Summary
כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.
Abstract
חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.
Introduction
הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או "מתמידים". 1 , 2 המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. 3 , 4 מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. 5 , 6 שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. ב assay במבחנה כי אמצעים מחייב סמים exum case vivo לשעבר תוכנן. מחייב זה נמצא בקורלציה הפוכה עם חדירת סמים גרנולומה במקרה, ומכאן, הואהמשמש כלי ניבוי. 7
שיווי המשקל דיאליזה נחשבת כגישה זהב רגיל למחקרים חלבון פלזמה מחייב. דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) המכשיר מספק מהיר, קל לשימוש מערכת אמינה לביצוע מבחנים כאלה. 8 המכשיר מורכב משני מרכיבים: תוספות חד פעמיות, חד פעמיות המורכבות משני תאים המופרדים על ידי גליל אנכי של קרום חדיר למחצה; ואת לוחות בסיס לשימוש חוזר שיכול להכיל עד 48 מוסיף בכל פעם. קרום דיאליזה יש 8 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) כי הוא אידיאלי עבור מחקרים מקרומולקולה תרופה. היחס בין שטח השטח לנפח גדול של תא הממברנה מאפשר דיאליזה מהירה ושיווי משקל. הן התוספות והן צלחת הבסיס אומתו עבור מחייב מינימלי שאינו ספציפי. השילוב של המכשיר האדום עם טכניקות bioanalytical מספק הערכות מדויקות של שברים unbound של תרופות pLasma. 8 , 9
למרות תוכנן במקור למדוד מחלב פלזמה מחייב, המכשיר האדום כבר בשימוש במספר מחקרים מחייב רקמה באמצעות homogenates. 10 , 11 בפרוטוקול זה, אנו מודדים את התרופה מחייב caseum, פסולת נקרית נכרת מן נגעים נמק חללים של שפעת נגועים ארנבות. האופי ואת לא כלי הדם של חומר caseous עושה את זה קל homogenize לתוך ההשעיה הומוגנית התואמת assay.
בהתחשב בכך caseum מייגע לייצר וקשה לבוא, הפרוטוקול יש גם תוקף לשימוש עם מטריצה פונדקאית כי הוא מוכן מקרופאגים מקציף. THP-1 מונוציטים הנגזרות מקרופאגים הם המושרה עם חומצה אולאית לצבור מספר רב של גופים השומנים המעניקים להם את המראה "מקציף" שלהם. תאים אלה טעון שומנים נקצרים ומעובד כדי לייצר מטריצה שאנחנו משתמשים בתור תחליף כדי caseum. מחקר זה הוכיח כי התרופה קשורה מטריקס זה פונדקאי מתואם היטב עם מחייב caseum, ביעילות מחקה את תהליך vivo כי מעכב חדירת סמים הליבה המקרה של גרנולומות וחללים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3).
1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף
- להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. 12, 13 אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16 שבועות. שלווים ארנבים עם 35 מ"ג / ק"ג קטמין 5 מ"ג / ק"ג xylazine לשריר, להרדים את הארנבים עם 0.22 מ"ל / ק"ג נתרן ו פניטואין נתרן pentobarbital לווריד ולהמשיך עם necropsies.
- באמצעות פינצטה אזמל, להסיר ריאות מן ca החזה. מכל אונה ריאה, לנתח את חללים בודדים גרנולומה נמקית גדולה באמצעות איזמל. בזהירות לגרד את caseum מן החלל ואת הקירות גרנולומה. לשקול, להקליט דגימות החנות ב 2 מ"ל בורג כתרים צינורות ב -20 ° C עד מוכן לשימוש.
- Gamma- להקרין את דגימות caseum זיהומיות ב 3 MegaRad על קרח יבש כדי להפוך אותם חסרי ובטוח לשימוש במעבדה BSL-2.
2. בשנת הדור גזרתי של Caseum פונדקאי THP-1 תאים
- לגדול THP-1 מונוציטים ב RPMI 1640 בינוני (2 מ"מ L- גלוטמין 10% בסרום עוברי בסרום) ב T175 צלוחיות תרבות התא (80 מ"ל / בקבוק). דגירה את צלוחיות באווירה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים.
- צנטריפוגה התרבות מבקבוק T175 בשני צינורות 50 מ"ל חרוטי ב 150 xg במשך 5 דקות. מחק supernatant ו להשעות את גלולה 10 מ"ל של התקשורת 1640 RPMI.
