Summary
Dieser Artikel beschreibt, spektrale Zytometrie, einen neuen Ansatz in der Durchflusszytometrie, die die Formen von Emissionsspektren verwendet Fluorochromen zu unterscheiden. Ein Algorithmus ersetzt Kompensationen und kann Auto-Fluoreszenz als unabhängigen Parameter behandeln. Dieser neue Ansatz ermöglicht die korrekte Analyse von soliden Organen isolierten Zellen.
Abstract
Die Durchflusszytometrie wurde in den letzten 40 Jahre zu definieren und den Phänotyp der lymphatischen und anderen hämatopoetischen Zellen zu analysieren. Zunächst beschränkt sich auf die Analyse einiger Fluorochrome, derzeit gibt es Dutzende von unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen und bis zu 14 bis 18 verschiedene Farbstoffe können zu einer Zeit kombiniert werden. Beeinträchtigen jedoch mehrere Einschränkungen noch die analytischen Fähigkeiten. Aufgrund der Vielzahl von Fluoreszenzsonden, hat die Datenanalyse immer komplexer geworden aufgrund der Notwendigkeit von großen, multiparametrisches Kompensations Matrices. Außerdem mutierten Maus-Modelle fluoreszierende Proteine tragen zu detektieren und zu spezifischen Zelltypen in verschiedenen Geweben Spuren verfügbar worden, so dass die Analyse (durch Durchflusszytometrie) von Auto-Fluoreszenz-Zellsuspensionen von festen Organen erhielten erforderlich ist. Durchflusszytometrie Spektral-, welche die Formen von Emissionsspektren entlang einer Vielzahl von kontinuierlichen Wellenlängen unterscheidet, werden einige dieser Probleme. Die Daten werden analysiert, with einen Algorithmus, die Kompensations Matrizen und behandelt Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter ersetzt. Somit sollte spektraler Durchflusszytometrie Fluorochrome fähig sein mit ähnlichen Emissionspeaks des Unterscheidens und kann eine Multiparameteranalyse ohne Kompensations Anforderungen.
Dieses Protokoll beschreibt die spektrale Analyse der Durchflusszytometrie, so dass für eine 21-Parameter (19 Fluoreszenzsonden) Charakterisierung und die Verwaltung eines Autofluoreszenzsignals, eine hohe Auflösung in kleinere Population Detektion bereitstellt. Die hier vorgestellten Ergebnisse zeigen, dass die spektralen Durchflusszytometrie Vorteile bei der Analyse von Zellpopulationen aus Geweben schwierig präsentiert in herkömmlicher Durchflusszytometrie, wie Herz und Darm zu charakterisieren. Spectral Durchflusszytometrie so zeigt die Multiparameteranalysekapazität von hochleistungsfähigen Zytometrie herkömmlicher Strömung ohne das Erfordernis für Ausgleichs- und ermöglicht Autofluoreszenz-Management.
Introduction
In den letzten Jahrzehnten, Durchflusszytometrie (FCM) wurde Studien ein verbreitetes Analysemethode essentiell für Zell Phänotypisierung. Es wurde eine wesentliche Erhöhung der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe waren, insbesondere durch den violetten Laser angeregt Fluorochrome (405 nm) (zB Brilliant Violet und neue Q-Punkt - Farbstoffe). Allerdings erhöht das Wachstum der verfügbaren Fluoreszenzfarbstoffe das Risiko von überlappenden Emissionen und erfordert arbeitsintensive Kompensations Matrizen. FCM wurde weit verbreitet Zellsuspensionen aus festem Gewebe zu analysieren, aber die Anwesenheit von auto-fluoreszierenden Zellen begrenzt die Diskriminierung von spezifisch markierten Populationen.
Die Grundprinzipien der spektralen FCM werden ausführlich in Futamura et al. 1, 2. Kurz gesagt, hier verwendet, um die spektrale FCM (die Tabelle von Materialien sehen) ist mit 405, 488, und 638 nm-Laser ausgestattet. Die spektrale FCM erfasst alle emittierten fluorescence als Spektren in einem 32-Kanal-Linear-Array PMT (32CH PMT) für 500 nm bis 800 nm und 2 unabhängigen PMTs für 420 nm bis 440 nm und 450 nm bis 469 nm bzw. die die herkömmlichen Bandpassfilter ersetzt werden. Die 488 und die 405/638-nm-Laserspots sind räumlich voneinander getrennt, während die 405 nm und 638 nm Laserspots co-linear ist. Für jeden einzelnen Partikel, die spektralen FCM Maßnahmen bis zu 66 Kanäle von Fluoreszenzdaten angeregt durch die 405 nm und 488 nm Laser. Wenn Zellen durch den 638-nm-Laser angeregt werden, misst die spektrale FCM 58 Kanäle von Fluoreszenzdaten, da eine Maske, um den 638-nm-Laser von glänzenden in die PMT zu verhindern, eingeführt wird. Spectral FCM analysiert die erfassten Vollspektrumdaten mit einem Algorithmus auf der Grundlage der gewichteten Methode der kleinsten Quadrate (WLSM), die die Trennung von überlappenden Spektren Fluoreszenz ermöglicht. Spektren abgeleitet von single-gefärbten und ungefärbten Proben werden als Basisreferenzspektren erkannt. Multi-gefärbten Proben werden eine mathematisch ausgestattetUngemischt, und das Spektrum einer Probe mit gemischten fluoreszierenden Markierungen wird in eine Sammlung ihrer konstituierenden Spektren zerlegt. Die Entmischung in der Spektraltechnologie 3 , 4 ersetzt die Kompensation, die das Signal von allen Detektoren entfernt, mit Ausnahme derjenigen, die einen gegebenen Farbstoff mißt.
