Summary
Her beskriver vi en hurtig ligevægtsdialyse (RED) -metode til måling af lægemiddelbindingen til kaseum fra lunge tuberkulose læsioner og hulrum. Protokollen anvendes også med en skummende makrofagafledt matrix, der er en effektiv surrogat til kaseum.
Abstract
Udryddelsen af tuberkulose sygdom kræver lægemiddelregimer, som kan trænge igennem de mange lag af komplekse lungesygdomme. Narkotikafordeling i kaskaderne i hulrum og læsioner er særlig afgørende, fordi de har underpopulationer af stoftolerante bakterier, der også almindeligvis betegnes som persister. Eksisterende metoder til måling af lægemiddelindtrængning i tuberkuloselæsioner indebærer kostbare og tidskrævende farmakokinetiske in vivo undersøgelser koblet til bioanalytiske eller billeddannende teknikker. In vitro- måling af lægemiddelbindende til caseum-makromolekyler blev foreslået som et alternativ til sådanne teknikker, da denne binding forhindrer passiv diffusion af lægemolekyler gennem caseum. Hurtig ligevægtsdialyse er et hurtigt og pålideligt system til udførelse af plasmaprotein og vævsbindingsundersøgelser. I denne protokol anvendte vi en hurtig ligevægtsdialyse (RED) enhed til måling af lægemiddelbindende til homogenater af caseum, der er excisUd fra læsioner og hulrum af tuberkuloseinficerede kaniner. Protokollen beskriver også, hvordan man genererer en surrogatmatrix fra lipidbelastede THP-1-makrofager til anvendelse i stedet for caseum. Denne caseum / surrogatbindingsassay er et vigtigt redskab i tuberkulose-lægemiddelforskning og kan tilpasses til at hjælpe med at studere lægemiddelfordeling i læsioner eller abscesser forårsaget af andre sygdomme.
Introduction
Behandlingen af lunger tuberkulose sygdom kræver effektiv distribution af lægemidler til forskellige typer læsioner. Nekrotiske læsioner og hulrum indeholder caseøse centre, der har subpopulationer af lægemiddeltolerante eller "vedholdende" bakterier. 1 , 2 Kavitis sygdommen er forbundet med dårligere helbredshastigheder og dårlig prognose. 3 , 4 Tidligere undersøgelser har vist ved hjælp af kvantitative og billeddannende teknikker, at evnen til at trænge ind i tilfældeum varierer betydeligt fra en lægemiddel klasse til en anden. 5 , 6 Disse metoder kræver imidlertid brug af dyreinfektionsmodeller, der er langsomme og kedelige. En in vitro- analyse, der måler lægemiddelbindende til ex vivo- caseum, blev designet. Denne binding viste sig at reversere korrelere med lægemiddelindtrængning i caseøse granulomer og er derforBruges som et prædiktivt værktøj. 7
Ligevægtsdialyse betragtes som guldstandardmetoden til plasmaproteinbindingsundersøgelser. Den hurtige ligevægtsdialyse (RED) -enhed giver et hurtigt, nemt at bruge og pålideligt system til udførelse af sådanne analyser. 8 Enheden består af to komponenter: engangsbrug, engangsindsatser bestående af 2 kamre adskilt af en lodret cylinder af semipermeabel membran; Og genanvendelige baseplader, der kan holde op til 48 indsatser ad gangen. Dialysemembranen har en 8 kDa molekylvægt cut-off (MWCO), der er ideel til lægemiddel-makromolekylbindende undersøgelser. Det høje overflade-til-volumenforhold i membranrummet tillader hurtig dialyse og ækvilibrering. Både indsatserne og basispladen er blevet valideret for minimal ikke-specifik binding. Kombinationen af den RØDE enhed med bioanalytiske teknikker giver nøjagtige estimater af de ubundne fraktioner af lægemidler i pLasma. 8 , 9
Selv om det oprindeligt var designet til at måle plasmaproteinbinding, er den RØDE enhed blevet anvendt i flere vævsbindende undersøgelser ved anvendelse af homogenater. 10 , 11 I denne protokol måler vi lægemiddelbindende til kaseum, de nekrotiske affald udskæres fra de nekrotiske læsioner og hulrum af tuberkuloseinficerede kaniner. Den akellulære og ikke-vaskulære karakter af kaseholdigt materiale gør det nemt at homogenisere til en homogen suspension, som er kompatibel med analysen.
