Summary
Hier beschrijven we een werkwijze snel evenwicht dialyse (RED) drug binding aan ca- seum longtuberculose laesies en holtes meten. Het protocol wordt ook gebruikt met een schuimige-macrofaag afgeleide matrix met een effectieve surrogaat voor ca- seum.
Abstract
De uitroeiing van de ziekte van tuberculose vereist geneesmiddelenregimes die de veelvoudige lagen van complexe pulmonale letsels kunnen binnendringen. Drugsverdeling in de caseous kernen van holtes en laesies is vooral cruciaal omdat ze subpopulaties van drugstolerante bacteriën bezitten, ook vaak aangeduid als persisters. Bestaande methoden voor de meting van drugspenetratie bij tuberculose-laesies zijn kostbare en tijdrovende in vivo farmacokinetische studies gekoppeld aan bioanalytische of imaging technieken. De in vitro meting van drug binding aan caseum macromoleculen werd voorgesteld als een alternatief voor dergelijke technieken, aangezien deze binding de passieve diffusie van geneesmiddelmoleculen door caseum verhindert. Snelle evenwichtsdialyse is een snel en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van plasma-eiwit- en weefselbindingstudies. In dit protocol gebruikten we een snelle equilibrium dialysis (RED) -apparaat om bindend te zijn aan homogenaten van caseum dat excis isUit de laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. Het protocol beschrijft ook hoe u een surrogaatmatrix wilt genereren uit lipide geladen THP-1 macrofagen om in plaats van caseum te gebruiken. Deze caseum / surrogaatbindingstest is een belangrijk hulpmiddel bij het ontdekken van tuberculose-geneesmiddelen en kan aangepast worden om de verspreiding van geneesmiddelen bij letsels of abscesses die door andere aandoeningen worden veroorzaakt, te helpen bestuderen.
Introduction
De behandeling van pulmonale tuberculose ziekte vereist effectieve verdeling van geneesmiddelen in verschillende soorten laesies. Necrotische laesies en holtes bevatten caseous centra die subpopulaties van drugstolerante of 'aanhoudende' bacteriën bezitten. 1 , 2 De cavitusziekte is geassocieerd met minderwaardige geneeskracht en een slechte prognose. 3 , 4 Vorige studies hebben aangetoond dat met behulp van kwantitatieve en beeldvormende technieken de mogelijkheid om caseum te penetreren significant verschilt van de ene geneesmiddelklasse naar de andere. 5 , 6 Deze methoden vereisen echter het gebruik van dierlijke infectiemodellen die traag en vervelend zijn. Een in vitro test die geneesmiddelen bindt aan ex vivo caseum is ontworpen. Deze binding bleek omgekeerd te correleeren met drugpenetratie in caseous granulomas en is derhalveGebruikt als voorspellend hulpmiddel. 7
Evenwichtsdialyse wordt beschouwd als de gouden standaardbenadering voor plasma-eiwitbindende studies. De snelle equilibrium dialysis (RED) -inrichting biedt een snel, makkelijk te gebruiken en betrouwbaar systeem voor het uitvoeren van dergelijke analyses. 8 Het apparaat bestaat uit twee componenten: eenmalig gebruik, wegwerpinzetten bestaande uit 2 kamers gescheiden door een verticale cilinder van semi-doorlatend membraan; En herbruikbare basisplaten die maximaal 48 inzetstukken tegelijk kunnen bevatten. Het dialysemembraan heeft een afscheiding van 8 kDa molecuulgewicht (MWCO) dat ideaal is voor drug-macromolecule bindingsstudies. De hoge oppervlakte-volume verhouding van het membraancompartiment zorgt voor snelle dialyse en evenwicht. Zowel de inzetstukken als de basisplaat zijn gevalideerd voor minimale niet-specifieke binding. De combinatie van het RED-apparaat met bioanalytische technieken zorgt voor nauwkeurige schattingen van de ongebonden fracties van geneesmiddelen in pLasma. 8 , 9
Hoewel oorspronkelijk ontworpen om plasma-eiwitbinding te meten, is het RED-apparaat gebruikt in verschillende weefselbindende studies waarbij gebruik wordt gemaakt van homogenaten. 10 , 11 In dit protocol, we meten bindmiddel aan caseum, de necrotische vuilnis uitgesneden uit de necrotische laesies en holtes van tuberculose-geïnfecteerde konijnen. De acellulaire en non-vasculaire aard van caseous materiaal maakt het gemakkelijk homogeniseren in een homogene suspensie die compatibel is met de test.
