Summary
Här visar vi en ny analys för att studera kall ciception i. Denna analys använder en specialbyggd Peltier sond som kan applicera en fokal skadlig kall stimulus och resulterar i mätbara kallspecifika beteenden. Denna teknik kommer att möjliggöra ytterligare cellulär och molekylär dissekering av kall nociception.
Abstract
Hur organismer känner och svara på skadliga temperaturer fortfarande dåligt kända. Vidare, mekanismerna bakom sensibilisering av den sensoriska maskiner, såsom hos patienter med perifer neuropati eller skada-inducerad sensibilisering, är inte väl karakteriserade. Den genetiskt lätthanterlig Drosophila modell har använts för att studera cellerna och gener som krävs för skadlig värmedetektering, vilket har gett flera bevarade gener av intresse. Lite är känt dock om cellerna och receptorer som är viktiga för skadliga kall avkänning. Även Drosophila inte överleva långvarig exponering för kyla (≤10 ° C), och kommer att undvika cool, föredrar varmare temperaturer i beteendepreferens analyser, hur de känner och eventuellt undvika skadliga kalla stimuli har nyligen undersökts.
Här beskriver vi och karaktärisera den första skadliga kyla (≤10 ° C) beteendeanalys iDrosophila. Med hjälp av detta verktyg och analys visar vi en utredare hur man kvalitativt och kvantitativt bedöma kalla nociceptiva beteenden. Detta kan göras under normala / friska odlingsbetingelser, eller förmodligen i samband med sjukdom, skada eller sensibilisering. Vidare kan denna analys användas för larver väljs för önskade genotyper, vilka kan påverka thermosensation, smärta eller nociceptiv sensibilisering. Med tanke på att smärta är en mycket konserverad process, med hjälp av denna analys för att ytterligare studera termisk nociception kommer sannolikt få fram viktig kunskap om smärtprocesser i andra arter, inklusive ryggradsdjur.
Introduction
Drosophila har visat sig vara mycket användbar för identifiering av nya bevarade gener och nervkretsar som ligger bakom komplexa beteenden. Flugor ge en sofistikerad genetisk toolkit och ett förenklat nervsystemet som medger exakt genetisk och neuronal manipulering 1, 2, 3, 4 att dissekera de cellulära och molekylära grunderna för nociception 5, 6, 7. Larver är särskilt användbara för dessa analyser, med tanke på att beteendemässiga analyser för lätt beröring 8, 9, 10, skadlig värme 11, 12, 13 och mekanisk känsla av skadliga stimuli 4, 11 har redan etablerats, och det transparenta larver nagelband möjliggör levande eller fixerad avbildning av epidermis och underliggande sensoriska neuroner. Nyligen har en analys för skadliga kallt också utvecklats 7, som vi beskriver mer i detalj här.
Med användning av en fin, konisk spets kall sond, visar vi att Drosophila larver uppvisar en uppsättning av kallspecifika reaktiva beteenden, distinkt från beteenden som observerats under normal förflyttning, efter lätt beröring, eller efter hårda mekanisk eller hög temperatur stimuli 7, 8, 11 . De kallspecifika beteenden inkluderar en robust hela kroppen kontraktion (CT), en 45-90º höjning av de posteriora segmenten (PR) och en samtidig höjning av den främre och bakre segment i en U-form (US). Prevalensen av dessa beteenden ökar med minskande temperaturer men varje toppar vid slätt olika kalla temperaturer. Senaste arbete tyder på att CT responser medieras av olika perifera sensoriska neuroner än de som svarar på skadliga värme eller hårda mekaniska stimuli 7.
