Summary
이 문서 분광 계측법, 형광 색소를 구별하는 발광 스펙트럼의 형상을 사용하여 유동 세포 계측법에서의 새로운 접근 방식을 설명한다. 알고리즘은 보상을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리 할 수 있습니다. 이 새로운 접근 방식은 고체 기관에서 분리 된 세포의 적절한 분석을 할 수 있습니다.
Abstract
유동 세포 계측법 정의하고 림프 및 기타 조혈 세포의 표현형을 분석하기 위해 지난 40 년 동안 사용되어왔다. 처음 몇 형광 색소의 분석으로 제한, 현재 다른 형광 염료 수십있다, 최대 14-18 다른 염료는 한 번에 결합 할 수 있습니다. 그러나 다음과 같은 몇 가지 제한 사항이 여전히 분석 기능을 손상. 이 때문에 형광 프로브의 다수의 데이터 분석 인해 대형 멀티 파라미터 보정 행렬들의 필요성 점점 복잡해지고있다. 고형 장기에 의한 자동 형광 세포 현탁액 (유동 세포 계측법에 의하여) 분석이 필요하므로 또한, 검출 및 다른 조직에서 특정 세포 유형을 추적 형광 단백질을 운반하는 돌연변이 마우스 모델은, 가능하게되었다. 연속적인 파장의 넓은 범위에 따라 발광 스펙트럼의 형상을 구분하는 유세포 스펙트럼, 이러한 문제를 해결한다. 데이터는 분석 승보상 행렬을 대체하고 독립적 인 매개 변수로 자동 형광을 처리하는 알고리즘 i 번째. 따라서, 스펙트럼 유세포 유사한 발광 피크와 형광 색소를 판별 할 수 있어야 보상 요구없이 다중 파라미터 분석을 제공 할 수있다.
이 프로토콜은 작은 모집단 검출 높은 해상도를 제공하는 파라미터 (21) (19 형광 프로브) 특성 및 자동 형광 신호의 관리를 허용 계측법 분석 스펙트럼의 흐름을 설명한다. 여기에 제시된 결과는 스펙트럼 유동 세포 계측법 같은 심장과 소장 등 계측법 종래 흐름 특성화하기 어려운 조직으로부터 세포 집단의 분석에 이점을 제공 보여준다. 유동 세포 계측법에 따라서 보상 없이도 계측법 종래 플로우를 실행 가능하고 높은 자동 형광 관리의 다중 파라미터 분석 능력을 보여주는 스펙트럼.
Introduction
지난 수십 년에서 유동 세포 계측법 (FCM)은 세포 표현형 연구에 필수적인 널리 사용되는 분석 방법이되었다. 특히 바이올렛 레이저 (405 ㎚) (예를 들어, 브릴리언트 바이올렛 새로운 Q 점 염료)에 의해 여기 된 형광 색소 가능한 형광 염료의 실질적인 증가가 있었다. 그러나 가능한 형광 염료의 성장은 중복 배출의 위험을 증가시키고 노동 집약적 보상 행렬을 필요로한다. FCM 고형 조직에서 세포 현탁액을 분석하기 위해 널리 사용되었지만, 자동 - 형광 세포의 존재는 특히 표지 집단의 차별을 제한한다.
스펙트럼 FCM의 기본 원리는 타무라 등에 상세히보고되어있다. 1,2. 간략하게, 여기서 사용되는 스펙트럼 FCM은 (재료의 테이블 참조) 405, 488, 및 638 nm의 레이저를 구비한다. 스펙트럼 FCM 모든 출사 F 캡처800 내지 500 nm이고, 종래의 대역 통과 필터를 교체 420 nm의 각각 내지 469 nm 내지 440 450 2 개 독립의 PMT에 대한 32 채널 선형 어레이 PMT (32 채널의 PMT)의 스펙트럼과 같은 luorescence. 405 nm 내지 638 nm의 레이저 스폿은 공동 선형 동안 488 및 638분의 405 nm의 레이저 반점은 공간적으로 분리된다. 각각의 입자를 들어, 405 nm의 여기에 의해 형광의 데이터를 66 개 채널과 488 nm의 레이저까지 스펙트럼 FCM 측정. 세포가 638 nm의 레이저에 의해 여기되는 경우, 마스크가 PMT에 빛나는에서 638 nm의 레이저를 방지하기 위해 삽입되기 때문에, 상기 스펙트럼은 형광 FCM 데이터 채널 (58)을 측정한다. FCM 분광 형광 스펙트럼 중첩의 분리를 가능하게 가중 최소 제곱 법 (WLSM)에 기초한 알고리즘을 사용하여 획득 된 전체 스펙트럼 데이터를 분석한다. 단일 염색 염색 된 샘플로부터 유도 된 스펙트럼은 기본 기준 스펙트럼으로서 인식된다. 멀티 스테인드 샘플을 수학적으로 장착된다비 혼합 및 혼합 된 형광 라벨 샘플의 스펙트럼 ND는 스펙트럼 성분의 집합으로 분해된다. unmixing는 분광 기술 3, 4에서는, 특정 염료를 측정 제외한 모든 검출기로부터의 신호를 제거하는 보정을 대체한다.