Aangezien dat caseum vervelend is om te produceren en moeilijk te verkrijgen is, is het protocol ook gevalideerd voor gebruik met een surrogaatmatrix die uit schuimige macrofagen wordt bereid. THP-1 monocyt-afgeleide macrofagen worden geïnduceerd met oliezuur om meerdere lipide lichamen op te halen die hen hun 'schuimige' uitstraling geven. Deze lipide geladen cellen worden geoogst enVerwerkt om een matrix te produceren die we als surrogaat gebruiken voor caseum. Deze studie heeft aangetoond dat drug binding aan deze surrogaatmatrix goed corrigeert met binding aan caseum, effectief nabootsen van het in vivo proces dat de penetratie van drugs in de caseous kern van granulomen en holtes belemmert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dierstudies werden uitgevoerd in overeenstemming met de Gids voor de verzorging en het gebruik van laboratoriumdieren van de nationale instituten van gezondheid, met goedkeuring van het Institutionele Diervoeder- en Gebruikskomitee van de NIAID (NIH), Bethesda, MD. Alle studies met betrekking tot M. tuberculose werden uitgevoerd in een laboratorium met bioveiligheidsbeperkingsniveau 3 (BSL-3).
1. Konijn Infectie Model en Caseum Collection
- Infectie Nieuw- Zeelandse witte konijnen met M. tuberculose met gebruik van een blootstellingssysteem met uitsluitend aerosolbestrijding zoals eerder beschreven. 12 , 13 Laat de infectie gedurende 12-16 weken vooruit. Verplaats de konijnen met 35 mg / kg ketamine en 5 mg / kg xylazine intramusculair, euthaniseer de konijnen met 0,2 ml / kg pentobarbitalnatrium en fenytoïne-natrium intraveneus en ga verder met de necropsieën.
- Met behulp van tweezers en een scalpel, verwijder de longen van de borst ca.viteit. Ontleed afzonderlijke holtes en grote necrotische granulomen met behulp van een scalpel uit elke longlap. Schraap het caseum voorzichtig uit de holte en de granulomuren. Weeg, op te nemen en op te slaan monsters in 2 ml schroefbuisjes bij -20 ° C tot klaar voor gebruik.
- Gamma-bestraling de infectieuze caseummonsters op 3 MegaRad op droogijs om ze onfectief en veilig te maken voor gebruik in een BSL-2 lab.
2. In Vitro Generatie van Caseum Surrogaat van THP-1 Cells
- Groei THP-1 monocyten in RPMI 1640 medium (2 mM L-glutamine en 10% foetaal runder serum) in T175 celkweekflessen (80 ml / fles). Incubeer de flessen in een 5% CO 2 atmosfeer bij 37 ° C gedurende 3-4 dagen.
- Centrifugeer de cultuur van een T175 fles in twee 50 ml conische buizen bij 150 xg gedurende 5 minuten. Gooi de supernatant weg en schuif de pellet in 10 ml RPMI 1640 media.
- Pipetteer 5 μl van deze cultuur in een 1,5 ml buis die 45 μl t bevatRypan blauw. Meng grondig door pipettering. Draag 10 μL over naar een hemocytometer en tel het aantal levensvatbare THP-1 monocyten (onbeschadigd) met een lichtmicroscoop (10X vergroting). Bereken het aantal levensvatbare cellen per ml van de cultuur. Verdun het met RPMI media tot de uiteindelijke dichtheid van 1,25 x 106 cellen / ml.
- Laad 40 ml van de kweek op een grote celcultuurplaat (50 x 106 cellen / plaat). Voeg 40 μl 100 μM PMA (phorbol 12-myristaat13-acetaat bereid in ethanol) toe en laat cellen overnachten in de incubator.
