Summary
Cet article décrit la cytométrie spectrale, une nouvelle approche en cytométrie de flux qui utilise les formes des spectres d'émission pour distinguer fluorochromes. Un algorithme remplace compensations et peut traiter auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Cette nouvelle approche permet l'analyse correcte des cellules isolées à partir d'organes solides.
Abstract
cytométrie de flux a été utilisé pour les 40 dernières années pour définir et analyser le phénotype de lymphoïdes et d'autres cellules hématopoïétiques. Dans un premier temps limité à l'analyse de quelques fluorochromes, actuellement il y a des dizaines de différents colorants fluorescents, et jusqu'à 14-18 colorants différents peuvent être combinés à la fois. Cependant, plusieurs limitations portent encore atteinte à la capacité d'analyse. En raison de la multiplicité des sondes fluorescentes, l'analyse des données est devenue de plus en plus complexe en raison de la nécessité de grandes matrices de compensation multi-paramétrique. En outre, des modèles de souris mutantes portant des protéines fluorescentes pour détecter et oligo-types de cellules spécifiques dans différents tissus sont devenus disponibles, l'analyse (par cytométrie de flux) de suspensions de cellules auto-fluorescence obtenues à partir d'organes solides est nécessaire. Spectral cytométrie de flux, ce qui distingue les formes des spectres d'émission le long d'une large gamme de longueurs d'onde continue, traite certains de ces problèmes. Les données sont analysées wvec un algorithme qui remplace les matrices de compensation et traite auto-fluorescence comme un paramètre indépendant. Ainsi, la cytométrie de flux spectral doit être capable de distinguer fluorochromes avec des pics d'émission similaires et peut fournir une analyse multi-paramétrique sans exigences de compensation.
Ce protocole décrit l'analyse de cytométrie de flux spectral, ce qui permet un 21 paramètre (19 sondes fluorescentes) la caractérisation et la gestion d'un signal d'auto-fluorescent, fournissant une haute résolution dans la détection de la population mineure. Les résultats présentés ici montrent que le flux spectral présente cytométrie avantages dans l'analyse des populations cellulaires des tissus difficiles à caractériser en cytométrie de flux classiques, tels que le cœur et l'intestin. cytométrie de flux spectral démontre ainsi la capacité d'analyse multi-paramétrique offrant un rendement élevé cytométrie de flux classique, sans l'exigence de compensation et permet la gestion automatique de la fluorescence.
Introduction
Au cours des dernières décennies, la cytométrie de flux (FCM) est devenu une méthode d'analyse largement disponible essentielle pour les études de phénotypage cellulaire. Il y a eu une augmentation substantielle des colorants fluorescents disponibles, en particulier des fluorochromes excités par le laser violet (405 nm) (par exemple, Violet brillant et nouveaux colorants Q-dot). Cependant, la croissance des colorants fluorescents disponibles augmente le risque d'émissions qui se chevauchent et nécessite des matrices de compensation de main-d'œuvre. La FCM est devenu largement utilisé pour analyser des suspensions de cellules de tissu solide, mais la présence de cellules auto-fluorescence limite la discrimination des populations spécifiquement marquées.
Les principes de base de la FCM spectrale sont décrites en détail dans Futamura et al. 1, 2. En bref, la FCM spectrale utilisée ici (voir la table des matières) est équipé de 405, 488, et les lasers 638 nm. La FCM spectrale capture toutes les f émisluorescence comme des spectres dans un de 500 nm à 800 nm et 2 PMT indépendants pour 420 nm à 440 nm et de 450 nm à 469 nm, respectivement, qui remplacent les filtres passe-bande classiques réseau linéaire PMT (32CH PMT) 32 canaux. Les 488 et les spots laser 405/638 nm sont séparés dans l'espace, tandis que les 405 nm et 638 nm spots laser sont colinéaires. Pour chaque particule individuelle, les mesures spectrales de la FCM jusqu'à 66 canaux de données de fluorescence excité par le 405 nm et 488 nm lasers. Lorsque les cellules sont excités par le laser 638 nm, la mesure spectrale FCM 58 canaux de données de fluorescence en raison d'un masque est inséré pour empêcher le laser 638 nm de briller dans le PMT. Spectral FCM analyse les données acquises à spectre complet avec un algorithme basé sur la méthode des moindres carrés pondérée (WLSM), ce qui permet la séparation du chevauchement des spectres de fluorescence. Spectra dérivé à partir des échantillons mono-colorées et non colorées sont reconnus comme étant les spectres de référence de base. échantillons multi-colorés sont mathématiquement équipés d'unnd mélange, et le spectre d'un échantillon avec des marqueurs fluorescents mixtes est décomposé en un ensemble de ses spectres constituant. La déconvolution, dans la technologie spectrale 3, 4, remplace la compensation qui élimine les signaux de tous les détecteurs , à l' exception d' une mesure d' un colorant donné.