- פיפטה 5 μL של תרבות זו לתוך צינור 1.5 מ"ל המכיל 45 μL של tכחול. מערבבים היטב לפי pipetting. העברה 10 μL כדי hemocytometer ולספור את מספר monocytes THP-1 קיימא (ללא כתם) באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה 10X). חישוב מספר תאים קיימא לכל מ"ל של התרבות. לדלל אותו עם התקשורת RPMI לצפיפות הסופית של 1.25 x 10 6 תאים / מ"ל.
- טען 40 מ"ל של התרבות על צלחת תרבות גדולה התא (50 x 10 6 תאים / צלחת). הוסף 40 μL של 100 מיקרומטר PMA (פורבול 12-myristate13 אצטט מוכן באתנול) ולאפשר לתאים לדבוק לילה בחממה.
הערה: הריכוז הסופי של PMA הוא 100 ננומטר. - מדולל חומצה אולאית טהורה (OA) (0.89 גרם / מ"ל) באתנול לריכוז של 0.1 M ( כלומר 31.7 OA μL ב 968.3 אתנול μL). לדלל את הפתרון הזה טריים מראש חימם מדיה RMPI לריכוז של 10 מ"מ. לדלל את ההשעיה OA ל 0.4 מ"מ (ריכוז עובד הסופי) בינוני RPMI מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס.
- הסר את המדיה הקיימת ולא אתתאים -adhered מן צלחות תרבית תאים ולהוסיף בעדינות 40 מ"ל של 0.4 מ"מ OA אל מקרופאגים THP-1 (THP-M). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה לילה.
- שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה 40x חזותי לאשר הנוכחות של תכלילים גוף שומנים רבים בכל THP-M. הסר את כל מדיום RPMI מן צלחות תרבית תאים בעדינות לשטוף את התאים החסידים פעמים עם בופר פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגיות 50 מיליליטר.
הערה: גופים ליפידים להופיע קטן, ברור, מבנים כדוריים בציטופלסמה של THP-M. - להוסיף 40 מ"ל של 5 מ"מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS על כל צלחת. דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.
- הפרידו את מקרופאגים מקציף (FM) על ידי pipetting מעלה שוב ושוב ושוב על פני השטח של צלחת כולו באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ"ל. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ"ל ומסובב ב XG 150 עבור 5 דקות.
- Resuspend התא גלולה ב 10 מ"ל של PBS (לשטוף PBS השלישי) אnd להעביר צינורות חרוטי טרום שקל 15 מ"ל. ספין למטה שוב ב XG 150 עבור 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה, נושא הפסולת סרולוגיות.
- הנושא את כדורי FM כדי 3 מחזורים להקפיא להפשיר כדי lyse תאי דגירה אותם 75 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לפגל חלבונים במטריצה. אחסן את כדורי נייר -20 ° C עד מוכן לשימוש.
Assay 3. דיאליזה ראפיד איזון (RED)
- כן 10 מניות פתרונות מ"מ של כל תרכובות בדיקת sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל את 500 מיקרומטר עובד פתרונות DMSO לפני כל assay.
- לשקול את הצינור המכיל את הגלולה הפונדקאית caseum. הפחת משקל הצינור הריק כדי לגזור את המשקל של הגלולה לבד. להוסיף 2-3 חרוזי מתכת לכל צינור ו, באמצעות homogenizer רקמות בבית 1200 משייכות / min 1 דק ', לשבש caseum או המטריצה הפונדקאית ב PBS (1: 9 w / v) כדי להשיג 10x השעיה מדוללת של כל מטריצה.
- ספייק 6.5 μL של 500ΜM הפתרון של המתחם הבדיקה לתוך 643.5 μL של homogenate כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤ 1% DMSO) ו מערבולת.
- מניחים את התוספות האדומות בצלחת הבסיס. הוסף 200 μL של מטריקס סמים ממוסגרת לתא התורם (טבעת אדומה) של כל הוספה אדום ו 350 μL של PBS לתוך כל חדר המקלט. הכן 3 מוסיף עבור כל מתחם הבדיקה (דגימות בשלושה עותקים). צלחת חותם עם דבק צלחת דבק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על thermomixer ב 200 סל"ד (1 xg) במשך 4 שעות.