본 연구에서는 결합 마우스 비장에서 발견 된 주요 조혈 부분 집합을 특징으로 한, 21 매개 변수 분석 (19) 형광 색소를 테스트했다. 또한, 우리는 스펙트럼 세포 계측법 따라서 장 내 상피 림프구 및 배아 심장의 특성을 개선, 자동 형광 신호를 관리 할 수 있음을 보여 주었다. 사실,이 조직에서 자동 형광 관리는 기존의 FCM의 분석에서 제외 될 세포에 특정 형광의 할당을 허용했다.
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Protocol
모든 실험은 파스퇴르 연구소 윤리 헌장과 유럽 연합 (EU) 지침에 따라 수행되었고, 프랑스 농업 장관에 의해 승인되었다.
성인 마우스 기관에서 1. 세포 현탁액을 준비
- 비장 세포의 분리
- 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 복부 정중선에서 절개를하고 가위로 피부를 엽니 다. 집게로 비장을 수확.
- 2 유리 현미경의 비장 세포를 해리하고 1 % 소 태아 혈청을 함유하는 행크의 균형 소금 용액 5 ㎖ (HBSS) (FCS)에이를 희석 슬라이드 크러시.
- 120 XG에서 10 분, 39 ° C 원심 분리기. 상층 액을 버린다.
- HBSS 1 % FCS 5ml에 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다.
참고 : 80,000,000 세포는 성인의 비장에서 얻을 수 있습니다.
- Isolati세포에 소장에서
- 자궁 전위에 의해 성인 쥐를 안락사. 가위를 사용하여 복부 중간 선에 피부 절개를합니다. 한 손에 집게로 소장을 잡고 양쪽 끝을 잘라 가위를 사용 : 바로 대장 전에, 바로 위 후 다음 소장의 끝에서 첫째. 바늘 2 mL를 주사기를 사용하여 1X 둘 베코 인산염 완충 염수 (DPBS)를 소장 플러시.
- 종이 타월에 소장을두고 신중하게 날카로운 가위로 페 이어의 패치를 제거합니다.
- 장 내부의 가위의 한 지점을 삽입하여 긴 측면에 장을 엽니 다 가위를 사용합니다. 예리한 가위를 사용하여 1 cm 조각으로 개방 된 부위를 잘라.
- 10 % FCS와 HBSS 30 ㎖ 일정 교반하에 37 ℃에서 30 분 동안 인큐베이션.
- 50 mL의 나머지 비 - 해리 된 단편과 세포 현탁액을 놓고플라스틱 튜브, 고속에서 5 분 동안 소용돌이. 참고 : 조직의 더 해리가 없습니다.
- 대형, 비 - 해리 된 단편 펠렛 있도록 얼음 위에서 10 분 동안 인큐베이션.
- 상청액을 수집하여 120 × g으로 7 분 동안 원심 분리하여 농축시켰다.
- 상층 액을 제거하고 1 %의 FCS와 HBSS 10ml에 펠렛을 재현 탁. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다.
참고 : ~ 6000 만 내 상피 세포 (IELs은) 성인 소장에서 얻을 수 있습니다.
- 패널 설계 전략
- 직접 형광 색소와 결합 항체 패널을 준비한다.
주 : 모든 항체 이전 세포 집단의 최적 정의를 획득하기 위해 적정된다 (적정 항체가 배치에 따라 달라질 수 있음). 비장 세포를 염색 19 컬러 패널에 사용되는 항체는 표 1에 나열되어있다. - 멀티 콜로 구축세포 계측법에 대한 R 패널. 이 어려운 작업이 될 수 있듯이, 패널을 최적화하기 위해 다음 지침을 따르십시오
- 스펙트럼 구성 및 기기에 사용할 수있는 형광 염료를 확인합니다.