Dans cette étude, nous avons combiné et testé 19 fluorochromes en une seule analyse 21 paramètres qui caractérisait les principaux sous-ensembles de hématopoiétiques trouvés dans la rate de la souris. De plus, nous avons démontré que la cytométrie spectrale peut gérer le signal auto-fluorescent, améliorant ainsi la caractérisation des lymphocytes intra-épithéliales de l'intestin et du cœur embryonnaire. En effet, dans ces tissus, la gestion auto-fluorescence permis pour l'attribution de la fluorescence spécifique des cellules qui seraient exclues de l'analyse de la FCM conventionnelle.
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Protocol
Toutes les expériences ont été réalisées conformément à la Charte Institut Pasteur et Ethic les lignes directrices de l'UE et ont été approuvés par le ministère français de l'Agriculture.
1. Suspension Préparation des cellules de souris adultes organes
- Isolement de splénocytes
- Euthanasier souris adultes par dislocation cervicale. Faire une incision au niveau de la ligne médiane de l'abdomen et ouvrir la peau avec des ciseaux. Récolter la rate avec une pince.
- Écraser la rate entre deux lames de microscope en verre pour dissocier les cellules et les diluer dans 5 ml de solution salée équilibrée de Hank (HBSS) contenant du sérum de veau foetal à 1% (FCS).
- Centrifuger pendant 10 min à 120 x g et 4 ° C. Jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot dans 5 ml de HBSS 1% FCS. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer en utilisant un colorant vital bleu Trypan.
REMARQUE: les cellules 80 millions doit être obtenu à partir d'une rate adulte.
- isolatisur des cellules de l'intestin grêle,
- Euthanasier souris adultes par dislocation cervicale. Avec des ciseaux, faire une incision dans la peau au niveau de la ligne médiane de l'abdomen. Attrapez le petit intestin avec des pinces dans une main et utiliser des ciseaux pour couper aux deux extrémités: d'abord, juste après l'estomac, puis à la fin du petit intestin, juste avant le gros intestin. Rincer l'intestin grêle avec une solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 1x en utilisant une seringue de 2 ml avec une aiguille.
- Mettez le petit intestin sur une serviette en papier et retirez soigneusement les plaques de Peyer avec une paire de ciseaux pointus.
- Utilisez des ciseaux pour ouvrir l'intestin sur son côté long en insérant une branche des ciseaux à l'intérieur de l'intestin. Couper l'intestin ouvert en morceaux de 1 cm à l'aide de ciseaux pointus.
- Incuber pendant 30 min à 37 ° C sous agitation constante dans 30 ml de HBSS avec 10% de FCS.
- Placer la suspension de cellules avec les autres fragments non dissocié dans un 50 mlle tube en plastique et vortex pendant 5 minutes à grande vitesse. NOTE: Il n'y a pas encore de dissociation du tissu.
- Incuber pendant 10 min sur de la glace pour permettre les grands fragments non dissociés pour former un culot.
- Récupérer le surnageant et on concentre par centrifugation pendant 7 minutes à 120 x g.
- Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 10 ml de HBSS avec 1% de FCS. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer en utilisant un colorant vital bleu Trypan.
NOTE: ~ 60 millions de cellules intra-épithéliales (LIE) doivent être obtenus auprès d'un adulte petit intestin.
- Panel stratégie de conception
- Préparer les panneaux avec des anticorps couplés directement avec des fluorochromes.
REMARQUE: Tous les anticorps sont titrés précédemment pour obtenir la définition optimale des populations de cellules (le titrage peut varier avec le lot d'anticorps). Les anticorps utilisés dans le panneau de 19 couleur pour colorer les splénocytes sont répertoriés dans le tableau 1. - Construire multi-colopanneaux r pour cytométrie. Comme cela peut être une tâche difficile, respectez les consignes suivantes pour optimiser les panneaux:
- Vérifier la configuration spectrale et les colorants fluorescents qui peuvent être utilisés sur l'instrument.
- Utilisez les informations Index Luminosité / Index fourni par le Staining fabricant.
REMARQUE: L'indice de luminosité / Index est l'indicateur Staining relatif de l'intensité de fluorescence par rapport à fond pour chaque fluorochrome. - Choisissez les anticorps suivant les règles ci-dessous:
- Choisissez les plus brillants fluorochromes pour des protéines qui sont faiblement exprimées et les plus obscures pour les protéines fluorochromes plus fortement exprimées.
REMARQUE: Par exemple, CD45, CD4 et CD8 sont fortement exprimés et peuvent être utilisés avec des fluorochromes dim. - Commencez la conception du panneau en choisissant d'abord les anticorps avec le plus petit nombre de possibilités de colorant fluorescent.
- Si possible, choisir des colorants fluorescents ayant le plus petit chevauchement des spectres d'émission fOu des marqueurs exprimés sur les mêmes types de cellules.
REMARQUE: Les tandems ( p. Ex., PE-Cy5, PE-Cy7 et PerCP-Cy5.5) doivent être utilisés avec précaution car ils sont plus sensibles à la dégradation par exposition à la lumière.
- Choisissez les plus brillants fluorochromes pour des protéines qui sont faiblement exprimées et les plus obscures pour les protéines fluorochromes plus fortement exprimées.