Ungefär som ryggradsdjur nociceptorer, Drosophila multipel dendritisk (md) perifera sensoriska neuroner har komplexa dendritiska strukturer som arborize över epidermis 1. md neuroner är närvarande i varje larvkroppen segment, som skjuter sina axoner till den ventrala nervsträngen 14. md sensoriska neuroner är separerade i fyra olika klasser (I-IV) baserat på dendritisk morfologi och har varierande sensoriska funktioner 4, 9, 10, 15, 16, 17. Medan klass IV neuroner erfordras för larver lateral kroppsvalssvarför höga temperaturer eller hårda mekaniska stimuli 4, klass III neuroner erfordras för lätt beröring svar 9, 10 och är inte bara aktiveras av kallt, men också krävs för de kall framkallade beteendesvar 7. Både klass III och klass IV neuroner utnyttjar diskreta transient receptor potential (TRP) kanaler för att underlätta beteende svar på skadlig 7, 11, 18 och icke-skadliga stimuli 9, 10, 17, 19. Vidare är larv nociception sensibiliserad följande skada, vid de cellulära 20 och beteende nivåer 12, 21.
Analysen som beskrivs här gör det möjligt att quantification av antingen normal, eller potentiellt förändrade beteendereaktioner för kalla temperaturer som sträcker sig från skadlig kall (≤ 10 ° C), oskadligt cool (11-17 ° C), till omgivande temperaturer (18-22 ° C). De kalla temperaturerna som används i denna analys är i stånd att direkt aktivera klass III sensoriska neuroner, framkalla robusta, reproducerbara kalcium ökar och kall framkallade beteendesvar, som kan vara kvalitativt och kvantitativt analyserade 7. Denna analys kan appliceras på larver av praktiskt taget alla genotyp liksom till larver exponerades för olika miljöförhållanden (förändrad näring, skada, farmakologiska medel) för att bestämma både genetiska och miljömässiga faktorer som påverkar kallt nociception, nociceptiv sensibilisering eller nociceptiv plasticitet. Med tanke på att thermosensation är allestädes närvarande i många arter, ger denna analys ett värdefullt verktyg för att studera nociception och kan avslöja nya gen mål eller neuronala interaktioner som kommer att förbättravår förståelse av ryggradsdjur nociception.
Den specialbyggda kall sond (se kall sond, Table of Materials) utnyttjar en sluten slinga temperaturstyrd Peltier anordning, som kyler aluminiumaxeln och konisk spets genom värmeledning. En termistor är inbäddad inuti aluminium koniska spetsen rapporterar realtidstemperatur på kontrollenheten. En kylkropp och fläkten är fäst vid den termoelektriska modulen att reglera Peltier-effekten s värmebelastning (Qc), så det önskade temperaturområdet av (22-0 ° C) kan uppnås (se Thermal Control Unit, Table of Materials). Den skadliga kall stimulans av det kalla sondspetsen anbringas för hand för att ryggens mittlinje, till segment (s) på lika avstånd från främre och bakre ändar (grovt segment A4, se fig 1A) hos larven. Som svar på kalla stimuli, larver i allmänhet producera en av tre kalla framkallade beteenden inom en 10 s cutoff: en hel kroppkontraktion (CT), en 45-90º höjning av främre och bakre segmenten till en U-form (US), eller en höjning av de posteriora segmenten (PR) (beskrivna i resultat). Ingen av dessa beteenden utförs under normal peristaltiska förflyttning eller födosökande beteende. Dessa beteenden är också skild från mjuka berörings svar och den aversiva vals respons på hög temperatur eller skadliga mekaniska stimuli.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Framställning av Larver
- Höj aktier eller genetiska korsningar i en 25 ° C inkubator.
- Om odling ett kors, använda 20-25 jungfru honor och 15-20 män per flaska innehållande vanlig majsmjöl fly media. Låt honor att lägga ägg i ungefär 48 timmar innan du överför dem till en ny flaska med mat.
- 4-5 dagar efter äggläggningen, samla 3: e instar larver av den önskade genotypen genom att försiktigt spruta en ström av vatten in i mosig mat och larver, och hälla ut innehållet i ett medelstort, ren petriskål (60 mm x 15 mm).
- Nästa, försiktigt sortera larver efter storleks med pincett eller en pensel för att utesluta större "vandrande 3: e instar" eller liten sjuklig larver från att testas. Släng larver innehållande eventuella oönskade genetiska markörer eller balanserare.