OPMERKING: De uiteindelijke concentratie van PMA is 100 nM. - Verdun pure oliezuur (OA) (0,89 g / ml) in ethanol tot de concentratie van 0,1 M ( dwz 31,7 μL OA in 968,3 μL ethanol). Verdun deze oplossing in vers voorverwarmd RMPI media tot een concentratie van 10 mM. Verdun deze OA-suspensie naar 0,4 mM (eindwerkende concentratie) in RPMI-medium, vooraf verwarmd tot 37 ° C.
- Verwijder de bestaande media en niet-adherende cellen uit de celkweekplaten en voeg 40 ml 0,4 mM OA zachtjes toe aan de THP-1 macrofagen (THP-M). Incubeer bij 37 ° C in de incubator overnacht.
- Gebruik een lichtmicroscoop bij 40x vergroting om de aanwezigheid van talrijke lipide-lichaamsinsluitingen in elke THP-M visueel te bevestigen. Verwijder al het RPMI-medium uit de celkweekplaten en wacht de bijtende cellen tweemaal met fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) met behulp van een serologische pipet van 50 ml.
OPMERKING: Lipide lichamen verschijnen als kleine, heldere, bolvormige structuren in het cytoplasma van de THP-M. - Voeg 40 ml 5 mM ethyleendiaminetetraazijnzuur (EDTA) in PBS toe aan elke plaat. Incubeer gedurende 15 minuten bij 37 ° C.
- Verwijder de schuimige macrofagen (FM) door herhaaldelijk op en neer op de oppervlakte van de gehele plaat te pipetteren met behulp van een 10 ml serologische pipet. Zet de celsuspensie over in een 50 ml conische buis en draai gedurende 5 minuten op 150 xg.
- Resuspendeer de celpellet in 10 ml PBS (derde PBS was) aNd overdracht naar een voorgewogen 15 ml kegelbuizen. Spin opnieuw af bij 150 xg gedurende 5 minuten. Zuig de supernatant zorgvuldig door met behulp van een serologische pipet en weggooi.
- Onderwerp de FM pellets op 3 vries-ontdooi cycli om de cellen te lichten en incubeer hen gedurende 20-30 minuten bij 75 ° C om eiwitten in de matrix te denatureren. Bewaar de pellets bij -20 ° C tot het klaar is voor gebruik.
3. Rapid Equilibration Dialysis (RED) Assay
- Bereid 10 mM voorraadoplossingen van alle testverbindingen in dimethylsulfoxide (DMSO) op. Verdun op 500 μM werkoplossingen in DMSO voorafgaand aan elke test.
- Weeg de buis die de caseum surrogaatpellet bevat. Trek het gewicht van de lege buis af om het gewicht van de pellet alleen te kunnen afleiden. Voeg 2-3 metalen kralen per buis toe en gebruik een weefselhomogenisator bij 1,200 stromen / min gedurende 1 minuut, verstoord caseum of de surrogaatmatrix in PBS (1: 9 w / v) om 10x verdunde suspensie van elke matrix te verkrijgen.
- Spike 6.5 μL van de 500ΜM oplossing van de testverbinding in 643,5 μl van het homogenaat om de uiteindelijke concentratie van 5 μM (≤1% DMSO) en vortex te bereiken.
- Plaats de RODE inzetstukken in de basisplaat. Voeg 200 μL van de drugspikmatrix in de donorkamer (rode ring) van elk ROOD-inzetstuk en 350 μl PBS in elke ontvangerkamer. Bereid 3 inserts voor elke testverbinding (drievoudige monsters) op. Afdichtingsplaat met een kleefplaatafdichting en incuberen bij 37 ° C op de thermomixer bij 200 rpm (1 xg) gedurende 4 uur.
- Na de incubatie meng de inhoud van de donor- en ontvangerkamers zachtjes door 2-3 keer op en neer te pipetteren. Pipetteer 20 μl aliquots van homogenaat uit de donorkamers en voeg toe aan 20 μl schone PBS in een 1,5 ml buis (1: 1). Op dezelfde manier pipetteer 20 μl alikvoten PBS-monsters uit de ontvangerkamers en voeg 20 μL schoon homogenaat toe (matrix matching). 8
OPMERKING: Matrix-matching elimineert de neEd voor 2 afzonderlijke kalibratiekrommen (in homogenaat en PBS) voor kwantitatieve analyse. Inhoud van de donorkamer kan in de loop der tijd sedimenten. Meng de inhoud voorzichtig door pipettering voordat u de porties verwijdert.