- Préparer les panneaux avec des anticorps couplés directement avec des fluorochromes.
- Coloration des cellules pour l'analyse de la cytométrie
- Préparez un tube de 5 ml avec 1 x 10 6 splénocytes et un tube de 5 mL avec 1 x 10 6 cellules intestinales et gardez-les non colorés pour être utilisés comme témoins négatifs.
- Préparer et étiqueter un tube de 5 mL par échantillon et par panneau selon le tableau 1 . Préparer le mélange d'anticorps, selon le tableau 1 , dans HBSS 1% FCS.
- Transférer 1 x 10 6 cellules - soit des splénocytes ou des cellules intestinales - dans chaque tube de 5 ml. Ajouter 2 mL de HBSS 1% de FCS et centrifuger pendant 5 min à 4 ° C et 120 x g. Jeter le surnageant et remettre à nouveau le culot dans 50 μL de mélange d'anticorps.
- Étiquette le splenocytes en 2 étapes. Tout d'abord, en utilisant 50 uL du mélange contenant les anticorps marqués avec PE-Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5,5, et PerCP (avec blocage du récepteur Fc) dans un tube de 5 mL. Après 20 min d'incubation dans l'obscurité à 4 ° C, ajouter 50 ul du mélange contenant tous les autres anticorps dirigés contre un tube de 5 mL.
NOTE: Cette stratégie limite l'encombrement stérique. - Incuber pendant 20 min à l'obscurité à 4 ° C.
- Ajouter 2 ml de HBSS à 1% de FCS et centrifuger pendant 5 min à 4 ° C et 120 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 200 pl de HBSS à 1% de FCS à 0,5 ug / mL d'iodure de propidium (PI).
2. Préparation d' une seule coloration pour chaque fluorochrome sur la rémunération des commerciaux perles Microsphères (par exemple, Ultracomp eBeads), appelé ci - après Perles
- Préparer et étiqueter autant de tubes 5 ml que le nombre d'anticorps qui sont utilisés dans les panneaux. Placer 1 goutte de perles dans chaque tube et ajouter 1 & #181; L d'anticorps par tube.
NOTE: Les perles perles utilisées ici (voir la table des matières) contiennent tachée (positif) et non colorées (négatives). Les anticorps sont mis en excès sur les perles pour assurer un signal lumineux et ainsi une signature spectrale claire pour chaque colorant. Ceci est requis par le logiciel pour pouvoir faire un unmixing précis. - Incuber pendant 20 min à l'obscurité à 4 ° C.
- Ajouter 2 ml de HBSS à 1% de FCS et centrifuger pendant 5 min à 120 x g. Jeter le surnageant et remettre en suspension le culot dans 100 pl de HBSS à 1% de FCS.
3. La suspension Préparation des cellules de souris embryonnaires coeurs
- Dissections d'embryons
- Plan pour obtenir les femmes enceintes chronométré à l'avance par accouplement 2 femelles avec un mâle (toujours dans la cage du mâle) à la fin de la journée (entre 17 et 19 h). Le lendemain matin, les femelles avec des bouchons vaginaux sont considérés comme à 0,5 jours post-coït.
- Euthanasier la femal enceinte de E17.5es par dislocation cervicale. Assurez-vous que l'animal ne répond pas en appuyant fermement sur la patte de la souris (réflexe orteil-pincement). Mouiller l'abdomen avec 70% d'éthanol pour stériliser et de prévenir la propagation de la fourrure de la souris.
- Faire une incision dans la peau au milieu de l'abdomen à l'aide de ciseaux et tirez la peau à part avec les doigts.
- Ouvrir la cavité abdominale en tirant et en faisant des incisions dans le muscle abdominal du centre vers les deux côtés de l'abdomen à l'aide de pinces et des ciseaux bruts.
REMARQUE: Veillez à ne pas endommager l'intestin grêle, ce qui est juste en dessous du muscle péritonéale. - Recueillir les cornes utérines (avec les embryons) en coupant à la fois au niveau du corps de l'utérus et des ovaires. Les tremper dans une boîte de Petri de 90 x 15 mm 2 avec 50 ml de DPBS.
- Isoler chaque embryon en coupant entre chaque caduque, suivie de la paroi musculaire de l'utérus et la vésicule ombilicale viscérale avec une pince fine et ciseaux. Tirez sur les embryons intacte. Enfin, couper le cordon ombilical.
- Couper la tête des embryons de E17.5 avec des ciseaux (décapitation) avant de commencer la dissection.
- Collection de coeurs
- Faire tremper les embryons décapités dans un 90 x 15 mm 2 boîte de Pétri contenant un lit de serviette en papier humide dans le fond plat et 50 ml de HBSS avec 1% de FCS.
- Sous un stéréomicroscope, tenir chaque embryon avec des pinces brutes de sorte que la face ventrale vers le haut.
- Ouvrez soigneusement la grille thoracique en coupant le côté droit de la poitrine avec des ciseaux afin d'éviter d'endommager le coeur.