Da dette caseum er kedeligt at producere og svært at komme forbi, har protokollen også været valideret til brug med en surrogatmatrix, der fremstilles fra skummede makrofager. THP-1 monocyt-afledte makrofager induceres med oliesyre for at akkumulere flere lipidlegemer, som giver dem deres "skumagtige" udseende. Disse lipidbelastede celler høstes ogForarbejdet til fremstilling af en matrix, som vi bruger som en surrogat til caseum. Denne undersøgelse har vist, at lægemiddelbindende til denne surrogatmatrix korrelerer godt med binding til caseum, hvilket effektivt efterligner in vivo- processen, der forhindrer lægemiddelindtrængning i caseous-kernen i granulomer og hulrum.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med vejledningen til pleje og brug af laboratoriedyr ved de nationale sundhedsinstitutter med godkendelse fra NIAH's institutionelle dyrepleje- og brugskomité, Bethesda, MD. Alle undersøgelser, der involverede M. tuberculosis, blev udført i et laboratorium med biosikkerhedsindesningsniveau 3 (BSL-3).
1. Kanin Infektion Model og Caseum Collection
- Inficere New Zealand hvide kaniner med M. tuberculosis ved anvendelse af et eksklusivt aerosol eksponeringssystem som beskrevet ovenfor. 12 , 13 Tillad infektionen at udvikle sig i 12-16 uger. Sedat kaninerne med 35 mg / kg ketamin og 5 mg / kg xylazin intramuskulært, euthaniser kaninerne med 0,22 ml / kg pentobarbitalnatrium og phenytoinnatrium intravenøst og fortsæt med necropsierne.
- Ved hjælp af pincet og en skalpel, fjern lungerne fra brystet ca.vity. Fra hver lungelag skal du dissekere individuelle hulrum og store nekrotiske granulomer ved hjælp af en skalpel. Skru forsigtigt af kassen fra hulrummet og granulomvæggene. Væg, optag og opbevar prøver i 2 ml skruetætte rør ved -20 ° C, indtil de er klar til brug.
- Gamma-bestråle de infektiøse caseumprøver ved 3 MegaRad på tøris for at gøre dem uinfektive og sikre til brug i et BSL-2 laboratorium.
2. In Vitro Generation of Caseum Surrogate from THP-1 Cells
- Væk THP-1 monocytter i RPMI 1640 medium (2 mM L-glutamin og 10% føtalt bovint serum) i T175 cellekulturflasker (80 ml / kolbe). Inkuber kolberne i en 5% CO 2 atmosfære ved 37 ° C i 3-4 dage.
- Centrifuger kulturen fra en T175 kolbe i to 50 ml koniske rør ved 150 xg i 5 minutter. Kassér supernatanten og suspender pelleten i 10 ml RPMI 1640 medier.
- Pipetter 5 μl af denne kultur i et 1,5 ml rør indeholdende 45 μl tRypan blå. Blandes grundigt ved pipettering. Overfør 10 μL til en hæmocytometer og tæl antallet af levedygtige THP-1 monocytter (ufarvet) ved hjælp af et lysmikroskop (10X forstørrelse). Beregn antallet af levedygtige celler pr. Ml af kulturen. Fortynd det med RPMI-medier til den endelige massefylde på 1,25 x 106 celler / ml.
- Fyld 40 ml af kulturen på en stor cellekulturplade (50 x 106 celler / plade). Tilsæt 40 μl 100 μM PMA (phorbol 12-myristat13-acetat fremstillet i ethanol) og tillade celler at klæbe natten over i inkubatoren.