4. LC-MS Kwantificering en Data Analysis
- Voeg 160 μl 1: 1 methanol: acetonitril met 500 ng / ml diclofenac of 10 ng / ml verapamil (interne standaard) toe aan elke buis en vortex om eiwitten te precipiteren. Centrifugeer bij 10.000 xg gedurende 5 minuten om het neerslag te sedimenteren en supernatanten over te brengen in 96-putjes diepe putten voor vloeistofchromatografie-massaspectrometrie (LCMS) analyse. 7
- Calibratiekrommen van 1-1.000 nM opbouwen voor elke testverbinding, terwijl dezelfde matrixsamenstelling als bovenstaande monsters wordt gehouden. Kwantificeer de concentratie van de testverbinding in monsters van de donor- en ontvangerkamers met behulp van een LC-MS-methode.
- Bereken de ongebonden fractie ( f u ) oF het geneesmiddel in verdunde matrix met behulp van vergelijking 1. Bereken de fu in onverdunde matrix met behulp van vergelijking 2 ( D = verdunningsfactor van 10). 14
- Controleer het herstel (massasaldo) van elke verbinding met behulp van vergelijking 3 om verbindingen te identificeren met stabiliteit / metabolisme / niet-specifieke bindingsproblemen.
OPMERKING: Het herstel valt meestal tussen 70% en 130%. 15
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met behulp van dit protocol, hebben we honderden van tuberculose de ontwikkeling van geneesmiddelen verbindingen getest op hun voorspelde efficiëntie op indringende geworden ca- seum. Figuur 1 visualiseert de basisconcepten van de RED assay. Het dialysemembraan van de RED inzetstukken maakt ongebonden kleine moleculen diffunderen van de donor en de ontvanger goed uiteindelijk bereiken van een evenwicht tussen beide compartimenten. Kleine moleculen die zijn gebonden aan macromoleculen zoals eiwitten of lipiden zijn gevangen in de donor ook. Kwantitatieve analyse van de monsters uit beide compartimenten maakt de berekening van de ongebonden fractie (fu) van elke kleine moleculen in de ca- seum of surrogaat matrix. Deze fractie is aangetoond dat direct correleren met geneesmiddel penetratie geworden ca- seum in vivo. 7 Zoals figuur 2 illustreert middels MALDI (matrix-ondersteunde laserdesorptie / ionisatie) massa spectroMetriebeelden, hoe hoger de f u , hoe uitgebreider het geneesmiddel diffuseert naar caseum. Vandaar dat dit in overeenstemming is met de hypothese dat als drugsmoleculen diffuseert in de buitenste rand van het caseum vanuit zijn interface met cellulaire lagen van de laesie, bindt de binding aan caseous macromolecules het geneesmiddel, waardoor het niet verder diffundeert in de caseous kern. Een voorbeeld paneel van 18 anti-tuberculose drugs is vermeld in Tabel 1 samen met hun f u in zowel caseum als de surrogaat. Zoals figuur 3 illustreert, is de matrix bereid uit THP-1 afgeleide schuimige macrofagen een effectieve surrogaat naar echt caseum. Binding in beide matrices correleren sterk met elkaar.
