합니다. 8
참고 : 매트릭스 일치는 ne를 제거합니다.정량 분석을 위해 2 개의 개별 보정 곡선 (균질 액 및 PBS 중)을 제조 할 수 있습니다. 도너 챔버의 내용물은 시간이 지남에 따라 침전 될 수 있습니다. 분액을 제거하기 전에 pipetting으로 내용물을 천천히 혼합하십시오.
4. LC-MS 정량 및 데이터 분석
- 각 튜브와 볼텍스에 500 ng / mL diclofenac 또는 10 ng / mL verapamil (내부 표준 물질)이 함유 된 1 : 1 메탄올 : 아세토 니트릴 160 μL를 첨가하여 단백질을 침전시킵니다. 10,000 xg에서 5 분간 원심 분리하여 침전물을 침전시키고 액체 크로마토 그래피 - 질량 분석기 (LCMS) 분석을 위해 상층 액을 96- 웰 심층 플레이트로 옮긴다. 7
- 위의 샘플과 동일한 매트릭스 구성을 유지하면서 각 테스트 화합물에 대해 1 ~ 1,000 nM의 보정 곡선을 작성하십시오. LC-MS 방법을 사용하여 기증자 및 수용기 챔버의 시료에서 시험 화합물의 농도를 정량화합니다.
- 언 바운드 분율 ( f u ) 계산식 1을 사용하여 희석 된 매트릭스에서 약물을 계산하십시오. 식 2 ( D = 희석 계수 10)를 사용하여 희석되지 않은 매트릭스에서 f u 를 계산하십시오. 14
- 안정성 / 신진 대사 / 비특이적 결합 문제가있는 화합물을 확인하기 위해 식 3을 사용하여 각 화합물의 회복 (물질 수지)을 확인하십시오.
참고 : 복구 속도는 일반적으로 70 %에서 130 % 사이입니다. 15 명
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Representative Results
이 프로토콜을 사용하여 우리는 침투성 caseum에서 예상되는 효율성을 위해 수백 가지의 결핵 약물 개발 화합물을 테스트했습니다. 그림 1 은 RED 분석의 기본 개념을 시각화합니다. RED 인서트의 투석 막은 언 바운드 소분자가 기증자 우물에서 수용기 우물로 확산되도록하여 결국 두 구획 사이의 평형을 이룹니다. 단백질이나 지질과 같은 거대 분자에 결합 된 작은 분자는 기증자에 잘 포획됩니다. 두 구획의 시료를 정량 분석하면 caseum 또는 대리 기질의 각 작은 분자의 결합되지 않은 분율 ( f u )을 계산할 수 있습니다. 이 분획은 생체 내 caseum의 약물 침투와 직접적인 상관 관계가있는 것으로 나타났습니다. 7 그림 2는 MALDI (매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화) 질량 분석법metry 화상은 F U 높을수록 약물은 광범위로 확산 caseum. 그러므로,이 약물 분자가 세포 병변 층 caseous 고분자 결합과의 인터페이스 caseum의 외주 내로 확산로가 상기 caseous 코어로의 확산을 방지하는 약물 담즙산이한다는 가설과 일치한다. 18 항 결핵 약물의 샘플 패널 caseum 및 대리 모두 그들의 U f를 함께 표 1에 나열되어있다. 도 3은 도시 된 바와 같이, THP-1 유래의 대 식세포 거품에서 제조 된 매트릭스 사실 caseum에 효과적인 대리이다. 두 행렬에 바인딩 강하게 서로 상관 관계.