In dieser Studie kombinierten und testeten wir 19 Fluorochrome in einer einzigen, 21-Parameter-Analyse, die die wichtigsten hämatopoetischen Teilmengen in der Maus Milz charakterisiert charakterisiert. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass die spektrale Zytometrie das Auto-Fluoreszenz-Signal steuern kann, wodurch die Charakterisierung der intestinalen intraepithelialen Lymphozyten und des embryonalen Herzens verbessert wird. In diesen Geweben erlaubte das Auto-Fluoreszenz-Management die Zuordnung von spezifischer Fluoreszenz zu Zellen, die aus der Analyse in herkömmlichem FCM ausgeschlossen würden.
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Protocol
Alle Experimente wurden nach der Pasteur-Institut Ethic Charta und den EU-Richtlinien durchgeführt und wurden von dem Französisch Landwirtschaftsministerium genehmigt.
1. Zellsuspension Vorbereitung von erwachsenen Maus Orgeln
- Isolierung von Splenozyten
- Euthanize erwachsene Mäuse durch Genickbruch. Einen Einschnitt in den Bauch Mittellinie und öffnen Sie die Haut mit einer Schere. Ernten Sie die Milz mit einer Pinzette.
- Crush die Milz zwischen 2 Glasobjektträgern, die Zellen zu dissoziieren, und verdünnte sie in 5 ml Hanks Balanced Salzlösung (HBSS), enthaltend 1% fötales Kälberserum (FCS).
- Zentrifuge für 10 min bei 120 xg und 4 ° C. Überstand verwerfen.
- Das Pellet in 5 ml HBSS 1% FCS. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer einen Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
HINWEIS: 80 Millionen Zellen sollten von einem Erwachsenen Milz gewonnen werden.
- isolatiauf den Zellen aus dem Dünndarm
- Euthanize erwachsene Mäuse durch Genickbruch. Mit einer Schere, macht einen Einschnitt in der Haut am Bauch Mittellinie. Fassen des Dünndarms mit einer Pinzette in einer Hand und mit einer Schere es an beiden Enden schneiden: erste, direkt nach dem Magen und dann am Ende des Dünndarms, kurz vor dem Dickdarm. Spülen den Dünndarm mit 1x Dulbecco phosphatgepufferte Salzlösung (DPBS) unter Verwendung einer 2 ml-Spritze mit einer Nadel.
- Setzen Sie den Dünndarm auf einem Papiertuch und entfernen Sie vorsichtig die Peyer-Plaques mit einer scharfen Schere.
- Mit einer Schere in den Darm auf seiner langen Seite zu öffnen, indem im Innern des Darms einen Zweig der Schere einsetzen. Schneiden Sie das geöffnet Darm in 1 cm-Stücke unter Verwendung einer scharfen Schere.
- Inkubieren für 30 min bei 37 ° C unter ständigem Rühren in 30 ml HBSS mit 10% FCS.
- Platzieren der Zellsuspension mit den verbleibenden nicht-dissoziierten Fragmente in einem 50 mlKunststoffrohr und Vortex für 5 min mit hohen Geschwindigkeit. HINWEIS: Es gibt keine weitere Dissoziation des Gewebes ist.
- Inkubieren für 10 min auf Eis, um den großen, nicht-dissoziierten Fragmente zu erlauben, zu pelletieren.
- Sammeln Sie den Überstand und engt sie durch Zentrifugation für 7 min bei 120 x g.
- Überstand verwerfen und das Pellet in 10 ml HBSS mit 1% FCS. Zählen von Zellen mit einer Neubauer Kammer eines Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
HINWEIS: ~ 60 Millionen intra-Epithelzellen (IELs) sollten von einem Erwachsenen Dünndarm erhalten werden.
- Panel - Design - Strategie
- Bereiten Sie die Platten mit Antikörpern, die direkt mit Fluorochromen.
HINWEIS: Alle Antikörper werden vorher die optimale Definition der Zellpopulationen zu erhalten, titriert (die Titration mit dem Antikörper Charge variieren kann). Die Antikörper in der Platte 19 verwendete Farbe Splenozyten zu färben , sind in Tabelle 1 aufgeführt. - Konstruieren Sie Multi-color Paneele für Zytometrie. Da dies eine schwierige Aufgabe sein kann, verwenden Sie die folgenden Richtlinien, um die Platten zu optimieren:
- Überprüfen Sie die spektrale Konfiguration und die Fluoreszenzfarbstoffe, die auf dem Instrument verwendet werden können.
- Verwenden Sie die Helligkeit Index / Anfärbung Index Informationen vom Hersteller zur Verfügung gestellt.
HINWEIS: Der Helligkeitsindex / Staining Index ist der relative Indikator der Fluoreszenzintensität gegenüber dem Hintergrund für jedes Fluorochrom. - Wählen Sie die Antikörper nach den folgenden Regeln:
- Wählen Sie die hellsten Fluorochrome für Proteine, die schwach ausgeprägt und die dunkelste Fluorochrome für mehr stark exprimierten Proteine werden.
HINWEIS: Zum Beispiel, CD45, CD4 und CD8 stark exprimiert werden und können mit dim Fluorochrome verwendet werden. - Starten Sie das Panel entwerfen, indem zuerst die Antikörper mit den wenigsten Fluoreszenzfarbstoff Möglichkeiten wählen.
- Wenn möglich, wählen Fluoreszenzfarbstoffe mit der kleinsten Überlappung der Emissionsspektren foder Markierungen auf den gleichen Zelltypen exprimiert.
HINWEIS: Tandems (zB PE-Cy5, PE-Cy7 und PerCP-Cy5.5) sollten mit Vorsicht verwendet werden, da sie anfälliger für den Abbau durch Lichteinwirkung sind.
- Wählen Sie die hellsten Fluorochrome für Proteine, die schwach ausgeprägt und die dunkelste Fluorochrome für mehr stark exprimierten Proteine werden.