- Ha en kollega lab medlem etikett rätter eller behållare där sorterade larver kommer att placeras så att försöksledaren kan vara "blind" för experimental tillstånd eller genotyp av larver i tillämpliga fall. Försöksledaren kan tillämpa avkodade etiketter till insamlade data efter experimentet med användning av en nyckel som genereras av en labb medlem.
- Med användning av en Spatel, överföra en dime-sized mängd färsk mat i en (35 mm x 10 mm eller 60 mm x 15 mm) ren, märkt petriskål fylld halv-sätt med vatten av rumstemperatur.
- Rör försiktigt sorterade larver till maten (för att förhindra svält eller uttorkning om testning förväntas ta mer än 20 min) med hjälp av pincett eller pensel.
2. Cold Probe Assay
- Slå på den kalla sondenheten medger några min för det svalna till den önskade temperaturen. Om inställningen till lägre temperaturer, kommer kondens sannolikt bildas längs sonden.
- Torka bort all fukt med ett laboratorium torka innan ansökan till larven. När den inte omedelbar användning, plats isolerande locket på sonden både isolera och hålla spetsen ren och förhindra skador.
- Placera en mitten 3: e instar larver på ett tunt stycke av mörk rörliga vinyl (typiskt, använda en liten bit skärs från en anteckningsbok bindemedel) under ett ljusfältmikroskop. De svarta vinyl hjälpmedel i kontrast visualisering och i flytta larven utan att röra den för att anpassa den ordentligt med sonden.
- Justera mikroskopet (se tabell of Materials) och ljusenhet (se tabell of Materials) till medelljusheten (50-75% max ljusstyrka) för att tillhandahålla kontrast och hindra larven från att torka ut för snabbt.
- Kasta alla larver som inte först uppvisar normala peristaltiska förflyttning som de skulle kunna förvirra resultaten. Larven bör vara fuktig från petriskål av vatten annars larven fastnar på vinyl inhibera normal förflyttning. Vatten bör inte pöl runt larven.
- Avancera sonden för hand mot larven vid en 90 ° vinkel mot anteroposterior kroppsaxeln, med hjälp av vinyl att flytta larven till correct läge (se figur 1A).
- Orientera spetsen av proben till försiktigt lägga över mitten dorsala ytan av larven med sonden vid ungefär en 45 ° vinkel i förhållande till mikroskop scenen.
- Vid sond kontakt starta en laboratorie timer. Applicera tillräckligt nedåtriktat tryck till lätt indrag ytan av larver nagelband samtidigt som fortfarande framåt eller bakåt.
- Hålla sonden på plats för upp till 10 s eller tills en kall-evoked beteendegensvar observeras - beroende på vilket som inträffar först. Ta sedan bort sonden.
- Anteckna observerade beteendesvar och svaret latens. Larver som inte svarar inom 10 s anses vara "icke-responders". Latens kan också registreras för responders och användes för att mäta förändringar i svars robusthet / amplitud.
- Kasta larv och förbereda nästa.
- Upprepa steg 2,3-2,11 tills det önskade antalet av test larver uppnås (tre uppsättningar av n = 20-40 larver var used här).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Drosophila larver rör sig med en peristaltisk rörelse som inkluderar enstaka pauser, huvud svängar, och förändringar i riktningen 22. Som svar på fokal applicering av en skadlig kall stimulus dock larver uppvisar en uppsättning unika beteenden, till skillnad från den aversiva lateral rulle till skadlig värme och mekaniska stimuli. Dessa beteenden är också olika från svar på lätt beröring 8, 9, 10 eller vid beröring av ett rum temperatursond. De kall framkallade beteenden är som följer: scrunching i en kontraktion (CT), höjning av deras främre och bakre segment (cirka 45-90 °) till luft, deras främre och bakre segmenten mot mitten av sin kropp att göra en U- form (US), eller höja endast sina bakre segment (cirka 45-90 °) till luften (PR) (Figur 1). försöksledarenbör informeras om att dessa beteende beskrivningar är kvalitativa riktlinjer snarare än kvantitativa cut-off. Dessa svar observeras över ett område av kalla temperaturer från 3-18 ° C (Figur 2A). Emellertid olika beteenden topp över olika kalla intervall (figurerna 2B och 2C): 3-8 ° C för PR och USA och 9-14 ° C för CT. CT är den enda kallframkallat svar ibland observeras i liten andel av larver som svar på lätt beröring, med användning av en rumstemperatur (RT) sond (Figur 2). Latens information kan också samlas in och jämfördes statistiskt med användning av denna analys (se nedan för statistiska test som används), som kan ge intressant information efter skada eller andra miljöförhållanden.