- Exposer le coeur en maintenant la cage thoracique avec une pince brute.
- Séparer le coeur (encore assemblé avec les poumons et le thymus) en maintenant les grands vaisseaux (contenant les gros navires de l' intérieur et hors flux du coeur) et les placer dans une boîte de Pétri 2 35 x 15 mm avec 2 ml de HBSS 1% de FCS.
- Isoler le cœur des organes environnants ettissu conjonctif avec une pince fine et un scalpel.
- Laver les cœurs dans une nouvelle 35 x 15 mm boîte de Petri avec 2 ml de HBSS à 1% de FCS et de les conserver sur de la glace pendant 20 min pour permettre le cœur à pomper le sang à l'intérieur des chambres.
- Préparation de suspensions de cellules cardiaques
- Préchauffer la collagénase de 200 ug / ml dans du HBSS + / + (ci-après dénommée solution enzymatique) à 37 ° C.
NOTE: Diluer la collagénase dans HBSS + / + (avec Ca 2+ et Mg 2+) afin de maximiser l'activité enzymatique; activité de la collagénase est stable entre les lots. - Remplacer la solution de lavage absorbant le cœur (HBSS à 1% de FCS) avec 1 ml de solution enzymatique préchauffé.
- En vertu d' un stéréomicroscope, émincer les coeurs en 1 mm 3 pièces en utilisant une pince fine et un scalpel. Ajouter une autre 1 ml de solution enzymatique préchauffé et transférer le tissu haché dans un tube de 5 ml avec un couvercle.
REMARQUE: Pour une digestion optimale, placez unmaximum de 5 E17.5 coeurs par 2 ml de solution enzymatique. Si plus de cœurs sont digérées en même temps, les diviser en différents tubes de 5 ml. - Incuber les cœurs hachées pendant 15 min à 37 ° C.
REMARQUE: Couchez les tubes 5 ml (correctement fermés) dans l'incubateur pour répandre le tissu le long de la solution.- A la fin de l'incubation, homogénéiser le tissu dans la même solution enzymatique en pipetant de haut en bas d'environ 20 fois à la pipette P1000. Placer le tube de 5 ml dans la position verticale et laisser le sédiment restant de fragment de tissu (environ 3 min).
- Récupérer le surnageant (contenant les cellules digérées en suspension) dans un tube de 50 ml, ajouter 2 ml de HBSS 10% de FCS (le même volume que le volume de solution enzymatique ajoutée aux fragments de tissu), et les garder sur de la glace tout en continuant la processus de digestion.
REMARQUE: La solution HBSS 10% de FCS et la glace sont importantes pour l'action inactive enzymatique alors que le tissu restant estdigérant. - Ajouter 2 ml de solution enzymatique préchauffée dans les tubes 5 ml avec le fragments de tissu restantes et à poursuivre la digestion en répétant l'étape 3.3.4 jusqu'à ce que plus le tissu est observé.
NOTE: Environ 4 cycles de digestion suffisent pour dissocier complètement le tissu cardiaque (5 E17.5 coeurs dans 2 ml de solution enzymatique).
- Centrifuger les tubes de 50 ml avec des cellules en suspension pendant 10 minutes à 300 xg et jeter le surnageant.
- Remettre en suspension le culot de cellules, ajouter 1 ml de HBSS - / - 1% de FCS, et filtrer la suspension cellulaire si une maille de nylon de 70 um. Compter les cellules avec une chambre de Neubauer en utilisant un colorant vital bleu Trypan.
REMARQUE: les cellules avec Resuspendre HBSS - / - (sans Ca 2+ et Mg 2+) pour minimiser l' agrégation des cellules. Entre 800 000 et 1.000.000 cellules sont obtenues à partir d'un seul coeur E17.5.
- Préchauffer la collagénase de 200 ug / ml dans du HBSS + / + (ci-après dénommée solution enzymatique) à 37 ° C.
- La coloration des cellules cardiaques avec des anticorps fluorescents
REMARQUE: Tous Antibods sont titrés précédemment pour obtenir la définition optimale des populations cellulaires (le titrage peut varier avec le lot d'anticorps) .Les anticorps utilisés dans le panneau de coeur sont répertoriés dans le tableau 1.- Distribuer les cellules cardiaques en suspension à travers une plaque à 96 puits (à fond rond). les distribuer uniformément dans tous les puits nécessaires (200 ul par puits), une centrifugeuse de filage court de la plaque à 96 puits pendant 1 min à 480 xg, et jeter le surnageant.
Remarque: Tous les puits de la plaque à 96 puits (à fond rond) peut être utilisé. - Remettre en suspension le culot et incuber les cellules cardiaques pendant 20 minutes dans l'obscurité à 4 ° C avec 100 ul d'un cocktail d'anticorps ( par exemple, CD45-PE, Ter119-PE, CD31-Alexa 647, et Sca-1-PE-Cyanine5 ) dilué dans HBSS - / - 1% de FCS.