- Bereiten Sie die Platten mit Antikörpern, die direkt mit Fluorochromen.
- Anfärben von Zellen für Zytometrie Analyse
- Bereiten ein 5 - ml - Röhrchen mit 1 x 10 6 Splenozyten und ein 5 - ml - Röhrchen mit 1 x 10 6 Darmzellen und halten sie ungefärbt für die Verwendung als negative Kontrollen.
- Bereiten und beschriften ein 5 - ml - Röhrchen pro Probe und pro Platte gemäß Tabelle 1. Bereiten Sie die Mischung von Antikörpern, gemäß Tabelle 1, in HBSS 1% FCS.
- Transfer 1 x 10 6 Zellen - entweder Splenozyten oder Darmzellen - in jede 5 ml - Röhrchen. 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C und 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 50 ul Antikörper-Mix.
- Beschriften Sie die splenocytes in 2 Stufen. Verwenden Sie zuerst 50 ul der Mischung, die mit PE-markierten Antikörper enthält, Cyanine 5, PerCP-Cyanine 5,5 und PerCP (mit Fc-Rezeptor-blockierend) in einem 5 ml-Röhrchen. Nach 20 min Inkubation im Dunkeln bei 4 ° C, werden 50 & mgr; l der Mischung alle anderen Antikörper zu einem 5-ml-Röhrchen enthält.
HINWEIS: Diese Strategie begrenzt sterische Hinderung. - Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
- 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge 5 min bei 4 ° C und 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 200 ul HBSS mit 1% FCS 0,5 ug / ml Propidiumiodid (PI).
2. Herstellung von Einzelfärbung für jedes Fluorochrom auf Gewerbe Compensation Bead Microspheres (zB Ultracomp eBeads), im folgenden als Perlen Geworben
- Vorbereitung und so viele 5 ml-Röhrchen, wie die Anzahl von Antikörpern beschriften, die in den Platten verwendet werden. 1 Tropfen von Kügelchen in jedem Röhrchen und fügen 1 & #181; L Antikörper pro Röhrchen.
HINWEIS: Die Perlen verwendet hier (siehe die Tabelle der Materialien) enthalten, gefärbt (positiv) und ungefärbte (negative) Perlen. Antikörper werden im Überschuss auf dem Kügelchen stellen ein helles Signal zu gewährleisten und damit eine klare spektrale Signatur für jeden Farbstoff. Dies wird durch die Software in der Lage sein erforderlich, um eine genaue Entmischung zu machen. - Inkubieren für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C.
- 2 mL HBSS 1% FCS und Zentrifuge für 5 min bei 120 x g. Überstand verwerfen und das Pellet in 100 & mgr; l HBSS 1% FCS.
3. Zellsuspension Herstellung von embryonalen Mäuseherzen
- Sezieren von Embryonen
- Plane zu erhalten timed-trächtige Weibchen im Voraus durch Paarung 2 Weibchen mit einem Männchen (immer in dem Käfig der männlichen) am Ende des Tages (zwischen 17 und 19 h). Am nächsten Morgen, Weibchen mit Vaginalpfropf wird als bei 0,5 Tagen nach coitum sein.
- Euthanize die E17.5 schwanger females durch Genickbruch. Stellen Sie sicher, dass das Tier durch festes Drücken der Mauspfote (toe-Pinch-Reflex) nicht reagiert. Befeuchten Sie den Bauch mit 70% Ethanol zu sterilisieren und die Ausbreitung der Maus Fell zu verhindern.
- Einen Einschnitt in der Haut in der Mitte des Bauches mit einer Schere und ziehen die Haut auseinander mit den Fingern.
- Öffnen der Bauchhöhle durch Ziehen und Einschnitte in den Bauchmuskel von der Mitte zu den beiden Seiten des Bauches unter Verwendung grober Pinzette und Schere.
HINWEIS: Achten Sie darauf, nicht in den Dünndarm zu beschädigen, die unmittelbar unterhalb der Bauchmuskel ist. - Sammelt die Uterushörner (mit den Embryonen), indem sowohl auf der Ebene des Gebärmutterkörpers und der Ovarien zu schneiden. Genießen sie in einem 90 x 15 mm 2 Petrischale mit 50 ml DPBS.
- Isolieren von jedem Embryo zwischen jedem Decidua Schneiden, gefolgt von der Gebärmutter muskulären Wand und dem viszeralen Dottersack mit einer feinen Pinzette und Schere. Ziehen Sie die Embryonen intHandlung. Schließlich schnitt die Nabelschnur.
- Schneiden Sie die E17.5 Embryonen Köpfe mit einer Schere (Enthauptung), bevor die Dissektion zu starten.
- Sammlung von Herzen
- Einweichen dekapitiert Embryonen in einem 90 x 15 mm Petrischale 2 ein nasses Papiertuch Bettwäsche in den Schalenboden und 50 ml HBSS mit 1% FCS enthält.
- Unter einem Stereomikroskop, mit jedem Embryo Brutto Zange halten, so dass die ventrale Seite nach oben weist.
- Öffnen Sie vorsichtig die Brust Gitter durch die rechte Seite der Brust mit einer Schere, um Schneiden Schädigung des Herzens zu verhindern.
- Setzen Sie das Herz durch den Brustkorb mit grober Pinzette.
- Ziehen Sie das Herz auseinander (noch zusammengebaut mit Lungen und Thymus) , indem die großen Gefäße halten (die großen Gefäße enthalten , und in- Ausströmen des Herzens) und sie in ein 35 x 15 mm 2 Petrischalen mit 2 ml HBSS 1% mit FCS.
- Isolieren Sie die Herzen von den umliegenden Organen undBindegewebe mit einem feinen Pinzette und Skalpell.