BEMÆRK: Slutkoncentrationen af PMA er 100 nM. - Fortynd ren oliesyre (OA) (0,89 g / ml) i ethanol til koncentrationen 0,1 M ( dvs. 31,7 μL OA i 968,3 μL ethanol). Fortynd denne opløsning i frisk forvarmet RMPI-medium til en koncentration på 10 mM. Fortynd denne OA-suspension til 0,4 mM (endelig arbejdskoncentration) i RPMI-medium, der var forvarmet til 37 ° C.
- Fjern de eksisterende medier og ikke-adherede celler fra cellekulturpladerne og forsigtigt tilsættes 40 ml 0,4 mM OA til THP-1-makrofagerne (THP-M). Inkubér ved 37 ° C i inkubatoren natten over.
- Brug et lysmikroskop ved 40x forstørrelse for visuelt at bekræfte tilstedeværelsen af talrige lipidlegemer indeslutninger i hver THP-M. Fjern alt RPMI-medium fra cellekulturpladerne og vask forsigtigt de adhærente celler to gange med phosphatbufret saltopløsning (PBS) under anvendelse af en 50 ml serologisk pipette.
BEMÆRK: Lipidlegemer fremstår som små, klare, sfæriske strukturer i cytoplasmaet af THP-M. - Tilsæt 40 ml 5 mM ethylendiamintetraeddikesyre (EDTA) i PBS til hver plade. Inkubér i 15 minutter ved 37 ° C.
- Fjern de skumagtige makrofager (FM) ved gentagne gange at pipettere op og ned over overfladen af hele pladen ved hjælp af en 10 ml serologisk pipette. Overfør cellesuspensionen til et 50 ml konisk rør og drej ned ved 150 xg i 5 minutter.
- Resuspender cellepelleten i 10 ml PBS (tredje PBS vask) aNd overførsel til et forudvejet 15 ml konisk rør. Spin ned igen ved 150 xg i 5 min. Sug forsigtigt supernatanten ved hjælp af en serologisk pipette og kassér.
- Emballér FM-pelletserne til 3 frysetøtningscykler for at lyse cellerne og inkuber dem ved 75 ° C i 20-30 minutter til denatureringsproteiner i matrixen. Opbevar pelletsene ved -20 ° C indtil de er klar til brug.
3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay
- Forbered 10 mM stamopløsninger af alle testforbindelser i dimethylsulfoxid (DMSO). Fortyndes til 500 μM arbejdsløsninger i DMSO forud for hvert assay.
- Væg røret indeholdende caseum surrogatpellet. Træk vægten af det tomme rør fra for at udlede pelletens vægt alene. Tilsæt 2-3 metalperler pr. Rør, og afbryd caseum eller surrogatmatrixen i PBS (1: 9 w / v) ved anvendelse af en vævshomogenisator ved 1200 slag / minut i 1 minut for at opnå 10x fortyndet suspension af hver matrix.
- Spike 6.5 μL af 500ΜM opløsning af testforbindelsen i 643,5 μl af homogenatet for at opnå den endelige koncentration på 5 μM (≤1% DMSO) og hvirvel.
- Placer de RØDE indlæg i bundpladen. Tilsæt 200 μL af den lægemiddelspidsede matrix i donorkammeret (rød ring) af hver RED-indsats og 350 μl PBS i hvert modtagerkammer. Forbered 3 indsatser for hver testforbindelse (triplikatprøver). Tætningsplade med en klæbende pladeforsegling og inkubering ved 37 ° C på termomixeren ved 200 omdr./min. (1 xg) i 4 timer.
- Efter inkubationen blandes forsigtigt indholdet af donor- og modtagerkamrene ved pipettering op og ned 2-3 gange. Pipetter ud 20 μl alikvoter af homogenat fra donorkamrene og tilsæt til 20 μl rent PBS i et 1,5 ml rør (1: 1). Tilsvarende pipetteres 20 μl alikvoter af PBS prøver fra modtagerkamrene og tilsættes til 20 μl rent homogenat (matrix matching). 8
BEMÆRK: Matrix-matching eliminerer neEd for 2 separate kalibreringskurver (i homogenat og PBS), der skal laves til kvantitativ analyse. Indholdet af donorkammeret kan sedimentere over tid. Bland forsigtigt indholdet ved pipettering før fjernelse af alikvoter.