- Laver les cellules cardiaques de l'excès d'anticorps par addition de 200 ul de HBSS - / - 1% de FCS et les courts-spin centrifugation des cellules pendant 1 min à 480 x g.
- Jeter le surnageant et répéterla centrifugation de courte centrifugation (étape 3.4.3).
- Resuspendre les cellules dans 200 ul de HBSS - / - 1% de FCS et de les transférer dans un tube de 5 ml contenant déjà 200 ul de HBSS - / - 1% de FCS.
- Avant l'acquisition, ajouter 400 ul de HBSS - / - 1% de FCS avec PI 0,5 pg / mL et filtrer la suspension cellulaire si une maille de nylon de 70 um.
- Distribuer les cellules cardiaques en suspension à travers une plaque à 96 puits (à fond rond). les distribuer uniformément dans tous les puits nécessaires (200 ul par puits), une centrifugeuse de filage court de la plaque à 96 puits pendant 1 min à 480 xg, et jeter le surnageant.
4. Acquisition de Labellisées splénique, Intestinal et cellules cardiaques avec le Spectral cytomètre de flux
- Avant l'acquisition des données, calibrer automatiquement le spectre cytomètre suivant les instructions du fabricant. Effectuer le quotidien et les procédures de contrôle de qualité mensuels chaque jour de l'expérience.
- Lorsque le cytomètre est prêt, commencer l'aperçu des échantillons contenant les suspensions cellulaires marqués avec tous les anticorps.
REMARQUE: Ne pas acquérir. - Assurez-vous que tous les lasers sont sur au besoin. Réglez le gain de FSC de telle sorte que toutes les cellules sont visibles dans la respectiveparcelles. Porte de la population de cellules et appliquer cette grille aux deux parcelles spectrales correspondant à 488 nm et les 638 / lasers 405 nm.
Remarque: lorsque fluorochromes sont excités par le laser 638 nm ( à savoir, lorsque le laser 638 nm est allumé), il y a un masque qui protège lumière 617-662 nm pour empêcher le laser 638 nm de briller dans le PMT. Ceci induit la perte d'une partie du spectre et provoque donc une séparation inférieure de colorants à proximité émettant dans ces longueurs d'onde. Cependant, la totalité du signal peut être recueillie en coupant le laser 638 nm si elle n'a pas été requis pour l'acquisition. - Ajuster la tension photomultiplicateur (PMT) 32 de canal (%) de sorte que tous les fluorochromes sont dans la gamme de l'intensité affichée dans l'axe y (1-10 6) dans les deux parcelles spectrales différentes figurent 488 nm et 405/638 excitations nm.
NOTE: La formation est nécessaire pour reconnaître les spectres de tous les fluorochromes utilisés. - Commencer à acquérir les échantillons. Cliquer sur "; Aperçu » pour visualiser les cellules sur l'écran, puis cliquez sur « Acquérir » pour enregistrer l'échantillon Économisez jusqu'à 2 x 10 6 événements de chaque échantillon..
- Après l'acquisition des échantillons colorés, acquérir l'échantillon coloré avec le colorant vital, puis les perles de compensation individuellement colorées avec tous les anticorps utilisés. Cliquez sur « Aperçu » pour visualiser les cellules sur l'écran, puis sur « Acquire » pour enregistrer les échantillons.
REMARQUE: Gardez la même tension de VPM pour tous les échantillons et les contrôles ( par exemple, des perles et des échantillons non colorés); 5.000 événements sont largement suffisants. - Enfin, l'acquisition des données des suspensions de cellules non colorées. Cliquez sur « Aperçu » pour visualiser les cellules sur l'écran, puis sur « Acquire » pour enregistrer les échantillons.
NOTE: L'acquisition des échantillons non colorés à la fin de l'expérience minimise le report de cellules fluorescentes. - Nettoyez le cytomètre en suivant les instructions du fabricant de und fermer l'expérience dans le dossier d'acquisition.
REMARQUE: seulement après la fermeture de l'expérience sera enregistrée et il sera disponible pour l'analyse.
5. L'analyse des données avec le logiciel Spectral FCM
- Dans la fenêtre de l'onglet « Analyse » « Palette de couleurs », enregistrer tous les paramètres présents dans le panneau en ajoutant chaque fluorochrome utilisé et le marqueur correspondant (sélectionnez dans la liste disponible ou ajouter un nouveau paramètre). En outre, inclure les paramètres de l'auto-fluorescence et de viabilité; tous les paramètres sélectionnés apparaîtront dans la fenêtre « unmixing ».
- Sélectionnez le premier échantillon coloré unique (fait avec des perles de compensation) dans la fenêtre « Control » sous la « Liste des tubes » de cette expérience sur l'onglet « Analyse ». Dans la feuille de calcul, cliquez sur le « outil de conception de polygone » et concevoir une porte sur la population de perles dans la parcelle FSC / SSC. Double-cliquez sur le dessus de la porte d'ouvrir un tracé spectral ou un pointpour visualiser les perles gated dans une parcelle fille.