- Waschen Sie die Herzen in ein neuen 35 x 15 mm Petrischalen mit 2 ml HBSS 1% FCS und halten sie auf Eis für 20 min des Herz zu ermöglichen, in den Kammern, das Blut zu pumpen.
- Herstellung von Herzzellsuspensionen
- Pre-warm die 200 ug / ml Kollagenase in HBSS + / + (im folgenden als Enzymlösung bezeichnet) auf 37 ° C.
HINWEIS: Verdünne die Kollagenase in HBSS + / + (mit Ca 2+ und Mg 2+ -Kationen) , um die Enzymaktivität zu maximieren; Kollagenase-Aktivität ist stabil zwischen den Chargen. - Ersetzen der Waschlösung, die Herzen (HBSS 1% FCS) mit 1 ml vorgewärmtes enzymatischer Lösung Einweichen.
- Unter einem Stereomikroskop, Hackfleisch , die Herzen in 1-mm 3 Stücke unter Verwendung einer feinen Pinzette und ein Skalpell. Fügen Sie ein weiteren 1 ml vorgewärmter Enzymlösung und überträgt das zerkleinerte Gewebe in ein 5-ml-Röhrchen mit einem Deckel.
HINWEIS: Für eine optimale Verdauung, legen Sie eineMaximal 5 E17,5 Herzen pro 2 ml enzymatische Lösung. Wenn mehr Herzen gleichzeitig verdaut werden, teilen sie sie in verschiedene 5-ml-Röhrchen auf. - Inkubieren Sie die gehackten Herzen für 15 min bei 37 ° C.
HINWEIS: Legen Sie die 5-ml-Röhrchen (richtig geschlossen) in den Inkubator, um das Gewebe entlang der Lösung zu verbreiten.- Am Ende der Inkubation homogenisieren Sie das Gewebe in der gleichen enzymatischen Lösung durch Pipettieren auf und ab etwa 20 Mal mit der P1000-Pipette. Setzen Sie das 5-ml-Röhrchen in die senkrechte Position und lassen Sie das restliche Gewebe-Fragment Sediment (ca. 3 min).
- Sammeln Sie den Überstand (enthaltend die verdauten Zellen in Suspension) in einem 50-ml-Röhrchen, fügen Sie 2 ml HBSS 10% FCS hinzu (das gleiche Volumen wie das Volumen der enzymatischen Lösung, die den Gewebefragmenten hinzugefügt wurde), und halten Sie sie auf Eis, während Sie fortfahren Verdauungsprozess
HINWEIS: Die HBSS 10% FCS-Lösung und das Eis sind wichtig, um die Enzym-Wirkung inaktiv zu halten, während das übrige Gewebe istAufschluß. - 2 mL vorgewärmtes enzymatische Lösung für die 5-ml-Röhrchen mit den verbliebenen Gewebefragmenten und weiterhin die Verdauung durch Wiederholen von Schritt 3.3.4 bis kein Gewebe mehr beobachtet wird.
HINWEIS: Um 4 Zyklen der Verdauung sind genug, um vollständig das Herzgewebe (5 E17.5 Herzen in 2 ml Enzymlösung) zu distanzieren.
- Zentrifugieren die 50-ml-Röhrchen mit Zellen in Suspension für 10 min bei 300 xg und den Überstand verwerfen.
- Resuspendieren des Zellpellets, 1 ml HBSS - / - 1% FCS, und Filtern der Zellsuspension obwohl ein Gitter 70 um Nylon. Zählen Sie die Zellen mit einer Neubauer Kammer einen Trypanblau Vitalfärbemittel verwenden.
HINWEIS: Resuspendieren der Zellen mit HBSS - / - (ohne Ca 2+ und Mg 2+ Kationen) Zellaggregation zu minimieren. Zwischen 800.000 und 1.000.000 Zellen werden von einem E17.5 Herzen erhalten.
- Pre-warm die 200 ug / ml Kollagenase in HBSS + / + (im folgenden als Enzymlösung bezeichnet) auf 37 ° C.
- Anfärben Herzzellen mit fluoreszierenden Antikörpern
HINWEIS: Alle Antibodies vorher optimale Definition der Zellpopulationen zu erhalten titriert (die Titration mit dem Antikörper Charge variieren kann) .Die im Herzen Platte verwendeten Antikörper sind in Tabelle 1 aufgeführt.- die Herzzellen in Suspension durch eine 96-Well-Platte (Rundboden) verteilen. Verteilt sie gleichmäßig über alle benötigten Vertiefungen (200 & mgr; l pro Vertiefung), Kurz Spin Zentrifuge der 96-Well-Platte für 1 min bei 480 x g und den Überstand verwerfen.
HINWEIS: Alle Vertiefungen des 96-Well-Platte (mit runden Boden) verwendet werden. - Resuspendieren des Pellets und inkubiere die Herzzellen für 20 min im Dunkeln bei 4 ° C mit 100 & mgr; l des Cocktails von Antikörpern (dh CD45-PE, TER119-PE, CD31-Alexa 647 und Sca-1-PE-Cyanine5 verdünnt) in HBSS - / - 1% FCS.
- Waschen Sie die Herzzellen aus dem Überschuß an Antikörper, die durch Zugabe von 200 & mgr; l HBSS - / - 1% FCS und Kurz Spin um die Zellen für 1 min bei 480 x g zentrifugiert.
- Überstand verwerfen und wiederholendie Kurzspinn Zentrifugation (Schritt 3.4.3).
- Resuspendieren der Zellen in 200 ul HBSS - / - 1% FCS und sie auf ein 5-ml-Röhrchen, die 200 & mgr; l bereits HBSS - / - 1% FCS.
- Vor der Übernahme, fügen 400 ul HBSS - / - 1% FCS mit 0,5 ug / ml PI und Filtern der Zellsuspension obwohl ein 70 um Nylon-Mesh.