Att jämföra latenser hos de olika kalla beteenden, var kall framkallade responser mätt upp till en 20 s skiljer av tre kall till-cool temperaTures (3, 10 och 20 ° C) samt till en rumstemperatur (RT) sond och ritas som kumulativa svar observerades över tid (Figur 3). Först, observerade vi att de flesta reaktioner på kalla temperaturer (3 ° C och 10 ° C) observeras mellan 1 och 10 s efter sondapplikation (Figur 3A - 3B) medan CT-svar tycks ha längre frekvenser vid oskadliga temperaturer (20 ° C och rums temperatur (RT), Figur 3C - 3D). För det andra, även om US, PR och CT respons kontra latency kurvorna skilde sig inte signifikant från varandra vid 3 ° C (figur 3A) vid 10 ° C, 20 ° C och RT, CT svaret jämfört latency kurvor var signifikant olika från US och / eller PR , medan US och PR-kurvorna skilde sig inte signifikant från varandra vid någon testad temperatur (genom Long-rank (Mantel-Cox) och Gehan-Breslow-Wilcoxon-test, Figur 3B - 3D (figur 3E). För denna typ av kategoriska jämförelse framställdes kall evoked grupperade i tre latens kategorier: mindre än 4 s, mellan 4-10 s, och mellan 11-20 s (Figur 3E - 3H). Den procentuella andelen av responders för varje beteende representeras som en andel av responders som faller inom varje kategori hastighet (resultaten jämfördes statistiskt mellan beteenden genom arxc kontingenstabell). Igen, avslöjade denna analys inga signifikanta skillnader mellan PR och US latens svar (Figur 3E - 3H), men CT svar var signifikant skilda från PR vid 3 ° C och 10 ° C, och från US vid alla temperaturer testades inklusive RT-sonden (Figur 3E - 3F). Sammantaget visar dessa datavisar att en 10 s assay cut-off är mer än tillräckligt för att samla in meningsfulla datauppsättningar, och att den kall framkallade CT svar inträffar vid relativt längre latenser än USA eller PR-svar. Eftersom det finns en viss variabilitet i svar från larv till larv, testade vi tre uppsättningar av 20 larver vid varje temperatur och rapporteras standardfelet av medelvärdet för varje svar (Figur 3E - 3H).
Eftersom larv storlek (och därför den relativa storleken på den kalla stimulus) kan variera mycket mellan tidig och sen 3:e instar larver, tidigt, mitten och slutet av 3: e larver testades vid 3 ° C och 10 ° C och deras svar jämfördes (Figur 4) . Fyra till fem dagar gamla larver kulturer användes för att samla in larver som sedan grupperades i början, mitten eller slutet av 3: e stadiet stegen ungefär av sin längd / storlek (Figur 4). Intressant, vissa Response variabilitet sågs mellan utvecklingsstadier beroende på temperaturen som testas. Vid 3 ° C, tidig 3: e instar larver uppvisade färre PR- och US responders och mera CT responders (figurerna 4A - 4C). Vid 10 ° C emellertid inget svar varierade väsentligen över utvecklingsstadier (fig 4D - 4F). Att jämföra de totala procent responders vid de 10 s cut-off för varje uppträdande vid 3 ° C eller 10 ° C visar att endast tidiga 3: e instar larver har signifikant olika PR och CT svar vid 3 ° C (figurerna 4G och 4H).