- Concevoir une grille pour la grille positive et une négative pour les billes, soit sur le spectre ou sur le tracé de points. Vérifier l'ensemble de spectres correspondant aux deux ensembles laser pour chaque fraction positive et négative et éliminer les valeurs aberrantes par déclenchement successivement et en cliquant sur la porte pour vérifier la population ayant une fille. Franchissez les portes négatives et positives dans la fenêtre « Déconvolution ».
- Répétez l'étape 5.2 pour chaque échantillon unique tachés.
REMARQUE: Sachez que la stratégie de gating positive et négative correspond à l'échantillon qui est en cours d'analyse, bien que le programme permet d'être placé dans un échantillon. Au lieu de la détermination d'une fraction négative pour chaque échantillon unique taché, utiliser un échantillon de talon sans tache pour définir un négatif universel.
- Sélectionnez l'échantillon de cellules non colorées dans la « Liste des tubes » et les portes de conception pour autofluorescents et pour les cellules non-autofluorescents. <li> Lorsque toutes les portes négatives et positives pour tous les paramètres, y compris autofluorescence et la viabilité, sont sélectionnés dans la fenêtre « Déconvolution », cliquez sur « Calculer ». Appliquer le unmixing aux échantillons à analyser.
- Analyser les données en concevant des portes et la création de parcelles à deux paramètres.
- Tout d'abord, la conception d'une porte pour SSC par rapport FSC et éliminer les cellules mortes en excluant toutes les cellules marquées avec le marqueur de viabilité (PI par rapport à CD45). Sur le reste des cellules, des portes de conception pour toutes les populations d'intérêt suivant la stratégie décrite pour chaque suspension cellulaire (figures 1-3).
REMARQUE: Si nécessaire, réglez la correction dans le « réglage du spectre de référence. » Ceci est un outil qui peut être utilisé après unmixing pour réajuster la médiane des populations positives pour chaque fluorochrome si l'algorithme ne pouvait pas le faire parfaitement.
- Tout d'abord, la conception d'une porte pour SSC par rapport FSC et éliminer les cellules mortes en excluant toutes les cellules marquées avec le marqueur de viabilité (PI par rapport à CD45). Sur le reste des cellules, des portes de conception pour toutes les populations d'intérêt suivant la stratégie décrite pour chaque suspension cellulaire (figures 1-3).
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Representative Results
21-paramètre de panneau spectrale de FCM pour analyser les splénocytes
La figure 1 montre les résultats obtenus avec le panel d'anticorps 19 fluorescent appliqué à des cellules spléniques comprenant des anticorps reconnaissant différents sous - ensembles de T, B, NK, dendritique, et les cellules myéloïdes, alors que CD45 étiquettes toutes les cellules nucléées hématopoïétiques. Le panneau comprend également un colorant de viabilité des paramètres (PI), ainsi que la taille (FSC) et de la granularité (SSC). La figure 1A montre les spectres de fluorochrome de référence. Après l'élimination des cellules mortes de la CD45 + grille (figure 1B), l'analyse montre que les cellules T CD3 + exprimer la chaîne TcRβ et ont la distribution des CD4 / CD8 attendue et la proportion de cellules CD25 + dans les cellules T CD4. lymphocytes T CD8 montrent une distribution normale des cellules CD44- et Ly49D exprimant. Cellules CD19 + B co-expriment une B220d MHCII, ainsi que IgM et IgD, typique des cellules B spléniques matures. Un sous - ensemble de cellules NK1.1 + NK représente un petit sous - ensemble des lymphocytes spléniques qui co-expriment Ly49D. Les cellules restantes comprennent un petit sous - ensemble de cellules dendritiques CD11c + avec des niveaux élevés de CMH II, qui sont également une partie de CD11b +. F4 / 80 + cellules caractéristiques du tissu-résident macrophages co-expriment CD11b et les plus élevés de CD44 présents dans la rate. Les cellules restantes (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) peuvent être divisées par l'expression de CD11b et Gr1, où la petite sous - ensemble de cellules doubles-positives expriment également des niveaux élevés de CD44, ce qui correspond vraisemblablement à des progéniteurs connus pour être présents dans les basses fréquences dans la rate. Une grande fraction a été négatif pour les trois marqueurs. La figure 2 montre la même analyse avant le réglage de la compensation.
Figure 1: A 19-couleur Panneau d' anticorps pour l'analyse des cellules murines spléniques. (A) de souris splénocytes ont été colorés avec la précédente combinaison d'anticorps, dans laquelle évoluent CD45-655 a été ajouté. Les spectres de référence de tous les fluorochromes sont affichés. CD45 marqué par un fluorophore est marqué par une flèche rouge. Les fluorochromes sont répertoriés dans le tableau 1. (B) Les tracés de contour montrent la capacité discriminative de cette analyse multi-paramétrique pour séparer les différentes populations de B, T, NK, dendritiques ou des cellules myéloïdes. L'analyse a été effectuée dans le logiciel classique FCM après unmixing déconvolution.
Figure 2: A 19-couleur Panneau d' anticorps pour l'analyse des cellules murines spléniques. La même analyse que la figure 1 a été effectué avant le adjusVICE de la compensation avec le dispositif de réglage de spectres de référence.