4. LC-MS kvantificering og dataanalyse
- Tilsæt 160 μl 1: 1 methanol: acetonitril indeholdende 500 ng / ml diclofenac eller 10 ng / ml verapamil (intern standard) til hvert rør og hvirvel til udfældning af proteiner. Centrifuge ved 10.000 xg i 5 minutter for at sedimentere bundfaldet og overføre supernatanter til 96-brønds dybbrøndsplader til analyse af væskekromatografi-massespektrometri (LCMS). 7
- Bygg kalibreringskurver fra 1-1.000 nM for hver testforbindelse, mens den samme matrixkomposition holdes som prøverne ovenfor. Kvantificer koncentrationen af testforbindelse i prøver fra donor- og modtagerkamrene ved anvendelse af en LC-MS-metode.
- Beregn den ubundne fraktion ( f u ) oF lægemidlet i fortyndet matrix ved anvendelse af ligning 1. Beregn f u i ufortyndet matrix ved anvendelse af ligning 2 ( D = fortyndingsfaktor på 10). 14
- Tjek recovery (massebalance) for hver forbindelse ved anvendelse af ligning 3 for at identificere forbindelser med stabilitet / metabolisme / ikke-specifikke bindingsproblemer.
BEMÆRK: Gendannelse falder typisk mellem 70% og 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Ved hjælp af denne protokol har vi testet hundreder af tuberkulose-stofudviklingsforbindelser til deres forudsagte effektivitet ved penetrerende caseum. Figur 1 visualiserer de grundlæggende begreber i RED-analysen. Dialysemembranen i de RØDE indsatser gør det muligt for ubundne små molekyler at diffunde fra donorbrønden til modtagerbrønden og endelig opnå en ligevægt mellem begge rum. Små molekyler, der er bundet til makromolekyler, såsom proteiner eller lipider, er fanget i donorbrønden. Kvantitativ analyse af prøverne fra begge rum tillader beregning af den ubundne fraktion ( fu ) af hvert lille molekyle i caseum eller surrogatmatrixen. Denne fraktion har vist sig at være direkte korreleret med lægemiddelpenetration i tilfældeum in vivo . 7 Som figur 2 illustrerer ved anvendelse af MALDI (matrixassisteret laser desorption / ionisering) massespektroMetry billeder, jo højere er f , desto mere diffunderer stoffet i caseum. Dette er således i overensstemmelse med hypotesen om, at som bindemiddelmolekyler diffunderer i den ydre kant af caseum fra dets grænseflade med cellulære lag af læsionen, sekventerer bindingen til caseøse makromolekyler lægemidlet, hvilket forhindrer det i yderligere diffusion i caseous-kernen. Et prøvepanel på 18 anti-tuberkulosemediciner er anført i tabel 1 sammen med deres f u i både caseum og surrogatet. Som det fremgår af figur 3 , er matrixen fremstillet ud fra THP-1-afledte skumagtige makrofager en effektiv surrogat til ægte caseum. Binding i begge matricer korrelerer stærkt med hinanden.