Figuur 1: Illustratie van de RODE test. Tijdens incubatie, drugsmoleculen die onbonden blijven aan macromoleculen inde matrix diffunderen over het dialysemembraan. Tijd, wordt een evenwicht tot stand gebracht tussen de concentratie van ongebonden geneesmiddelmoleculen in zowel de donor en ontvanger putjes. Alle macromoleculen (eiwitten, lipiden, enz.) En gebonden geneesmiddelmoleculen worden gevangen in de donorkamer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 2: Drug penetratie in vivo. Verhouding tussen de fractie gebonden (fu) en diffusie in ca- seum in vivo zoals bepaald met MALDI (matrix-geassisteerde laserdesorptie / ionisatie) massaspectrometrie imaging zes geneesmiddelen tegen tuberculose. Ion kaarten zijn representatief longlaesies en de signaalintensiteit wordt aangegeven door de schaal naar links. H Ematoxyline en Eosin (H & E) kleuring van aangrenzende afdelingen wordt hieronder weergegeven onder de ioonkaarten. Zwarte / witte contourlijnen leggen het caseous centrum van elke letsel aan. Reprinted (aangepast) met toestemming van Sarathy et al . 7 Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Correlatie tussen de ongebonden fracties ( fu ) van 18 anti-tuberculose geneesmiddelen in caseum en de surrogaatmatrix. De best fit lijn werd bepaald met behulp van lineaire regressie. De goedheid van fit wordt uitgedrukt als de R2 waarde. Reprinted (aangepast) met toestemming van Sarathy et al . 7K "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
| Caseum f u (%) | Surrogaat f u (%) | |
| ethambutol | 35,2 ± 4,4 | 38,8 ± 5,6 |
| isoniazid | > 99.9 | > 99.9 |
| Acetyl-isoniazide | > 99.9 | > 99.9 |
| P- aminozalicylzuur | 54,7 ± 1,4 | 51,1 ± 11,2 |
| rifampicine | 5,13 ± 0,2 | 7,3 ± 0,6 |
| rifapentine | 0,5 ± 0,1 | 1,1 ± 0,1 |
| moxifloxacine | 13,5 ± 3,7 | 16,8 ± 1,8 |
| Levofloxacin | 8,34 ± 0,4 | 16,3 ± 3,1 |
| Gatifloxacin | 16,3 ± 4,2 | 18,8 ± 2,9 |
| linezolid | 29,3 ± 3,6 | 27,9 ± 2,2 |
| Posizolid | 10,7 ± 1,7 | 17,6 ± 4,5 |
| Sutezolid | 30,1 ± 8,7 | 21,7 ± 1,7 |
| Radezolid | 5,2 ± 0,8 | 7,6 ± 1,9 |
| Tedizolid | 8,8 ± 1,8 | 13,7 ± 2,7 |
| clofazimine | <0,01 | <0,01 |
| Bedaquiline | <0,01 | <0,01 |
| PA-824 | 7,31 ± 2,2 | 3,6 ± 0,2 |
| OPC67683 | 0,04 ± 0,02 | 0,02 ± 0,002 |
Tabel 1: Fractie ongebonden ( fu ) van de 18 TB-geneesmiddelen getest in de caseum- en surrogaatbindingsassay. Alle resultaten worden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardafwijking. Reprinted (aangepast) met toestemming van Sarathy et al . 7
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Pulmonale necrotische letsels en holtes bij tuberculose-geïnfecteerde patiënten bevatten subpopulaties van bacteriën die onaantrekkelijk zijn voor de behandeling van geneesmiddelen. De caseous kernen van deze structuren zijn in het bijzonder verantwoordelijk voor het inhuren van deze persisten in een extracellulaire omgeving. 16 Gunstige verdeling van antibacteriële middelen in deze afgelegen locaties wordt geacht een belangrijke determinant van de werkzaamheid van tuberculose drugs te zijn. Voorafgaand aan de validatie van dit protocol waren er geen in vitro- technieken beschikbaar die de verspreiding van geneesmiddelen-ontdekkingsverbindingen in gevalleziekten zouden kunnen voorspellen. Als gevolg daarvan was de evaluatie van de distributie van drugs in deze kritische foci sterk afhankelijk van dierlijke infectie modellen, laesie-centrische farmacokinetische studies en MALDI massaspectrometrie beeldvormingstechnieken. 5 , 17
De in vitro- analyse beschreef hijre is een snelle en effectieve manier om de penetratie van het geneesmiddel in tuberculose laesies voorspellen zonder de verveling en de kosten van in vivo farmacokinetische studies. Het protocol is een modificatie van het plasma eiwitbindingassay die oorspronkelijk het beoogde gebruik van de RED inrichting bedroeg. Homogenisering van weefselmonsters op een pipet-staat consistentie maakt weefsel eiwitbinding te meten met behulp van dezelfde inrichting. Dit protocol kan worden uitgevoerd met ca- seum indien deze beschikbaar tegen infectie diermodellen. Zoals Figuur 1 verklaart geneesmiddelmoleculen binden aan macromoleculen geworden ca- seum / surrogaat homogenaat, hem in de donorkamer, terwijl het gebonden geneesmiddel moleculen vrij te diffunderen in de semi-permeabele membraan in de ontvangkamer. Vrije fractie (fu) in evenwicht tussen beide compartimenten tijdens de incubatieperiode. Zoals figuur 2 toont, zeer sterk gebonden verbindingen (fu ≤ 1%) die zijn almoSt volledig gevangen in de donorkamer zijn niet effectief bij het doordringen van caseum. Aan de andere kant kunnen minder gebonden verbindingen (1% < f u <100%) in verschillende mate in de caseous kern diffunderen; Hoe hoger de f u , hoe meer doordringt het nekrotische gebied.