Intestin grêle lymphocytes intra-épithéliale
Plusieurs populations de cellules T se trouvent dans l'intestin dans la couche de cellules épithéliales 5, 6. isolement classique de ces sous-ensembles comprend un gradient de densité qui sépare les lymphocytes à partir de cellules épithéliales. Cependant, cette préparation est délicate, beaucoup de temps et les résultats dans la perte cellulaire. Pour améliorer la quantification et pour faciliter la procédure expérimentale, le potentiel de la FCM spectrale pour discriminer les populations de lymphocytes intestinaux dans une grande fraction des cellules épithéliales a été testée. Après la rupture mécanique du tissu épithélial, les suspensions cellulaires ont été colorées avec des anticorps qui étiquettent des sous-ensembles de αβ et les lymphocytes T yô on trouve habituellement dans l'épithélium intestinal. leles cellules ont été analysées en deux cytomètres classiques et FCM spectrale.
La figure 3 montre les résultats après avoir suivi une stratégie similaire de déclenchement, avec élimination des cellules mortes de déclenchement sur les cellules PI-négatives. La présence de cellules auto-fluorescent est évidente dans tous les cytomètres classiques et cytométrie spectrale lorsque le gestionnaire d'auto-fluorescence est inactivée (panneaux supérieurs, des flèches rouges), entraînant une mauvaise discrimination des cellules vivantes. Dans toutes les parcelles, les cellules au sein de la FSC-A / SSC-A porte à lymphocytes sont représentés en bleu et les cellules à se disperse plus grandes (de grille des cellules épithéliales) sont indiqués en rouge. Les deux instruments conventionnels ont été incapables de résoudre le CD3 + sous - ensemble des lymphocytes T (en bleu) (flèche turquoise) des cellules restantes. Par conséquent, TcRβ - cellules (flèche verte) contaminée CD3 + TcRγδ - population, un sous - ensemble biologiquement improbable jamais détectée après la separatisur des lymphocytes provenant de cellules epitheliales. En revanche, dans la FCM spectrale après la gestion auto-fluorescence, l'analyse des différents sous - ensembles de cellules T n'a pas été altérée par la présence de cellules épithéliales, les populations étaient bien séparées, et il n'y avait pas de cellules TcR négatives dans le CD3 + porte.
Figure 3: La présence de cellules auto-fluorescentes ne porte pas la détection de Lymphocytes intra-épithéliales dans Spectral FCM. Les petites cellules intestinales, y compris les cellules epitheliales et des lymphocytes, ont été colorées avec des anticorps reconnaissant TcRδ, PI, TcRβ Cy7-APC CD3 (panneaux B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (panneaux C), et FITC CD8 (panneaux D). PI a été ajouté dans le tampon FACS avant analyse. L'acquisition des données a été réalisée de façon séquentielle dans les trois instruments après le contrôle de qualité. Doublets étaient Eliminated en FSC-H / FSC-W. L'analyse a été effectuée dans le logiciel classique de la FCM. Les parcelles montrent les différentes étapes de la stratégie de gating. Les cellules au sein de la FSC-A / SSC-A porte à lymphocytes sont marqués en bleu, tandis que les cellules dans la grille de cellules épithéliales intestinales sont marquées en rouge. Les flèches indiquent les différentes distorsions de la population et l'auto-fluorescence. Parcelles en C montrent l'analyse des données obtenues dans la FCM spectrale sans gestion de autofluorescence dans le unmixing, alors que D montre les mêmes données après unmixing avec la gestion des autofluorescence.
coeur Embryonic
Conventionnel FCM a montré une population importante de cellules auto-fluorescent (flèche noire) qui a été exclu de l'analyse parce qu'il fluoresce dans le CD45 et Ter119 canal de décharge (PE), le marquage des cellules hématopoïétiques. En revanche, cette population auto-fluorescent était pas présent en tant que tel dans la FCM spectrale et est comprise dans la CD45
Figure 4: les cellules auto-fluorescent dans des suspensions de cellules E17.5 cardiaques sont bien compris dans la fraction cellulaire négative dans Spectral FCM. (A) Des suspensions de cellules foetales à partir de cœurs ont été colorées avec des anticorps anti-CD45 et Ter119-PE, Sca-1-PECy5, et des anticorps CD31-APC et séquentiellement acquises au cours des trois instruments. Les flèches noires montrent des cellules auto-fluorescentes dans les deux convecytomètres Ntional, bien que ces cellules ne sont pas détectées comme auto-fluorescent en cytométrie spectrale et peuvent ainsi être analysés pour la coloration fluorescente spécifique. (B) des cellules auto-fluorescent ( au sein de la grille elliptique en vert), mais pas CD31 + cellules (grille rectangulaire en bleu, témoin négatif), a montré l'expression de la troponine cardiaque (TNNT2) de chaîne 2 de lumière 7 et auriculaire (MYL7) 8 relevés de notes. au - unités arbitraires par rapport à la transcription de la maison de maintien de la GAPDH. Les données présentées valeur moyenne ± SEM.
| Laser d'excitation | fluorochrome | Spécificité | Cloner | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53 à 6,7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | L'iodure de propidium | Viabilité | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | Evolve 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | purifiée | CD16 / CD32 | 2.4G2 | bloc-récepteur Fc |
| Liste des anticorps utilisés dans cardisuspension de cellules ac | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tableau 1: Liste des anticorps utilisés dans le panneau 19 couleurs et en suspension cellulaire cardiaque.