Figur 1: Illustration af RED-analysen. Under inkubation er lægemiddelmolekyler, der forbliver ubundne til makromolekyler iMatrixen diffunderer over dialysemembranen. Over tid etableres en ligevægt mellem koncentrationen af ubundne lægemolekyler i både donor- og modtagerbrøndene. Alle makromolekyler (proteiner, lipider, etc. ) og bundne lægemolekyler er fanget inde i donorkammeret. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Drug penetration in vivo . Forholdet mellem den ubundne fraktion ( f u ) og diffusion i caseum in vivo som bestemt ved MALDI (matrixassisteret laser desorption / ionisering) massespektrometri billeddannelse til seks anti-tuberkulosemediciner. Ion-kort er af repræsentative lunge læsioner, og signalintensiteten er angivet ved hjælp af skalaen til venstre. H Ematoxylin og Eosin (H & E) farvning af tilstødende sektioner er vist under ionkortene. Sort / hvid kontur linjer fremhæve caseous center af hver læsion. Gentrykt (tilpasset) med tilladelse fra Sarathy et al . 7 Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Korrelation mellem de ubundne fraktioner ( fu ) af 18 anti-tuberkulosemediciner i caseum og surrogatmatrixen. Den bedst egnede linie blev bestemt under anvendelse af lineær regression. Godhedens form er udtrykt som R2-værdien. Gentrykt (tilpasset) med tilladelse fra Sarathy et al . 7K "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
| Caseum f u (%) | Surrogat f u (%) | |
| ethambutol | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
| isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| Acetyl-isoniazid | > 99,9 | > 99,9 |
| P- aminosalicylsyre | 54,7 ± 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
| Rifampicin | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
| rifapentin | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
| moxifloxacin | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
| levofloxacin | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
| gatifloxacin | 16,3 ± 4,2 | 18,8 ± 2,9 |
| linezolid | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
| Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
| Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
| Radezolid | 5,2 ± 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
| Tedizolid | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
| Clofazimine | <0,01 | <0,01 |
| Bedaquiline | <0,01 | <0,01 |
| PA-824 | 7,31 ± 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
| OPC67683 | 0,04 ± 0,02 | 0,02 ± 0,002 |
Tabel 1: Fraktion ubundet ( f u ) af de 18 TB-lægemidler, der blev testet i caseum- og surrogatbindingsassayet. Alle resultater udtrykkes som middel ± standardafvigelsen. Gentrykt (tilpasset) med tilladelse fra Sarathy et al . 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pulmonale nekrotiske læsioner og hulrum hos tuberkuloseinficerede patienter indeholder subpopulationer af bakterier, der er modstridende over for lægemiddelbehandling. Caseous kernerne i disse strukturer er særligt ansvarlige for at opbevare disse persister i et ekstracellulært miljø. 16 Gunstig fordeling af antibakterielle midler til disse fjerntliggende steder antages at være en vigtig determinant for tuberkulosemedicinske virkninger. Før valideringen af denne protokol var der ingen tilgængelige in vitro- teknikker, som kunne forudsige fordelingen af lægemiddelopdagelsesforbindelser i tilfælde af sår. Som et resultat var evalueringen af lægemiddelfordeling i disse kritiske foci stærkt afhængig af dyreinfektionsmodeller, læsionscentriske farmakokinetiske undersøgelser og MALDI massespektrometri billeddannelsesteknikker. 5 , 17
In vitro- analysen beskrev hanRe er en hurtig og effektiv måde at forudsige lægemiddelindtrængning i tuberkuloselæsioner uden tedium og omkostninger til in vivo farmakokinetiske undersøgelser. Protokollen er en modifikation af plasmaproteinbindingsassayet, som oprindeligt var den påtænkte anvendelse af den RØDE anordning. Homogenisering af vævsprøver til en pipettestabil konsistens tillader, at vævsproteinbinding måles ved anvendelse af den samme anordning. Denne protokol kan udføres med caseum, hvis den er tilgængelig fra dyreinfektionsmodeller. Som det fremgår af figur 1 binder lægemolekyler til makromolekyler i caseum / surrogathomogenat, idet det holdes i donorkammeret, hvorimod de ubundne lægemolekyler er fri til at diffunde over den semipermeable membran ind i modtagerkammeret. Den ubundne fraktion ( f u ) ækvilibrer mellem begge rum i inkubationsperioden. Som figur 2 illustrerer meget stærkt bundet forbindelser ( f u ≤ 1%), der er almoSt helt fanget i donorkammeret, er ikke effektive ved permeerende caseum. På den anden side er mindre bundne forbindelser (1% < f u <100%) i stand til at diffundere i caseous kerne i varierende grad; Jo højere f u , jo mere omfattende gennemtrænger det nekrotiske område.