그림 1 : RED 분석의 그림입니다. 배양하는 동안, 약물 분자의 거대 분자에 결합되지 않은 남아매트릭스는 투석막을 가로 질러 확산한다. 시간이 지남에 따라, 공여체 및 수용체 웰 모두에서 결합되지 않은 약물 분자의 농도 사이에 평형이 설정된다. 모든 거대 분자 (단백질, 지질 등 )와 결합 된 약물 분자는 기증자 챔버 내에 갇혀 있습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2 : 생체 내 약물 침투. 여섯 개의 항 결핵 약물에 대한 MALDI (matrix-assisted laser desorption / ionization) 질량 분석 이미징에 의해 결정된 생체 내 에서의 미분 획분 ( f u )과 caseum으로의 확산 사이의 관계. 이온지도는 대표적인 폐 병변이며 신호 강도는 왼쪽의 눈금 막대로 표시됩니다. H 인접 구간의 에마 톡신 및 에오신 (E & E) 염색이 이온지도 아래에 표시됩니다. 검정색 / 흰색 등고선은 각 병변의 중심을 강조합니다. Sarathy 외의 허가를 받아 재판 (변경). 7 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3 : caseum의 18 개 결핵 약물과 대 조약의 비 결합 분획 (fu) 간의 상관 관계. 가장 적합한 선은 선형 회귀를 사용하여 결정되었습니다. 적합도는 R 2 값으로 표현됩니다. Sarathy 외의 허가를 받아 재판 (변경). 7k ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Caseum f u (%) | Surrogate f u (%) | |
에탐부톨 | 35.2 ± 4.4 | 38.8 ± 5.6 |
이소니아지드 | > 99.9 | > 99.9 |
아세틸 - 이소니아지드 | > 99.9 | > 99.9 |
p- 아미노 살리실산 | 54.7 ± 1.4 | 51.1 ± 11.2 |
리팜피신 | 5.13 ± 0.2 | 7.3 ± 0.6 |
리팜핀테인 | 0.5 ± 0.1 | 1.1 ± 0.1 |
뜸쑥 속의 식물 | 13.5 ± 3.7 | 16.8 ± 1.8 |
레보플록사신 | 8.34 ± 0.4 | 16.3 ± 3.1 |
가티 플로록 신 | 16.3 ± 4.2 | 18.8 ± 2.9 |
리네 졸리 드 | 29.3 ± 3.6 | 27.9 ± 2.2 |
Posizolid | 10.7 ± 1.7 | 17.6 ± 4.5 |
Sutezolid | 30.1 ± 8.7 | 21.7 ± 1.7 |
라데 졸리 드 | 5.2 ± 0.8 | 7.6 ± 1.9 |
테디 졸리 드 | 8.8 ± 1.8 | 13.7 ± 2.7 |
클로 파지 미네 | <0.01 | <0.01 |
베다 키린 | <0.01 | <0.01 |
PA-824 | 7.31 ± 2.2 | 3.6 ± 0.2 |
OPC67683 | 0.04 ± 0.02 | 0.02 ± 0.002 |
표 1 : caseum과 대용 결합 분석에서 테스트 한 18TB 약물의 비 결합 (fu) 분율. 모든 결과는 평균 ± 표준 편차로 표시됩니다. Sarathy 외의 허가를 받아 재판 (변경). 7
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Discussion
결핵에 감염된 환자의 폐 괴사 성 병변 및 충치는 약물 치료에 저항력이있는 세균 집단을 포함합니다. 이러한 구조물의 핵심은 세포 외 환경에서 이러한 잔류 물을 보유하는 데 특히 책임이있다. 이러한 원격 위치에 항균제를 유리하게 분배하는 것이 결핵약 효능의 중요한 결정 인자로 여겨진다. 이 프로토콜의 유효성을 검증하기 전에, 소변 병변에서 약물 발견 화합물의 분포를 예측할 수 있는 in vitro 기술은 존재하지 않았다. 결과적으로,이 중점 병변에서의 약물 분포 평가는 동물 감염 모델, 병변 중심 약동학 연구 및 MALDI 질량 분석 이미징 기술에 크게 의존했다. 5 , 17
시험 관내 분석에서 그는다시는 생체 내 약물 동력학 연구의 번거 로움과 비용없이 결핵 병변에 약물 침투를 예측하는 빠르고 효과적인 방법입니다. 프로토콜은 원래 RED 장치의 용도이었다 혈장 단백질 결합 분석의 변형이다. 피펫 - 일관성있게 조직 샘플 균질화 동일한 장치를 사용하여 측정되는 결합 조직 단백질을 허용한다. 이 동물 감염 모델에서 사용할 수있는 경우이 프로토콜은 caseum으로 수행 할 수있다. 도 1은 설명 된 바와 같이 결합되지 않은 약물 분자가 수신기 챔버 내에 반투과성 막을 통해 확산 할 수없는 반면, 약물 분자는 도너 챔버에서 유지 caseum / 대리 균질의 거대 분자에 결합한다. (U f) 상기 미 결합 분획 잠복기 동안 두 구획 사이의 평형을 이룬다. 도 2는 (U ≤ 1 % F) ALMO 것을 매우 높은 결합 화합물 있듯이전체 기증자 챔버 내에 갇혀 ST는 caseum 침투에 적용되지 않습니다. 한편, 화합물 (1 % <U <100 % F)를 다양한 각도로 caseous 코어 내로 확산 할 수있는 덜 결합; 높은은 F u는, 더 광범위하게는 괴사 영역을 투과.