Klass III multipla dendritiska sensoriska neuroner påverkas direkt av kalla temperaturer och krävs för CT-svar till den kalla sonden 7. Robusta CT svar kan också uppstå när en kall stimulus anbringas till främre regioner av larva (huvudet) (figur 5B). För att bestämma om kall framkallade responser resulterar från direkt stimulering av huvudet också kräva md neuroner (inklusive klass III) en kall stimulans försiktigt appliceras på huvudet av larver (figur 5A) som uttrycker ett tetanustoxin transgen i alla md sensoriska neuroner effektivt elektriskt tysta dem 3. När larver stimuleras på huvudet med kall (6 ° C), produceras fortfarande en stor andel av larver en CT svar, trots md neuroner tystas (figur 5B). Dessa data tyder på md neuroner krävs inte för en kall-framkallade CT när sondering huvudet, och detta svar måste därför kräva andra typer av sensoriska neuroner, vilka kunde identifieras med hjälp av detta verktyg och analys.
Figur 1: Cold sondanalys. (A) Diagram kall sond ansökan till 3: e instar kontroll (vikt 1118) larv. Aluminium kall sondspets, inställd till den önskade temperaturen, är lätt placeras på den dorsala A4 segmentet av larven för upp till 10 s medger fri rörelseområde. (B) En tvärsektion av larven som indikerar vinkeln av sonden som det tillämpas. Sonden bör hållas vid en ungefärlig 45 ° vinkel mot mikroskopets objektbord (streckad linje), och vinkelrätt mot anteroposterior kroppsaxeln av larven under stimulering. (C) Diagram av de tre kalla framkallade beteenden observeras: (i) Sammandragning (CT) hos främre och bakre mot centrum av larvkroppen (gråa pilarna), (ii) U-bord (US): en 45- 90 (streckade linjer) höja den främre och bakre, och (iii) posterior Höj (PR): a 45-90 (streckade linjer) höjning av den bakre av huvudet och svansen mot centrum av larvkroppen (grå pilar) .
Figur 2: Kallframkallat svar som funktion av temperaturen. (A) Procent av responders i mitten 3: e instar kontroll (vikt 1118) larver över ett område av kalla temperaturer (3-22 ° C) eller rumstemperatur (RT) sond. (B) Procent av PR, USA och (C) CT responders vid olika kalla temperaturer med toppsvar anges. (A - C) PR: posterior höjning, US: U-bord, CT: Contract. Felstaplar är standardfelet för medelvärdet för 3 uppsättningar av n = 40 larver, medelvärdessvar. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figure 3: Kall framkallade svaret latens mot temperatur. (A - D) Procent av kumulativ US (röd), PR (blå) eller CT (grön) responders till kall sond vid olika temperaturer (3º C, 10 ° C, 20 ° C och RT) över tiden (1-20 s) i kontroll (vikt 1118) larver. (E - H) Genomsnittliga proportioner av snabb (<4 s), långsam (4-10 s), och sent (11-12 s) svarar larver till kall sond vid olika temperaturer (3º C, 10 ºC, 20 ° C och RT ). (A - H) För varje temperatur, n = 3 uppsättningar av 40 larver testades. PR: posterior höjning, US: U-bord, CT: Contract, RT: Rumstemperatur. (A - D) NS: inga signifikanta skillnader mellan datamängder, * = p-värde <0,05, ** = p-värde <0,0001 med Long-rank (Mantel-Cox) testet och Gehan-Breslow-Wilcoxon-testet. (EH) Felstaplar indikerar sem * = p-värde <0,05, ** = p-värde <0.0001 genom arxc kontingenstabell. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Kall framkallade svaret latens i början, mitten och slutet av 3: e instar larver. Procent kumulativa responders till en (A - C) 3 ° C eller (D - F) 10 ° C kall sond över tiden (1-20 s) i början av (svart), mellan (orange) eller sen (grön) 3: e instar kontroll ( w 1118) larver. Responser kontra latens är åtskilda av beteende: PR (A, D), US (B, E), CT (A - F). * = P-värde <0,05, ** = p-värde <0,001 efter Long-rank (Mantel-Cox) testet och Gehan-Brelångsam-Wilcoxon-testet. (G - H) Procent av kumulativa responders till en (G) 3 ° C eller (H) 10 ° C kall sond inom 10 s i början, mitten eller slutet av 3: e instar larver. Felstaplar indikerar sem * = p-värde <0,05 genom tvåsvansat Fishers exakta test. n = 3 uppsättningar av 20 larver. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: När stimuleras i huvudet, behöver kall framkallade CT responser inte kräva md sensoriska neuroner. (A) Schematisk av kall sond analys när anterior stimuleras i 3: e stadiet larv. (B) Genomsnittliga procent CT responders till kall sond (6 ° C) när larver stimuleras i den mest anterieller segment. Grå staplar: Genetiska kontroller, grön stapel: alla md neuroner tystas genom uttryck av tetanustoxin transgenen. En inaktiv form av tetanustoxin-transgenen användes som en ytterligare kontroll ( 'Inaktiv Tetanus'), n = 3 uppsättningar av 30 larver per genotyp. Grön stapel var inte signifikant reducerad från alla relevanta genetiska kontroller genom tvåsvansat Fishers exakta, test * p-värde <0,05. (B) Genotyper används (vänster till höger): w 1118 (kontroll), UAS-inaktiv tetanus / + (UAS ensam kontroll), UAS-tetanus / + (UAS ensam kontroll), MD-Gal4 / + (Gal4 ensam kontroll) , MD-Gal4 / UAS-inaktiva tetanus (inaktiv tetanus kontroll uttrycks i alla md neuroner), och MD-Gal4 / UAS-aktiv tetanus (försöksbetingelserna-aktiv tetanus uttrycks i alla md neuroner). Klicka här för att se en större version av denna siffra. </ P>
Tabell 1: flyga recept mat för kall prob-analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Den analys som beskrivs här kan användas för att kvalitativt och kvantitativt utvärdera nociception eller nociceptiv sensibilisering i larver av olika genetiska bakgrunder, miljöpåverkan, och / eller skada-inducerad betingelser. Eftersom denna analys gör det möjligt för fokal applicering av en kall stimulans, med detta verktyg kan man bedöma funktionen av en underuppsättning av perifera sensoriska neuroner specifikt i att svara på kalla temperaturer. Interestingly, dessa kalla-framkallade beteenden tycks utnyttja olika klasser av sensoriska neuroner än de aktiveras av värme 7, 11, men den fullständiga termiska nociceptiva krets är ännu inte helt klarlagda. Liksom många andra lokala nociceptiva analyser denna analys är föremål för en viss variation mellan användare, beroende på tillämpningen av den kalla sonden. Men den specifika placeringen av den kalla sonden i mitten av kroppen (undvika huvud och svans) inte verkar ha en significant inverkan på kalla svar 7. Praxis och upprepning kan minimera denna inter-användare variabilitet.
Vi tidigare känne den kalla sonden analysen och rapporteras de specifika kallkänsliga neuroner och sensoriska kanaler krävs för att producera CT svar 7. Här har vi ytterligare karakterisera hur latens data kan kvantifieras och analyseras som en annan nociceptiv åtgärd analysera data från längre cut-off poäng för att bestämma den mest optimala tidsfönstret för analysen. Vi fann att de flesta av kall framkallade reaktioner sker inom 10 sekunder av stimulans ansökan, vilket gör en 10 andra avskurna både ekonomiskt och effektivt. Dessutom, med tanke på att olika kall framkallade beteenden topp vid olika temperaturer, de latenser av dessa svar är viktigt att analysera separat, som gjort här, att till fullo uppskatta robustheten i olika svar vid olika temperaturer. Vi visar också, beroende på beteendet är analyzed, hur larver storlek kan påverka kall framkallade svar. Därför kommer hålla larver storlek konsekvent i alla beteendeexperiment vara nödvändiga. Slutligen visar vi hur denna analys kan användas för att identifiera eller utesluta, uppsättningar av sensoriska neuroner är involverade i kallt nociception som tycks variera beroende på var kall stimulans till larven.