Protokollen kan også anvendes med en surrogatmatrix afledt af lipidbelastede THP-1-makrofager, der er blevet induceret med oliesyre. Flere betingelser for induktionen af lipidkropsakkumulering blev testet på THP-1'er. Disse omfatter hypoxi, eksponering for bestrålet M. tuberculosis og eksponering for trehalose 6,6'-dimycolat (TMD) afledt fra mycobakteriecellevæggen. Den endelige oleinsyre-inkubationskoncentration på 400 μM viste sig at inducere top lipid kropsdannelse uden at gå på kompromis med cellevævbarhed og vedhæftning. 7 Fortyndingen af oliesyre i forvarmede medier er afgørende for at sikre maksimaL opløsning af fedtsyren. Den resulterende surrogatmatrix har et sammenligneligt cholesterolindhold til henholdsvis ægte caseum, henholdsvis henholdsvis højere og lavere triglycerid og proteinindhold. 7 Som det fremgår af figur 3, binder bindingen af 18 anti-tuberkuloseforbindelser til surrogatmatrixen stærkt sammen med deres binding til kaseum. Den nylige undersøgelse, der også omfattede ikke-kommercielle forbindelser med udefineret bakteriedræbende aktivitet, viste, at den FM-afledte matrix er en effektiv surrogat til caseum. 7 Ved at fjerne behovet for dyreinfektionsmodeller øger surrogatmatrixen vellykket gennemgangen af dette assay, samtidig med at det gør det mere omkostningseffektivt.
Denne alsidige protokol kan også bruges til at teste flere forbindelser samtidigt (kassetteprøvning). Vi har tidligere vist, at test af 5 lægemiddelkombinationer, alle ved 5 μM, i hver indsats ved hjælp af denne protokol kan effektivt rangere forbindelsenS baseret på deres bindingsaffiniteter i tilfældeum, samtidig med at du sparer tid og materialer. En sjette kontrolforbindelse, såsom moxifloxacin, kan tilsættes til kassetten som en intern kontrol for at sikre sammenhæng mellem assays og batcher af caseum / surrogat. 7 Det er vigtigt, at protokollen kan køres med så lidt som 20 μl af en 10 mM sammensat bestanddel (<< 1 mg af en forbindelse). Dette er en stor fordel tidligt i lægemiddelopdagelsesprocessen, når kemikere syntetiserer begrænsede mængder af hver forbindelse til screeningsformål. Det RØDE apparatapparat er automatiseringsvenligt; Grundpladens mikropladefodaftryk gør den kompatibel med automatiserede systemer designet til at håndtere standard 96-brøndsplader.
Skønt surrogatmatrixen har vist sig at lykkes med at efterligne bindingsegenskaberne af ex vivo- caseum ( Figur 3 ), erkender vi, at det kan profilere ukorrekt visse forbindelser. THP-1 makrofager er almindeligt anvendt i Caseum-surrogatbindingsassayet er et nyttigt redskab i tuberkulose-lægemiddelopdagelse og anvendes i flere blyoptimeringsprogrammer. Det kan også hjælpe med at designe mere efFektive kombinationsregimer baseret på individuelle lægers evne til at opdele i de forskellige lag af flere læsionstyper. Protokollen kunne også tilpasses til at lette lægemiddelopdagelse for andre sygdomme, som er karakteriseret ved dannelsen af læsioner eller abscesser, hvor lægemiddelpenetration er begrænset, men kritisk for vellykket behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Der er ingen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Vi ønsker at takke Johnson & Johnson, TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X og Trius Therapeutics for at give bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid og tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li og Danielle Weiner gav støtte med MALDI-analyse, bioanalytiske metoder, forberedelse af caseum-surrogatet, kemisk syntese og isolering af kanin caseum. Dette arbejde blev udført med finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation, pris # OPP1044966 og OPP1024050 til V. Dartois, NIH Fælles Instrumentation Grant S10OD018072, samt fælles finansiering fra Bill og Melinda Gates Foundation og Wellcome Trust for A Center of Excellence For blyoptimering for sygdomme i udviklingslandene til P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