- לאחר הדגירה, לערבב בעדינות את התוכן של התורם ו המקלט חדרים על ידי pipetting מעלה ומטה 2-3 פעמים. פיפטה 20 aliquots μL של homogenate מתאי התורם ולהוסיף 20 μL של PBS נקי בצינור 1.5 מ"ל (1: 1). באופן דומה, פיפטה 20 aliquots μL של דגימות PBS מתאי המקלט ולהוסיף μL 20 של homogenate נקי (התאמה מטריקס). 8
הערה: התאמת מטריקס מבטלת את neעבור 2 עקומות כיול נפרד (ב homogenate ו PBS) כדי להיעשות לצורך ניתוח כמותי. התוכן של החדר התורם עשוי משקעים לאורך זמן. בעדינות לערבב את התוכן על ידי pipetting לפני הסרת aliquots.
4. כימות LC-MS וניתוח נתונים
- הוסף 160 μL של 1: 1 מתנול: אצטוניטריל המכיל 500 ng / מ"ל diclofenac או 10 ng / מ"ל verapamil (תקן פנימי) על כל צינור ו מערבולת כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות למשקע משקע והעברת supernatants לתוך 96 היטב טוב צלחות היטב עבור ניתוח כרומטוגרפי נוזלי ספקטרומטריית מסה (LCMS). 7
- בניית עקומות כיול מ 1-1,000 ננומטר עבור כל מתחם הבדיקה תוך שמירה על הרכב מטריקס זהה הדוגמאות לעיל. לכמת את הריכוז של מתחם הבדיקה בדגימות של התורם ו המקלט חדרים באמצעות שיטה LC-MS.
- חישוב החלק השבריר ( f u ) oF התרופה במטריצה מדוללת באמצעות משוואה 1. חשבה את f u במטריצה חייה באמצעות משוואה 2 (D = דילול פקטור של 10). 14
- בדוק את ההתאוששות (מאזן מסה) של כל מתחם באמצעות משוואה 3 לזהות תרכובות עם יציבות / המטבוליזם / בעיות כריכה הלא ספציפיות.
הערה: שחזור בדרך כלל נופל בין 70% ו 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השיגו איזון בין שני התאים. מולקולות קטנות המאוגדים מקרומולקולות כגון חלבונים או שומנים כלואות בתוך התורם גם. ניתוח כמותי של דגימות משני תאים ומאפשר לחשב את השבר מאוגד (ו u) של כל מולקולה קטנה caseum או מטריקס פונדקאית. חלק זה הוכח לתאם ישירות עם חדירת תרופת caseum in vivo. 7 כפי שניתן לראות בתרשים 2 ממחיש באמצעות MALDI (desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון) spectro המוניתMetry images, ככל ש- F u גבוה יותר, כך התרופה מתפשטת יותר ויותר. לפיכך, זה מסכים עם ההשערה כי כמו מולקולות התרופה מפוזרים לתוך השפה החיצונית של caseum מממשק שלה עם שכבות הסלולר של הנגע, מחייב מקרומולקולות המקרה סלקטרס התרופה, מונע ממנו להתפשט נוספת לתוך הליבה במקרה. לוח מדגם של 18 תרופות נגד שחפת מופיע בטבלה 1 יחד עם F שלהם בשני caseum ואת הפונדקאית. כפי שמראה איור 3 , המטריצה שהוכנה מקרופאגים מקציפים של THP-1 הנגזרות היא פונדקאית יעילה למקרה אמיתי. הכריכה בשני המטריצות קשורה מאוד זה לזה.