Nu när en baslinje kall nociception analys existerar, kan vi integrera metoder för skador och / eller sensibilisering att ställa mer komplicerade frågor om smärta biologi. Till exempel, är det känt att sidosvar kroppen rulle till oskadliga eller skadlig värme sensibiliseras efter UV skada på epidermis, som kräver specifika genetiska mediatorer och TRP-kanaler 12, 20, 21. Om liknande UV skador på epidermis resulterar i sensibiliserade kalla svaren och om liknande genetiska vägar är inblandade är okänd. Likaledes,
Det finns ett antal statistiska tester som bör övervägas att använda denna analys. Den statistiska testet vi använde oftast är Fischers exakta test med en Bonferroni korrektion för multipla jämförelser eller chi-square test. Dessa tester används när man jämför de genomsnittliga responders i stapeldiagram form (dvs i fig 3E - 3H, Figur 4G - 4H och figur 5B). För att jämföra kumulativa latenser i linje grafisk form, använde vi Lång-rank (Mantel-Cox) testet 27, 28 och Gehan-Breslow-Wilcoxontestet 29, 30 vilka båda är typiskt för att jämföra överlevnadsfördelningar. Vi föreslår tre uppsättningar av 20-40 larver för varje genotyp / experiment för att möjliggöra beräkning av standardfel av medelvärdet mellan upprepade uppsättningar.
Att dra slutsatsen, medger denna analys för exakt applicering av en skadlig kall stimulus och de resulterande beteendereaktioner i Drosophila larver har karakteriserats. Det finns fortfarande mycket vi inte vet om cellerna och gener som krävs för nociception i flugor eller ryggradsdjur. Med denna analys kan man utnyttja den mycket lätthanterlig Drosophila-systemet för att snabbt screena för konserverade gener avgörande för baslinjen nociception identifiera nociceptiva kretsar och bedöma cellulära och genetiska förändringar som sker efter vävnadsskada för att orsaka nociceptiv sensibilisering. I slutändan kommer denna analys att hjälpa smärtan fältet får värdefull information om smärta biologi i ett system somkan lätt tillämpas på mer komplexa djurmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
En USA-patentansökan (CL) pågår på utformningen av den kalla sonden. Ytterligare information om detaljer i kall sond artikelnummer och konstruktion, samt ytterligare rådgivning på verktygskonstruktion kommer att tillhandahållas på begäran.
Acknowledgments
Vi tackar Sarah Wu och Camille Graham för att utveckla tidiga faser av den kalla sonden analysen Bloomington Drosophila Lager Center for flyga lager och Galko lab medlemmar för kritiskt läsa manuskriptet. Detta arbete stöddes av NIH NRSA (NIH F31NS083306) till HNT och genom NIH R01NS069828, R21NS087360 och University of Texas MD Anderson Clark gemenskap i grundforskning till MJG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351008 | |
| 60mm x 10 mm Polystyrene Petri dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 inches x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
- Grueber, W. B., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Tiling of the Drosophila epidermis by multidendritic sensory neurons. Development. 129 (12), 2867-2878 (2002).
- Gao, F. B., Brenman, J. E., Jan, L. Y., Jan, Y. N. Genes regulating dendritic outgrowth, branching, and routing in Drosophila. Genes Dev. 13 (19), 2549-2561 (1999).
- Sweeney, S. T., Broadie, K., Keane, J., Niemann, H., O'Kane, C. J. Targeted expression of tetanus toxin light chain in Drosophila specifically eliminates synaptic transmission and causes behavioral defects. Neuron. 14 (2), 341-351 (1995).
- Hwang, R. Y., et al. Nociceptive neurons protect Drosophila larvae from parasitoid wasps. Curr Biol. 17 (24), 2105-2116 (2007).
- Im, S. H., Galko, M. J. Pokes, sunburn, and hot sauce: Drosophila as an emerging model for the biology of nociception. Dev Dyn. 241 (1), 16-26 (2012).
- Milinkeviciute, G., Gentile, C., Neely, G. G. Drosophila as a tool for studying the conserved genetics of pain. Clin Genet. 82 (4), 359-366 (2012).