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Discussion
FCM classique est basée sur la détection des photons émis après l'excitation des sondes fluorescentes. L'émission de fluorescence d'un fluorochrome détecté dans un détecteur conçu pour mesurer le signal d'un autre fluorochrome induit chevauchement physique. Ce débordement entre les spectres d'émission doit être corrigée par des compensations.
FCM spectrale et le traitement de données par l'algorithme de déconvolution de démélange permet la combinaison de fluorochromes avec des pics d'émission à proximité sans compensation supplémentaire, à condition qu'ils aient des formes différentes spectrales. L'algorithme utilisé pour l'analyse traite automatique fluorescence comme un paramètre indépendant, en soustrayant la fluorescence non spécifique à partir de suspensions cellulaires de tissus solides.
Un panel de 19 fluorochromes a été assemblé pour analyser les cellules immunitaires en utilisant seulement deux lasers (488 nm et 405 nm). En effet, lorsque le laser 638 nm était, une section du PMT 32-canal correspondantà la longueur d'onde de ce laser d'excitation n'a pas été disponible. Pour obtenir la capacité de détection maximale du VPM, le laser rouge a été éteint. Souris cellules spléniques ont été analysés, ce qui permet la détection de plus de 12 différentes populations de cellules, dont certains comprenaient 1% ou moins des cellules hématopoïétiques.
Pour tester la capacité de la FCM spectrale pour gérer la fluorescence automatique, deux situations différentes qui peuvent nuire à l'analyse ont été testées: celle où les lymphocytes ont été contaminés par des cellules épithéliales, et celui où les cellules cardiaques auto-fluorescence ont été analysées. Contrairement à la FCM conventionnelle, cytométrie spectrale permet la discrimination de tous les sous-ensembles de lymphocytes, même quand ils représentent des sous-ensembles mineurs.
La controverse autour de la capacité de régénération des cardiomyocytes adultes 9, 10, 11 est en partie due à l'absence d'une stratégie à la discriminationet isoler des sous-ensembles incriminerait distincts de cellules viables dans le cœur. peut permettre la détection de sous-ensembles rares en raison d'un grand nombre de cellules qui peuvent être analysées Une analyse multi-paramétrique définissant des combinaisons uniques de marqueurs pour distinguer les différents sous-ensembles cardiaques. coeurs fœtales (E17.5) ont été analysés, et une grande fraction de cellules auto-fluorescent, qui auraient échappé à la détection dans FCM classique, a été intégré dans le compartiment de la cellule cardiaque viable non-hématopoïétique chez FCM spectrale.
Un problème récurrent de cette méthode est l'exigence de fluorescence de bonne qualité des anticorps marqués. Ceci est particulièrement critique pour l'utilisation de colorants en tandem, où un composant du tandem est dominant. Par exemple, BV786 et Cy7-PE peuvent être difficiles à distinguer des BV421 et PE, respectivement.
FCM basée sur la spectrométrie fournit la puissance d'analyse supérieure à celle obtenue avec la FCM conventionnelle, sans la nécessité d'une indemnisation matrices. Ce manuscrit fournit la preuve qu'il existe une autre approche qui démontre une capacité d'analyse élevé, l'absence de matrices de compensation complexes, la discrimination intacte des sous-ensembles de cellules en raison de l'auto-fluorescence et aucun engagement financier supplémentaires encore nécessaires à la spectrométrie de masse FCM. Spectral FCM semble donc être une méthode de choix pour l'analyse des cellules obtenues à partir d'une grande variété de tissus solides habituellement ne se prêtent pas à la FCM classique et peut être utilisé dans la tumeur, le développement et biologie des cellules souches.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Acknowledgments
Nous reconnaissons les contributions techniques et théoriques en cytométrie spectrale de K. Futamura, qui a également révisé critique du manuscrit. Nous sommes également redevables à C. Ait-Mansour, P.-H. Commère, A. Bandeira et P. Pereira pour la lecture critique du manuscrit et des conseils techniques sans fin et de soutien. Nous remercions également P. Pereira pour le don des anticorps anti-Vγ7 APC et Vδ4-Biotin marqués. Nous informons l'Centre d'Institut Pasteur de Enseignements pour l'accueil et le soutien logistique de tournage. Ce travail a été soutenu par l'Institut Pasteur, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM); la Fondation nationale des sciences suisse et Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); et de l'Université Paris Diderot, le projet Agence Nationale de la Recherche (ANR) Twothyme, l'ANR et le Programme REVIVE (Investissement pour l'avenir) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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