- die Herzzellen in Suspension durch eine 96-Well-Platte (Rundboden) verteilen. Verteilt sie gleichmäßig über alle benötigten Vertiefungen (200 & mgr; l pro Vertiefung), Kurz Spin Zentrifuge der 96-Well-Platte für 1 min bei 480 x g und den Überstand verwerfen.
4. Erwerb von Beschriftete Splenic, Darm- und Herzzellen mit dem Spectral Durchflusszytometer
- Vor dem Erwerb der Daten kalibriert automatisch die spektralen cytometer die Anweisungen des Herstellers folgen. Führen Sie die täglichen und die monatlichen Qualitätskontrollverfahren jeden Tag des Experiments.
- Wenn das Zytometer bereit ist, starten Sie die Vorschau der Proben, die die Zellsuspensionen mit allen Antikörpern markiert enthält.
HINWEIS: Seien Sie nicht erwerben. - Stellen Sie sicher, dass alle Laser auf sind je nach Bedarf. Stellen Sie die FSC Verstärkung derart, dass alle Zellen in dem jeweiligen sichtbarenParzellen. Gate die Zellpopulation und wendet dieses Gate an die beiden Spektraldiagramme entsprechend den 488-nm und mit dem 638/405-nm-Laser.
HINWEIS: Wenn Fluorochrome durch den 638-nm - Laser angeregt werden ( das heißt, wenn der 638-nm - Laser eingeschaltet ist), gibt es eine Maske , die Abschirmungen 617 bis 662 nm Licht in die PMT den 638 - nm - Laser , um zu verhindern scheint. Dies bewirkt den Verlust eines Teils des Spektrums, und verursacht daher eine geringere Abscheidung von Farbstoffen in der Nähe dieser Wellenlängen emittieren. Allerdings kann das gesamte Signal durch Ausschalten des 638-nm-Laser gesammelt werden, wenn es nicht für die Erfassung erforderlich ist. - Stellen Sie den 32-Kanal - Photomultiplier (PMT) Spannung (%) , so dass alle Fluorochrome innerhalb des Bereichs der Intensität in der Y-Achse angezeigt sind (1-10 6) in den zwei verschiedenen Spektraldiagramme Anzeige 488 nm und 405/638 nm Erregungen.
HINWEIS: Die Ausbildung ist erforderlich, um die Spektren aller Fluorochrome verwendet zu erkennen. - Starten Sie die Proben zu erwerben. Klicke auf "; Vorschau“ , um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und klicken Sie dann auf‚Acquire‘ , um die Probe zu erfassen aus jeder Probe zu 2 x 10 6 Veranstaltungen sparen..
- Nachdem die gefärbten Proben zu erwerben, erwerben, die mit dem Vitalfarbstoff gefärbte Probe und dann einzeln den Kompensationsperlen gefärbt mit allen verwendeten Antikörpern. Klicken Sie auf „Vorschau“, um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und dann auf „Acquire“, um die Proben aufzunehmen.
HINWEIS: Halten Sie die gleiche PMT - Spannung für alle Proben und Kontrollen (dh Perlen und ungefärbten Proben); 5.000 Veranstaltungen sind weitgehend ausreichend. - Schließlich erwerben die Daten von den nicht markierten Zellsuspensionen. Klicken Sie auf „Vorschau“, um die Zellen auf dem Bildschirm sichtbar zu machen und dann auf „Acquire“, um die Proben aufzunehmen.
HINWEIS: Der Erwerb der ungefärbten Proben am Ende des Experiments minimiert die Verschleppung von fluoreszierenden Zellen. - Reinigen Sie das Zytometer nach den Anweisungen des Herstellers eind das Experiment in den Erwerb Ordner schließen.
HINWEIS: Erst nach dem Experiment Schließen wird es für die Analyse gespeichert und verfügbar sein.
5. Die Analyse der Daten mit Spectral FCM Software
- In der „Farbpalette“ Fenster der „Analyse“ Registerkarte registrieren alle Parameter, die in der Platte durch jedes Fluorochrom Zugabe verwendet und die entsprechende Markierung (wählen Sie aus der Liste oder einen neuen Parameter hinzufügen). Außerdem gehören die Autofluoreszenz und Lebensfähigkeit Parameter; Alle ausgewählten Parameter werden im „Entmischung“ Fenster angezeigt.
- Wählen Sie die erste Single gefärbte Probe (done mit Ausgleichskugeln) in den „Control“ Fenster unter der „Tube List“ dieses Experiments auf der „Analyse“ aus. In dem Arbeitsblatt, klicken Sie auf „Polygon - Design - Tool“ und entwerfen Sie ein Tor auf der Beadpopulation im FSC / SSC Plot. Doppelklicken Sie auf der Oberseite des Gatters ein spektrales oder Punktdiagramm zu öffnendie gated Perlen in einer Tochter Grundstück zu visualisieren.
- Design Ein Tor für die positiven und ein Gatter für die negativen Perlen entweder auf dem Spektrum oder auf dem Dot-Plot. Überprüfen Sie die gesamten Spektren auf die beiden Lasersätze für jede positive und negative Fraktion entspricht, und Ausreißer eliminieren, indem nacheinander Anschnitt- und Klicken auf das Tor die Tochter Population zu verifizieren. Geben Sie den negativen und positiven Gates in der „Entmischung“ -Fenster.
- Wiederholen Sie Schritt 5.2 für jede einzelne gefärbte Probe.
Hinweis: Beachten Sie, dass die positive und negative Gating-Strategie auf die Probe entspricht, das analysiert wird, obwohl das Programm ermöglicht es in jeder Probe gestellt werden. Statt eine negative Fraktion für jede Einzel gefärbte Probe zur Bestimmung, verwenden, um eine ungefärbte Probe bead ein universelles negativ einzustellen.