- Turner, H. N., et al. The TRP Channels Pkd2, NompC, and Trpm Act in Cold-Sensing Neurons to Mediate Unique Aversive Behaviors to Noxious Cold in Drosophila. Curr Biol. , (2016).
- Kernan, M., Cowan, D., Zuker, C. Genetic dissection of mechanosensory transduction: mechanoreception-defective mutations of Drosophila. Neuron. 12 (6), 1195-1206 (1994).
- Tsubouchi, A., Caldwell, J. C., Tracey, W. D. Dendritic filopodia, Ripped Pocket, NOMPC, and NMDARs contribute to the sense of touch in Drosophila larvae. Curr Biol. 22 (22), 2124-2134 (2012).
- Yan, Z., et al. Drosophila NOMPC is a mechanotransduction channel subunit for gentle-touch sensation. Nature. 493 (7431), 221-225 (2013).
- Tracey, W. D. Jr, Wilson, R. I., Laurent, G., Benzer, S. painless, a Drosophila gene essential for nociception. Cell. 113 (2), 261-273 (2003).
- Babcock, D. T., Landry, C., Galko, M. J. Cytokine signaling mediates UV-induced nociceptive sensitization in Drosophila larvae. Curr Biol. 19 (10), 799-806 (2009).
- Chattopadhyay, A., Gilstrap, A. V., Galko, M. J. Local and global methods of assessing thermal nociception in Drosophila larvae. J Vis Exp. (63), e3837 (2012).
- Grueber, W. B., et al. Projections of Drosophila multidendritic neurons in the central nervous system: links with peripheral dendrite morphology. Development. 134 (1), 55-64 (2007).
- Hughes, C. L., Thomas, J. B. A sensory feedback circuit coordinates muscle activity in Drosophila. Mol Cell Neurosci. 35 (2), 383-396 (2007).
- Zhong, L., Hwang, R. Y., Tracey, W. D. Pickpocket is a DEG/ENaC protein required for mechanical nociception in Drosophila larvae. Curr Biol. 20 (5), 429-434 (2010).
- Xiang, Y., et al. Light-avoidance-mediating photoreceptors tile the Drosophila larval body wall. Nature. 468 (7326), 921-926 (2010).
- Neely, G. G., et al. TrpA1 regulates thermal nociception in Drosophila. PLoS One. 6 (8), e24343 (2011).
- Zhou, Y., Cameron, S., Chang, W. T., Rao, Y. Control of directional change after mechanical stimulation in Drosophila. Mol Brain. 5, 39 (2012).
- Im, S. H., et al. Tachykinin acts upstream of autocrine Hedgehog signaling during nociceptive sensitization in Drosophila. Elife. 4, e10735 (2015).
- Babcock, D. T., et al. Hedgehog signaling regulates nociceptive sensitization. Curr Biol. 21 (18), 1525-1533 (2011).
- Berrigan, D., Pepin, D. J. How Maggots Move - Allometry and Kinematics of Crawling in Larval Diptera. J. Insect Physiol. 41 (4), 329-337 (1995).
- Galko, M. J., Krasnow, M. A. Cellular and genetic analysis of wound healing in Drosophila larvae. PLoS Biol. 2 (8), E239 (2004).
- Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation. Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).
- Dar, A. C., Das, T. K., Shokat, K. M., Cagan, R. L. Chemical genetic discovery of targets and anti-targets for cancer polypharmacology. Nature. 486 (7401), 80-84 (2012).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
- Gill, R. D. Multistate life-tables and regression models. Math Popul Stud. 3 (4), 259-276 (1992).
- Mantel, N. Ranking procedures for arbitrarily restricted observation. Biometrics. 23 (1), 65-78 (1967).
- Breslow, N. A generalized Kruskal-Wallis test for comparing K samples subject to unequal patterns of censorship. Biometrika. 57 (3), 579-594 (1970).
- Gehan, E. A. A generalized wilcoxon test for comparing arbitrarily singly-censored samples. Biometrika. 52, 203-223 (1965).