- 제조업체가 제공하는 밝기 색인 / 염색 색인 정보를 사용합니다.
참고 : 밝기 색인 / 염색 지수는 각각 형광 색소 배경 대 형광 강도의 상대적 지표입니다. - 아래의 규칙에 따라 항체를 선택 :
- 약하게 발현되는 단백질 밝은 형광 색소 등 고도로 발현 된 단백질에 대한 가장 어두운 형광 색소를 선택.
참고 : 예를 들어, CD45, CD4 및 CD8가 높은 표현하고 희미한 형광 색소와 함께 사용할 수 있습니다. - 먼저 적은 형광 염료의 가능성과 항체를 선택하여 패널을 설계 시작합니다.
- 가능하면, 발광 스펙트럼의 F의 작은 오버랩 형광 염료를 선택마커 또는 동일한 세포 유형에서 발현.
주 : 빛의 노출에 의한 분해에 더 취약으로 탠덤 (예를 들어, PE-Cy5에, PE-Cy7과를 PerCP-Cy5.5)는,주의해서 사용해야합니다.
- 약하게 발현되는 단백질 밝은 형광 색소 등 고도로 발현 된 단백질에 대한 가장 어두운 형광 색소를 선택.
- 직접 형광 색소와 결합 항체 패널을 준비한다.
- 세포 계측법 분석을위한 세포의 염색
- 음성 대조군으로 사용하기 위해 염색 그들을 유지 1 × 106 비장 세포를 1 × 106 세포 및 장 한 5 ㎖ 튜브 한 5 ㎖ 튜브를 준비한다.
- 준비하고, 표 1에있어서 시료 당 패널 당 5 ㎖ 튜브 라벨. HBSS 1 % FCS에, 표 1에있어서, 항체의 혼합물을 준비한다.
- 전송 1 × 106 세포 - 하나 또는 비장 장 세포 - 각 5 ㎖ 튜브에. 39 ° C에서 5 분, 120 × g으로 2 ㎖의 HBSS의 1 % FCS 및 원심 분리기를 추가한다. 상층 액을 제거하고, 항체의 혼합물 50 μL에 펠렛을 재현 탁.
- 의 S 레이블2 단계 plenocytes. 먼저, 5 ㎖ 튜브에 PE-시아닌 5를 PerCP-시아닌 5.5를 PerCP 및 표지 항체를 함유하는 혼합물을 50 μL (Fc 수용체 차단으로)를 사용한다. 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 배양 한 후, 5 ㎖ 튜브에 다른 모든 항체를 함유하는 혼합물의 50 μL를 추가한다.
참고 :이 전략은 입체 장애를 제한합니다. - 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 인큐베이션.
- 39 ° C에서 5 분, 120 × g으로 2 ㎖의 HBSS의 1 % FCS 및 원심 분리기를 추가한다. 상층 액을 제거하고, 0.5 ㎍ / ㎖의 프로피 디움 요오다 이드 (PI)를 HBSS 1 % FCS 200 μL에 펠렛을 재현 탁.
(예 UltraComp eBeads) 상용 보상 비드 마이크로 스피어 각 형광 색소에 대한 단일 염색 2. 제조는 이하 비드라고도
- 준비하고 패널에 사용되는 항체의 수만큼 5 개 ㎖ 튜브 라벨. 각 튜브에 구슬 1 방울을 넣고 1 & # 추가(181), 튜브 당 항체 L.
참고 : 여기에 사용 된 비즈 (재료의 표 참조) (긍정적) 및 염색 (음) 구슬 스테인드 들어 있습니다. 항체는 각 염료에 대해 이렇게 명확한 스펙트럼 서명을 밝은 신호를 보장하기 위해 구슬을 초과 넣고있다. 이것은 정확한 unmixing을 할 수 있도록 소프트웨어가 필요합니다. - 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 인큐베이션.
- g (X) (120)에서 5 분 동안 HBSS 1 % FCS 및 원심 2 mL를 넣고. 상층 액을 제거하고 HBSS 1 % FCS 100 μL에 펠렛을 재현 탁.