איור 1: איור של assay אדום. במהלך הדגירה, מולקולות התרופה שנותרו בלתי מקובלות למקרומולקולותהמטריצה מתפזרת על פני קרום הדיאליזה. עם הזמן, נוצר שיווי המשקל בין ריכוז של מולקולות סמים מאוגדות הן התורם והן בארות המקלט. כל מקרומולקולות (חלבונים, שומנים, וכו ' ) ואת מולקולות התרופה קשורה לכודים בתוך החדר התורם. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: חדירה סמים in vivo . הקשר בין החלק לא מאוגד ( F u ) ו דיפוזיה לתוך במקרה ב vivo כפי שנקבע על ידי MALDI (מטריקס בסיוע לייזר desorption / יינון) ספקטרומטריית מסה הדמיה עבור שש תרופות נגד שחפת. מפות יון הן של נגעים ריאות נציג עוצמת האות מסומן על ידי סרגל קנה מידה משמאל. ח Ematoxylin ו Eosin (H & E) מכתים של חלקים סמוכים מוצג מתחת מפות יון. קווי מתאר שחור / לבן מדגישים את מרכז המקרה של כל נגע. הודפס מחדש (מותאם) באישור Sarathy et al . 7 אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 3: מתאם בין שברים unbound ( F u ) של 18 תרופות נגד שחפת ב caseum ואת מטריקס פונדקאית. קו ההתאמה הטובה ביותר נקבע באמצעות רגרסיה ליניארית. טוב ההתאמה מתבטא בערך R 2 . הודפס מחדש (מותאם) באישור Sarathy et al . 7K "> אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| Caseum f u (%) | פונדקאית (%) | |
| Ethambutol | 35.2 ± 4.4 | 38.8 ± 5.6 |
| איזוניזיד | > 99.9 | > 99.9 |
| אצטיל-איזוניאזיד | > 99.9 | > 99.9 |
| חומצה p -aminosalicylic | 54.7 ± 1.4 | 51.1 ± 11.2 |
| ריפמפיצ'ין | 5.13 ± 0.2 | 7.3 ± 0.6 |
| ריפפנטין | 0.5 ± 0.1 | 1.1 ± 0.1 |
| Moxifloxacin | 13.5 ± 3.7 | 16.8 ± 1.8 |
| Levofloxacin | 8.34 ± 0.4 | 16.3 ± 3.1 |
| Gatifloxacin | 16.3 ± 4.2 | 18.8 ± 2.9 |
| ליין | 29.3 ± 3.6 | 27.9 ± 2.2 |
| פוזיולידי | 10.7 ± 1.7 | 17.6 ± 4.5 |
| סוטזוליד | 30.1 ± 8.7 | 21.7 ± 1.7 |
| Radezolid | 5.2 ± 0.8 | 7.6 ± 1.9 |
| לא מסובך | 8.8 ± 1.8 | 13.7 ± 2.7 |
| קלופזימין | <0.01 | <0.01 |
| בדאקילין | <0.01 | <0.01 |
| PA-824 | 7.31 ± 2.2 | 3.6 ± 0.2 |
| OPC67683 | 0.04 ± 0.02 | 0.02 ± 0.002 |
טבלה 1: שבר מאוגד (ו u) של 18 תרופות TB נבדקו caseum ו פונדקאית מחייבת assay. כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. הודפס מחדש (מותאם) באישור סראתי ואח. 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. 16 נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם חשוב של יעילות התרופה שחפת. לפני כניסתם לתוקף של פרוטוקול זה, לא היו זמינים טכניקות במבחנה שיכול לחזות את ההפצה של תרכובות גילוי תרופות בנגעים caseous. כתוצאה מכך, ההערכה של הפצת סמים ב מוקדים קריטיים אלה היה תלוי בכבדות על מודלים זיהום חיה, מחקרי פרמקוקינטיקה הממוקד הנגע וטכניקות הדמיה המוני ספקטרומטריית MALDI. 5, 17
את assay חוץ גופית המתואר הואמחדש הוא דרך מהירה ויעילה כדי לחזות חדירת תרופת נגעים שחפת ללא שעמום העלות המחקרית פרמקוקינטיקה vivo. הפרוטוקול הוא שינוי של assay מחייב חלבון פלזמה אשר היה במקור לשימוש המיועד של המכשיר RED. המגון של דגימות רקמה למרקם פיפטה-מסוגל מאפשר חלבון רקמות המחייבים להימדד באמצעות אותו המכשיר. פרוטוקול זה יכול להתנהל עם caseum אם הוא זמין ממודלים זיהום חיה. כפי שניתן לראות בתרשים 1 מסביר, מולקולות תרופה להיקשר מקרומולקולות ב caseum / homogenate הפונדקאית, שמירה על אותה בתא התורם, ואילו מולקולות התרופה המאוגדות חופשיות מפוזר על פני הקרום החדיר למחצה לתוך תא המקלט. השבר המאוגד (ו u) equilibrates בין שני התאים בתקופת הדגירה. כפי שניתן לראות בתרשים 2 ממחיש, מאוד תרכובות נקשר מאוד (ו u ≤ 1%) כי הם AlmoSt לגמרי לכודים בתוך החדר התורם אינם יעילים במקרה מחלחל. מצד שני, תרכובות פחות קשורות (1% < F > <100%) מסוגלות לפזר לליבת המקרה במעלות שונות; ככל שה- F גבוה יותר, כך הוא מתפשט באופן נרחב יותר באזור הנמק.