Het protocol kan ook gebruikt worden met een surrogaatmatrix afgeleid van lipide geladen THP-1 macrofagen die geïnduceerd zijn met oliezuur. Verschillende condities voor de inductie van accumulatie van lipidenlichamen werden getest op THP-1's. Deze omvatten hypoxie, blootstelling aan bestraalde M. tuberculose en blootstelling aan trehalose 6,6'-dimycolaat (TMD) afgeleid van de mycobacteriële celwand. De uiteindelijke oleïnezuur incubatie concentratie van 400 μM bleek induceren van piek lipide lichaamsvorming zonder de levensvatbaarheid en adhesie van de cel in gevaar te brengen. 7 De verdunning van oliezuur in voorverwarmde media is cruciaal om maxima te waarborgenl oplossing van het vetzuur. Het resulterende surrogaat matrix een vergelijkbaar cholesterolgehalte ware geworden ca- seum maar hogere en lagere triglyceride en eiwitgehaltes resp. 7 Zoals figuur 3 toont de binding van 18 anti-tuberculose verbindingen aan het surrogaat matrix sterk correleert met hun binding aan ca- seum. De recente studie die ook niet-commerciële verbindingen met ongedefinieerde bactericide activiteit aangetoond dat de FM-afgeleide matrix een effectieve surrogaat voor ca- seum. 7 Doordat niet geïnfecteerd diermodellen surrogaat matrix succes verhoogt de doorvoer van deze test terwijl het laten rendabeler.
Deze veelzijdige protocol kan ook worden gebruikt om meerdere verbindingen tegelijk (cassette test) te testen. We hebben eerder aangetoond dat testen geneesmiddel 5-combinaties, allemaal 5 uM, in elk inzetstuk met dit protocol kan effectief rangschikken verbindingS gebaseerd op hun caseum bindende affiniteiten, terwijl u tijd en materialen bespaart. Een zesde controleverbinding zoals moxifloxacine kan worden toegevoegd aan de cassette als een interne controle om consistentie tussen assays en batches caseum / surrogaat te waarborgen. 7 Belangrijk is dat het protocol kan worden uitgevoerd met zo'n 20 μl van een 10 mM samengestelde voorraad (<< 1 mg van een verbinding). Dit is een groot voordeel vroeg in het drug ontdekkingsproces wanneer chemici synthetiseren van beperkte hoeveelheden van elke verbinding voor screening doeleinden. De RED apparaatapparatuur is automatiserend vriendelijk; De microplate voetafdruk van de basisplaat maakt het compatibel met geautomatiseerde systemen die zijn ontworpen om standaard 96-putjes te behandelen.