- Wählen Sie die ungefärbten Zellprobe in der „Tube List“ und Design Tore für autofluoreszenten und für Nicht-autofluoreszenten Zellen. <li> Wenn alle negativen und positiven Tore für alle Parameter, einschließlich Auto-Fluoreszenz und die Lebensfähigkeit in der „Entmischung“ Fenster ausgewählt sind, klicken Sie auf „Berechnen“. Tragen Sie die Entmischung zu den Proben analysiert werden.
- Analysieren Sie die Daten durch Tore Entwerfen und Erstellen von zweiparametrige Plots.
- Zunächst entwirft ein Tor für SSC gegen FSC und tote Zellen entfernen, indem alle Zellen mit der Lebensfähigkeit Marker (PI gegen CD45) markiert ausgenommen. Auf dem Rest der Zellen, Design - Gatter für alle Populationen von Interesse , die Strategie für jedes Zellsuspension folgenden beschrieben (Abbildungen 1-3).
HINWEIS: Falls erforderlich, stellen Sie die Kompensation in der „Referenzspektrum Teller.“ Dies ist ein Werkzeug, das nach Entmischung verwendet werden kann, um den Median der positiven Populationen für jede Fluorochrom neu zu justieren, wenn der Algorithmus nicht perfekt machen kann.
- Zunächst entwirft ein Tor für SSC gegen FSC und tote Zellen entfernen, indem alle Zellen mit der Lebensfähigkeit Marker (PI gegen CD45) markiert ausgenommen. Auf dem Rest der Zellen, Design - Gatter für alle Populationen von Interesse , die Strategie für jedes Zellsuspension folgenden beschrieben (Abbildungen 1-3).
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Representative Results
21-Parameter-Spektraldaten FCM Panel Splenozyten zu analysieren
Abbildung 1 zeigt die erhaltenen Ergebnisse mit dem 19-fluoreszierendes-Antikörper - Panel Milz- Zellen angewendet, die verschiedene Antikörper Untergruppen von T, B, NK, dendritische und myeloiden Zellen zu erkennen, während alle hämatopoetischen CD45 kernhaltiger Zellen markiert. Die Platte enthält auch einen Lebensfähigkeitsfarbstoff (PI), sowie die Größe (FSC) und Granularität (SSC) Parameter. 1A zeigt die Referenzspektren Fluorochrom. Nach der Beseitigung von toten Zellen in dem CD45 + Gate (1B) zeigt die Analyse , dass CD3 + T - Zellen , die TcR & bgr; Kette und haben die erwarteten CD4 / CD8 Verteilung und den Anteil von CD25 + Zellen in CD4 T - Zellen exprimieren. CD8-T-Zellen zeigen eine normale Verteilung von CD44- und Ly49D-exprimierenden Zellen. CD19 + B - Zellen co-exprimieren B220 eind MHCII sowie IgM und IgD, die typisch für reife splenic B-Zellen. Eine Untergruppe von NK1.1 + NK - Zellen stellt eine kleine Teilmenge der Milzlymphozyten , die coexprimieren Ly49D. Die verbleibenden Zellen umfassen eine kleine Untergruppe von CD11c + dendritische Zellen , die mit hohen Mengen an MHC - II, von denen einige auch CD11b +. F4 / 80 + Zellen charakteristisch für Gewebe-residenten Makrophagen coexprimieren CD11b und die höchsten Niveaus von CD44 in der Milz gefunden. Die verbleibenden Zellen (CD19 - NK1.1 - CD3 - F4 / 80 - CD11c -) kann durch die Expression von CD11b und Gr1 unterteilt werden, wobei die kleine Teilmenge von doppelt positiven Zellen auch ein hohes Maß an CD44 exprimieren, wahrscheinlich Vorläufern entsprechen bekannt, bei niedrigeren Frequenzen in der Milz vorhanden sein. Ein großer Teil war negativ für die drei Marker. Abbildung 2 zeigt die gleiche Analyse , bevor die Kompensation eingestellt wird .
Abbildung 1: Ein 19-Farben - Antikörper - Panel für die Analyse von Mäusemilzzellen. (A) Maus - Splenozyten wurden mit der vorherige Antikörperkombination gefärbt, auf die CD45-evolve wurde 655 hinzugefügt. Die Referenzspektren aller Fluorochrome gezeigt. Fluorophormarkierten CD45 wird durch einen roten Pfeil markiert. Die Fluorochrome sind in Tabelle 1 (B) aufgeführten Konturplots die diskriminative Kapazität dieser Mehr parametrischen Analyse zeigt die verschiedenen Populationen von B, T, NK, dendritische oder myeloiden Zellen zu trennen. Die Analyse wurde in herkömmlicher FCM-Software durchgeführt, nachdem Entfaltungs Entmischung.
Abbildung 2: Ein 19-Farbe Antikörper - Panel für die Analyse von Mäusemilzzellen. Die gleiche Analyse wie in Abbildung 1 wurde vor der adjus getantment der Kompensation mit den Referenzspektren Teller.
Dünndarm intraepitheliale Lymphozyten
Mehrere T-Zellpopulationen sind im Darm innerhalb der epithelialen Zellschicht 5, 6 vorhanden. Herkömmliche Isolierung dieser Untergruppen umfasst, die einen Dichtegradienten Lymphozyten von Epithelzellen trennt. Allerdings ist diese Vorbereitung ist heikel, zeitraubend und führt zu Zellverlust. Zur Verbesserung der Quantifizierung und das experimentelle Verfahren zu erleichtern, wird das Potential der spektralen FCM zu Populationen von intestinalen Lymphozyten innerhalb einer großen Fraktion von Epithelzellen zu unterscheiden, wurde getestet. Nach der mechanischen Störung der epithelialen Gewebe, Zellsuspensionen wurden mit Antikörpern gefärbt, die Teilmengen von αβ und yô T-Zellen in der Regel gefunden im Darmepithel etikettieren. DasZellen wurden in zwei konventionellen Zytometer und in spektraler FCM analysiert.