הפרוטוקול יכול לשמש גם עם מטריצה פונדקאית נגזר lipid נטען מקרופאגים THP-1 כי כבר המושרה עם חומצה אולאית. מספר תנאים לאינדוקציה של הצטברות של שומנים בדם נבדקו ב- THP-1. אלה כוללים היפוקסיה, חשיפה מ 'מוקרן שחפת וחשיפה טרהלוז 6,6'-dimycolate (TMD) נגזר קיר התא mycobacterial. הריכוז הסופי הדגירה חומצה אולאית של 400 מיקרומטר הוכח לגרום לשיא הגוף השומנים היווצרות מבלי להתפשר על הכדאיות התא הידבקות. 7 דילול של חומצה אולאית מראש התקשורת מחומם הוא קריטי כדי להבטיח מקסימוםפירוק חומצת השומן. מטריצה הפרוגרמה וכתוצאה מכך יש תוכן כולסטרול דומה caseum נכון, אבל גבוה יותר בטריגליצרידים ותכולת החלבון, בהתאמה. 7 כפי שמראה איור 3 , מחייב של 18 נגד שחפת תרכובות על מטריצה פונדקאית מאוד בקורלציה עם מחייב שלהם caseum. המחקר האחרון שכלל גם תרכובות לא מסחריות עם פעילות bactricidal לא מוגדר הוכיח כי מטריקס נגזר FM הוא תחליף יעיל caseum. 7 על ידי הסרת הצורך מודלים זיהום בבעלי חיים, מטריצה פונדקאית בהצלחה מגדילה את התפוקה של assay זה תוך ביצוע זה יותר חסכונית.
זה פרוטוקול צדדי יכול לשמש גם כדי לבדוק תרכובות מרובות בו זמנית (בדיקות קלטת). יש לנו בעבר הראו כי בדיקות 5 סמים שילובים, כל 5 מיקרומטר, בכל להוסיף באמצעות פרוטוקול זה יכול למעשה לדרג המתחםS מבוסס על הקשרים שלהם מחייב הזיקה תוך חיסכון בזמן וחומרים. תרכובת שליטה השישית כגון moxifloxacin ניתן להוסיף את הקלטת כמו בקרה פנימית כדי להבטיח עקביות בין מבחני וקבוצות של caseum / surrogate. 7 חשוב לציין, פרוטוקול ניתן להפעיל עם מעט כמו 20 μL של מלאי 10 מ"מ מתחם (<< 1 מ"ג של תרכובת). זהו יתרון עצום בשלב מוקדם של תהליך גילוי התרופה כאשר כימאים לסנתז כמויות מוגבלות של כל מתחם למטרות ההקרנה. המכשיר אדום המכשיר הם אוטומציה ידידותית; טביעת הרגל microplate של צלחת הבסיס עושה את זה תואם עם מערכות אוטומטיות שנועדו להתמודד עם תקן 96-גם צלחות.
למרות המטריצה פונדקאית הוכח בהצלחה לחקות את המאפיינים מחייב של vivo caseum לשעבר ( איור 3 ) אנו מאשרים כי זה עלול באופן מדויק פרופיל compounds מסוימים. THP-1 מקרופאגים משמשים בדרך כלל Assay מחייב במקרה caseay הוא כלי שימושי בשחפת גילוי סמים נמצא בשימוש במספר תוכניות אופטימיזציה אופטימיזציה. זה גם יכול לעזור לעצב יותר efמשלב שילוב משלב מבוסס על היכולת של תרופות בודדות לחלק את השכבות השונות של סוגים שונים של נגע. ניתן להתאים את הפרוטוקול גם כדי להקל על גילוי תרופות למחלות אחרות המאופיינות על ידי היווצרות נגעים או מורסות שבהן חדירת התרופות מוגבלת אך חיונית לטיפול מוצלח.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.
Acknowledgments
אנו מודים ל- Johnson & Johnson, ל- TB Alliance, ל- Astra Zeneca, ל- Rib-X ול- Trius Therapeutics על אספקת bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ו- tedized, בהתאמה. ברנדן פרידו, מתיו צימרמן, סטיבן ג'וזווין, אמה ריי-ג'וראדו, ננסי רואל, ליאן לי ודניאלה ויינר סיפקו תמיכה בניתוח MALDI, בשיטות ביואנליטיות, בהכנת תחליף המקרה, בסינתזה כימית ובבידוד של ארנבת ארנבת. עבודה זו התקיימה במימון של קרן ביל ומלינדה גייטס, פרס # OPP1044966 ו OPP1024050 ל V. Dartois, NIH משותפת Instrumentation גרנט S10OD018072, כמו גם מימון משותף של קרן ביל ומלינדה גייטס וולקום Trust עבור מרכז מצוינות עבור אופטימיזציה של עופרת למחלות העולם המתפתח ל P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