프로토콜은 또한 올레산과 유도 된 지질로드 THP-1 식세포 유래의 대용 매트릭스로 사용될 수있다. 지질 몸 축적의 유도를위한 몇 가지 조건이 THP-1S에서 테스트되었다. 이것들은 마이코 박테리아의 세포벽으로부터 유래 조사 결핵균 및 6,6'- dimycolate 트레할로스 노출 (TMD) 저산소증에 노출을 포함한다. 400 μM의 최종 올레산 배양 농도는 세포 생존 및 밀착성을 손상시키지 않고 피크 지질 체 형성을 유도하는 것으로 입증되었다. 7 예열 미디어 올레산의 최대 희석을 위해 중요지방산의 용해. 그 결과 대리모 매트릭스는 진정한 카세움에 비견되는 콜레스테롤 함량을 가지지 만, 각각 높은 트리글리세리드와 낮은 트리글리 세라이드 및 단백질 함량을 갖는다. 그림 3에서 알 수 있듯이, 18 개의 항 결핵 화합물과 대용 매트릭스의 결합은 카제 움과의 결합과 밀접한 상관 관계가있다. 정의되지 않은 살균 활성을 갖는 비 상업용 화합물을 포함하는 최근의 연구에 따르면 FM에서 추출한 매트릭스가 카제 늄의 효과적인 대리 역할을한다는 것이 입증되었습니다. 7 동물 감염 모델의 필요성을 제거함으로써 대리 매트릭스는이 분석의 처리량을 성공적으로 증가시키면서 비용 효율성을 높입니다.
이 다용도 프로토콜은 여러 화합물을 동시에 테스트하는 데에도 사용할 수 있습니다 (카세트 테스트). 우리는 이전에이 프로토콜을 사용하여 각 삽입물에서 5 μM의 5 가지 약 조합을 테스트하면 화합물s는 그들의 caseum 바인딩 친화력을 기반으로 시간과 재료를 절약합니다. 모시 프록 사신 (moxifloxacin)과 같은 여섯 번째 대조 화합물을 카세움 / 대리인의 분석 및 배치 사이의 일관성을 보장하기 위해 내부 대조군으로서 카세트에 첨가 할 수있다. 중요하게도,이 프로토콜은 10 mM compound stock의 20 μL (화합물 1 mg 이하)로 실행할 수 있습니다. 이것은 화학자들이 스크리닝 목적으로 각 화합물의 제한된 양을 합성 할 때 신약 발견 과정 초기에 큰 이점입니다. RED 장치 장치는 자동화가 편리합니다. 베이스 플레이트의 마이크로 플레이트 풋 프린트는 표준 96 웰 플레이트를 처리하도록 설계된 자동화 시스템과 호환됩니다.
Surrogate matrix가 ex vivo caseum의 결합 특성을 성공적으로 모방하는 것으로 나타 났지만 ( 그림 3 ), 이는 특정 화합물을 부정확하게 만들 수 있음을 인정합니다. THP-1 대 식세포는 일반적으로 Caseum 대리인 결합 분석은 결핵 약물 발견에 유용한 도구이며 다중 리드 최적화 프로그램에 사용되고 있습니다. 또한 더 많은 디자인을 도울 수 있습니다.다양한 병변 유형의 다양한 층으로 분할하기위한 개별 약제의 능력에 기초한 혼합 조합 요법. 이 프로토콜은 또한 약물 침투가 제한적이지만 성공적인 치료에 중요한 병변 또는 농양의 형성을 특징으로하는 다른 질병에 대한 약물 발견을 촉진하기 위해 적용될 수 있습니다.
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Disclosures
더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
Acknowledgments
Bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid 및 tedizolid를 제공 한 Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X 및 Trius Therapeutics에 감사드립니다. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li 및 Danielle Weiner는 MALDI 분석, 생물 분석 방법, caseum 대리인의 준비, 화학 합성 및 토끼 caseum의 분리에 대한 지원을 제공했습니다. 이 작업은 Bill and Melinda Gates Foundation, # OPP1044966 및 OPP1024050 보너스, V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072 및 Bill and Melinda Gates Foundation의 공동 기금 및 우수 센터를위한 Wellcome Trust의 기금으로 수행되었습니다 개발 도상 세계의 질병에 대한 리드 최적화를 위해 P. Wyatt에게
Materials
Name | Company | Catalog Number | Comments |
New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
DMSO | Sigma | 472301 | |
Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
Methanol | Sigma | 34860 | |
Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
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