Hoewel de surrogaatmatrix is aangetoond dat de bindingseigenschappen van ex vivo caseum succesvol worden geminimaliseerd ( Figuur 3 ), erkennen we dat het bepaalde verbindingen onjuist kan profileren. THP-1 macrofagen worden vaak gebruikt in De caseum surrogaat bindingsassay is een handig hulpmiddel bij tuberculose drug ontdekking en wordt gebruikt in meerdere lood optimalisatie programma's. Het kan ook helpen bij het ontwerpen van meer efFectieve combinatieregimes gebaseerd op het vermogen van individuele geneesmiddelen om te verdelen in de verschillende lagen van meerdere laesies. Het protocol kan ook aangepast worden om de ontdekking van geneesmiddelen te vergemakkelijken voor andere aandoeningen die worden gekenmerkt door de vorming van letsels of abscessen waarbij drug penetratie beperkt is maar kritisch voor succesvolle behandeling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij willen Johnson & Johnson, de TB Alliance, Astra Zeneca, Rib-X en Trius Therapeutics bedanken voor respectievelijk bedaquiline, PA-824 (pretomanide), AZD5847, radezolid en tedizolid. Brendan Prideaux, Matthew Zimmerman, Stephen Juzwin, Emma Rey-Jurado, Nancy Ruel, Leyan Li en Danielle Weiner verstrekten ondersteuning met MALDI analyse, bioanalytische methoden, voorbereiding van de caseum surrogaat, chemische synthese en isolatie van konijn caseum. Dit werk is uitgevoerd met financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation, award # OPP1044966 en OPP1024050 aan V. Dartois, NIH Shared Instrumentation Grant S10OD018072, evenals gezamenlijke financiering van de Bill en Melinda Gates Foundation en Wellcome Trust voor een Center of Excellence Voor Leadoptimalisatie voor ziekten van de ontwikkelingswereld naar P. Wyatt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| New Zealand White Rabbits | Covance | - | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| THP-1 monocytic cell line | ATCC | ATCC TIB-202 | |
| 175 cm² TC-Treated Flask (T175) | Fisher Scientific | T-3400-175 | |
| RPMI 1640 media w/o glutamine | Fisher Scientific | MT-15-040-CV | |
| Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated | Fisher Scientific | SH3091003IR | |
| Hyclone L-glutamine, 200 mM | Fisher Scientific | SH3003401 | |
| Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented | Fisher Scientific | T-2881-1 | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Fisher Scientific | BP685-1 | |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Sigma | E6758 | |
| Oleic acid | Fisher Scientific | ICN15178101 | |
| Pierce RED Device Reusable Base Plate | Fisher Scientific | PI-89811 | |
| Pierce RED Device Inserts, 50/box | Fisher Scientific | PI-89809 | |
| Pierce RED insert removal tool | Fisher Scientific | 89812 | |
| Adhesive plate seal | Fisher Scientific | 08-408-240 | |
| PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco) | Life Technologies | 10010-049 | |
| DMSO | Sigma | 472301 | |
| Acetonitrile | Sigma | 34998 | |
| Methanol | Sigma | 34860 | |
| Verapamil hydrochloride | Sigma | V4629 | |
| Diclofenac sodium salt | Sigma | 93484 | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | Fisher Scientific | 15-250-061 | |
| Ethanol, 200 proof | Fisher Scientific | 04-355-451 | |
| 2010 Geno/Grinder | SPEX SamplePrep | 2010 | |
| Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads | Fisher Scientific | 15-340-158 | |
| 484R Cobalt 60 Irradiator | JL Shepard | 7810-484-1 | |
| INCYTO C-Chip Disposable Hemacytometers | Fisher Scientific | 22-600-100 | |
| Upright Light Microscope | Leica | DM1000 | |
| Binary Liquid Chromatography system | Agilent | 1260 | Multi-compenent |
| Mass spectrometer | AB Sciex | 4000 |
References
- Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis. Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).
- Zhang, Y. Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis. Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).
- Aber, V. R., Nunn, A. J. Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy. Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).
- Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis. Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).
- Dartois, V. The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells. Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).
- Prideaux, B., et al. The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions. Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).
- Sarathy, J. P., et al. Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions. ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).
- Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding. J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).
- Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma. J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).
- Liu, X., et al. Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid. Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).
- Able, S. L., et al. Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat. Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).
- Subbian, S., et al. Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response. Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).
- Via, L. E., et al. Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates. Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).
- Kalvass, J. C., Maurer, T. S. Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery. Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).
- Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis. J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).
- Lenaerts, A. J., et al. Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910. Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).
- Prideaux, B., et al. High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions. Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).