Abbildung 3 zeigt die Ergebnisse nach einer ähnlichen Strategie Gating folgenden, unter Eliminierung von toten Zellen auf PI-negativen Zellen Gating. Das Vorhandensein von Auto-fluoreszierenden Zellen ist offensichtlich in allen konventionellen Zytometer und der spektralen Cytometry, wenn der Auto-Fluoreszenz-Manager (Toppanels, rote Pfeile) inaktiviert wird, was zu einer schlechten Diskriminierung der lebenden Zellen. In allen Plots, Zellen innerhalb des FSC-A / SSC-Lymphozyten-Gate A sind in Blau und Zellen mit größeren Streuungen (Epithelzelle gate) werden in rot dargestellt. Beiden herkömmlichen Instrumente waren nicht in der Lage , die CD3 + T-Zell - Untergruppe (in blau) (türkis Pfeil) von den übrigen Zellen zu lösen. Daher TcR & bgr; - Zellen (grüner Pfeil) der CD3 + TcRγδ kontaminiert - Bevölkerung, eine biologisch unwahrscheinliche Teilmenge nie nach dem separati erkanntOn der Lymphozyten aus Epithelzellen. Im Gegensatz dazu wurde im Spektral-FCM nach dem Auto-Fluoreszenz-Management die Analyse der verschiedenen T-Zell-Teilmengen nicht durch die Anwesenheit von Epithelzellen beeinträchtigt, die Populationen waren gut getrennt und es gab keine TcR-negativen Zellen im CD3 + Tor.
Abbildung 3: Die Anwesenheit von Auto-fluoreszierenden Zellen beeinträchtigt nicht den Nachweis von intra-epithelialen Lymphozyten im Spektral-FCM. Kleine Darmzellen, einschließlich Epithelzellen und Lymphozyten, wurden mit Antikörpern, die TcR & dgr ;, PI, TcR & bgr; Cy7-APC CD3 (Tafeln B), V & ggr; 7 APC, V & bgr; 4 Cy7-PE (Tafeln C) und CD & sub8; FITC (Tafeln D) erkennen, gefärbt. PI wurde im FACS-Puffer vor der Analyse zugegeben. Die Erfassung der Daten erfolgte nacheinander in den drei Instrumenten nach der entsprechenden Qualitätskontrolle. Dubletten wurden eliminiertted in FSC-H / FSC-W. Die Analyse wurde in herkömmlicher FCM-Software. Diagramme zeigen die verschiedenen Schritte der Gating-Strategie. Zellen innerhalb des FSC-A / SSC-Lymphozyten-Gate A werden blau markiert, während Zellen in der intestinalen Epithelzelle Gate in rot markiert sind. Die Pfeile zeigen auf unterschiedliche Bevölkerungs Verzerrungen und Autofluoreszenz. Plots in C zeigt die Analyse der spektralen Daten in FCM ohne Autofluoreszenz-Management in der Entmischung erhalten, während D die gleichen Daten nach der Entmischung mit Autofluoreszenz-Management zeigt.
embryonale Herz
Herkömmlicher FCM zeigte eine große Population von auto-fluoreszierenden Zellen (schwarzer Pfeil), die von der Analyse ausgeschlossen, weil es in der CD45 und TER119 Dump Kanal (PE) fluoresziert, Kennzeichnung hämatopoetischen Zellen. Im Gegensatz dazu diese auto-fluoreszierenden Population war nicht als solche in der spektralen FCM und wurde in der CD45 umfasst
Abbildung 4: Auto-fluoreszierende Zellen in E17.5 Herzzellsuspensionen werden richtig in der Negativen Zellfraktion in Spectral FCM eingeschlossen. (A) Zellsuspensionen aus fetalen Herzen wurden mit anti-TER119 und CD45-PE, Sca-1-PECy5 und CD31-APC-Antikörper und sequentiell in den drei Instrumenten übernommen. Schwarze Pfeile zeigen auto-fluoreszierenden Zellen in den beiden conventional Zytometer, während diese Zellen nicht als Auto-Fluoreszenz in spektraler Zytometrie nachgewiesen und können damit zur spezifischen Fluoreszenzfärbung analysiert. (B) Selbst-fluoreszierenden Zellen (innerhalb des elliptischen Gate in grün), nicht aber CD31 + Zellen (rectangular Gate in blau, negativer Kontrolle) zeigten die Expression von kardialem Troponin (TNNT2) 7 und atriale leichter Kette-2 (MYL7) 8 - Transkripte. au - willkürliche Einheiten gegenüber dem GAPDH Housekeeping Transkript. Die präsentierten Daten als Mittelwert ± SEM.
| Anregungslaser | Fluorochrom | Spezifität | Klon | |
| 488 nm | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm | PE | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm | PE-Cy7 | CD11b | M1 / 70 | |
| 488 nm | PerCP-Cy5.5 | IgM | R6-60.2 | |
| 488 nm | PerCP | Gr-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm | Propidiumiodid | Lebensfähigkeit | ||
| 405 nm | V450 | IgD | 11-26c.2a | 405 nm | BV421 | CD11c | HL3 |
| 405 nm | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm | Evolve 655 | CD45 | 30-F11 | |
| N / A | gereinigter | CD16 / CD32 | 2.4G2 | Fc-Rezeptor-Block |
| Liste der Antikörper in cardi verwendetac Zellsuspension | ||||
| 638 nm | Alexa Fluor 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm | PE | CD45 | 30-F11 | |
| 488 nm | PE-Cy5 | Sca-1 | D7 | |
| 488 nm | PE | Ter119 | TER-119 | |
Tabelle 1: Liste des Antikörpers im Panel 19-Farbe verwendet und in der Herzzellsuspension.
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Discussion
Herkömmliche FCM auf der Detektion von Photonen basierend emittieren nach Anregung von Fluoreszenzsonden. Die Fluoreszenzemission von einem Fluorochrom in einem Detektor erfaßt ausgelegt, das Signal von einem anderen Fluorochrom zu messen induziert physikalische Überlappung. Diese Spill-over zwischen Emissionsspektren muss durch Kompensationen korrigiert werden.
Spectral FCM und Datenverarbeitung durch die Entmischung Entfaltungsalgorithmus erlaubt die Kombination von Fluorochromen mit engen Emissionsspitzen ohne zusätzliche Kompensation, vorausgesetzt, dass sie unterschiedliche spektrale Formen aufweisen. Der Algorithmus für die Analyse behandelt Autofluoreszenz als unabhängigen Parameter verwendet wird, nicht-spezifische Fluoreszenz von festen Gewebezellsuspensionen subtrahiert.
Ein Panel von 19 Fluorochrome wurde zusammengesetzt Immunzellen nur zwei Laser (488 nm und 405 nm) unter Verwendung von zu analysieren. In der Tat, wenn der 638-nm-Laser eingeschaltet war, ein Abschnitt der PMT 32-Kanal entspricht,auf die Anregungswellenlänge dieses Lasers war nicht verfügbar. Um die maximale Erkennungskapazität der PMT zu erhalten, wurde der rote Laser abgeschaltet. Maus wurden Milzzellen analysiert, so dass für den Nachweis von mehr als 12 verschiedenen Zellpopulationen, von denen einige umfasste 1% oder weniger der hämatopoetischen Zellen.
Um die Kapazität der spektralen FCM zu testen Auto-Fluoreszenz, zwei verschiedene Situationen zu verwalten, welche die Analyse beeinträchtigen wurden getestet: eine, bei Lymphozyten mit Epithelzellen kontaminiert waren, und eine, wo Autofluoreszenz wurden Herzzellen analysiert. Im Gegensatz zu herkömmlichen FCM ermöglicht spektrale Zytometrie für die Unterscheidung aller Lymphozytteilmengen, auch wenn sie kleinere Teilmengen darstellen.
Der Streit um die Regenerationsfähigkeit der adulten Kardiomyozyten 9, 10, 11 ist teilweise aufgrund des Fehlens einer Strategie zur discriminate und verschiedene Untergruppen von lebenden Zellen im Herzen isoliert. Eine Multi-parametrische Analyse definiert einzigartige Kombinationen von Markern, die verschiedenen Herzuntergruppen zu unterscheiden, könnte die Detektion von seltenen Subsets aufgrund der großen Anzahl von Zellen ermöglichen, die analysiert werden können. Fetal Herzen (E17.5) wurden analysiert, und ein großer Teil der Auto-fluoreszierenden Zellen, die den Nachweis in herkömmlicher FCM entkommen würden, wurde in dem nicht-hämatopoetischen lebensfähigen Herzen Zellkompartiment im spektralen FCM integriert.
Ein immer wieder auftretendes Problem dieser Methode ist die Voraussetzung für eine gute Qualität fluoreszenzmarkierten Antikörper. Dies ist besonders kritisch, wenn Tandem-Farbstoffe verwenden, in denen eine Komponente des Tandems-dominant ist. Zum Beispiel BV786 und Cy7-PE kann schwierig sein, von BV421 und PE zu unterscheiden sind.
FCM basierend auf Spektrometrie stellt analytische Leistung höher als die mit herkömmlichen FCM erhalten, ohne die Notwendigkeit einer Kompensation matrices. Dieses Manuskript liefert den Beweis, dass es ein alternativer Ansatz ist, die eine hohe analytische Leistungsfähigkeit demonstriert, das Fehlen von komplexen Kompensations Matrizen, die unbeeinträchtigt Diskriminierung von Zelluntergruppen aufgrund von Autofluoreszenz und keine zusätzliche finanzielle Verpflichtungen, die noch für die Massenspektrometrie FCM erforderlich. Spectral FCM scheint somit ein Verfahren der Wahl für die Analyse von Zellen, die aus einer Vielzahl von festen Geweben normalerweise nicht zugänglich herkömmlichen FCM erhalten wird und kann in Tumor, entwicklungs verwendet werden, und Zellbiologie einzudämmen.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Wir erkennen die technischen und theoretischen Beiträge in der spektralen Zytometrie von K. Futamura, die sich kritisch auch das Manuskript überarbeitet. Wir sind auch verpflichtet C. Ait-Mansour, P.-H. Commere, A. Bandeira und P. Pereira für kritisch Sicht des Manuskripts und für endlose technische Beratung und Unterstützung. Wir danken auch P. Pereira für das Geschenk der anti Vγ7-APC und Vδ4-Biotin markierten Antikörper. Wir aknowledge das Centre d'Enseignements von Pasteur-Institut für freundliche und die Dreharbeiten Logistik unterstützen. Diese Arbeit wurde vom Pasteur-Institut, Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale (INSERM) unterstützt; die SNF und Pasteur Bourse Roux (SS); Fundação para a Ciência ea Tecnologia - SFRH / BD / 74218/2010 (MV); und Université Paris Diderot, die Agence Nationale de la Recherche (ANR) Projekt Twothyme, die ANR und Programm REVIVE (Investition für die Zukunft) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
- Futamura, K., et al. Novel full-spectral flow cytometry with multiple spectrally-adjacent fluorescent proteins and fluorochromes and visualization of in vivo cellular movement. Cytometry A. 87 (9), 830-842 (2015).
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