배아 마우스 마음 3. 세포 현탁액을 준비
- 배아의 해부
- (17 및 19 시간 사이)의 날 끝 (항상 남성의 장에) 한 수컷과 암컷을 교배 2에 의해 미리 타이밍 된 임신 여성을 수득 할 계획이다. 다음날 아침은 질 플러그 여성은 후 교미 0.5 일 것으로 판단된다.
- E17.5 임신 femal를 안락사자궁 경관 탈구로 말야. 마우스 발을 단단히 눌러 동물이 반응하지 않는지 확인하십시오 (발가락 핀치 반사). 복부를 70 % 에탄올로 적셔 살균하고 마우스 모피의 퍼짐을 예방하십시오.
- 가위로 복부의 중앙에있는 피부를 절개하고 손가락으로 피부를 당겨냅니다.
- 복부 근육을 끌어 당기고 복부 근육을 중앙에서 복부의 양쪽면으로 절개하여 전체 복부와 가위를 사용하여 복강을 엽니 다.
참고 : 복막 근육 바로 아래에있는 소장을 손상시키지 않도록주의하십시오. - 자궁 뼈와 자궁의 수준에서 절단하여 자궁 뿔 (배아)을 수집하십시오. DPBS 50 ML와 90 X 15 밀리미터 2 페트리 접시에 그들을 담그십시오.
- 각 decidua 사이에 절단하여 각 배아를 분리, 자궁 근육 벽과 미세한 집게와 가위와 함께 내장 난황낭. 배아 int 가져 오기행위. 마지막으로, 탯줄을 잘라.
- 해부를 시작하기 전에 가위 (참수)와 E17.5 배아의 머리를 잘라.
- 마음의 컬렉션
- 젖은 종이 타월 접시 바닥 침구 1 % FCS와 HBSS 50 ㎖를 함유하는 90 X 15mm 2 페트리 접시에 배아를 참수 담근다.
- 복부 측이 위로 오도록 실체 현미경 하에서 총 집게 각 배아를 잡아.
- 조심스럽게 심장의 손상을 방지하기 위해 가위로 가슴의 오른쪽을 절단하여 흉부 그리드를 엽니 다.
- 총 집게로 흉곽을 잡고 마음을 노출.
- (IN-의 밖으로 흐름 마음의 큰 혈관을 포함하는) 큰 혈관을 잡고 (여전히 폐와 흉선 조립) 마음을 떨어져 당겨 HBSS 2 mL의 35 X 15mm 2 페트리 접시에 배치 FCS와 1 %.
- 주변 기관에서 마음을 분리하고미세 집게와 메스와 결합 조직.
- HBSS 1 % FCS의 2 mL를 새로운 35 X 15mm 페트리 접시에 마음을 씻고 마음이 챔버 내부의 혈액을 펌프 할 수 있도록 20 분 동안 얼음에 보관하십시오.
- 심장 세포 현탁액의 준비
- 37 ° C로 HBSS + / + (이하 효소 용액이라고 함)에 200 ㎍ / ㎖의 콜라게나 제를 미리 가온.
주 : HBSS에서 콜라게나 희석 + / + 효소 활성을 최대화하기 위해 (칼슘 및 마그네슘 양이온 2+)와; 콜라게나 제 활성은 일괄 사이 안정적이다. - 예열 효소 용액 1 ㎖와 하트 (HBSS 1 % FCS)를 담글 세정액을 교체.
- 실체 현미경 하에서 1 mm으로 미세 겸자 메스를 사용하여 3 개 마음 말하다. 예열 된 효소 용액의 또 다른 1 mL를 첨가하고, 뚜껑을 5 ㎖ 튜브에 다진 조직 옮긴다.
참고 : 최적의 소화를 들어, 배치효소 용액 2 mL의 5 개 E17.5 하트 최대. 더 하트 동시에 분해되는 경우, 다른 5 개 ㎖ 튜브로 분할. - 37 ° C에서 15 분 동안 인큐베이션 다진 하트.
주 : 용액 따라 조직을 확산 인큐베이터에 5 개 ㎖ 튜브 (제대로 닫혀)에 누워.- 인큐베이션의 끝에, P1000 피펫 아래로 약 20 배를 피펫 팅에 의해 동일한 효소 용액 조직을 균질화. 나머지 조직 단편 침전물 (약 3 분)의 수직 위치에 5 ㎖ 튜브를 넣고하자.
- , 50 ㎖의 튜브 (현탁액에서 소화 세포를 포함) 상층 액을 모아서 추가 2를 계속하면서, 10 % FCS (효소 용액의 부피와 동일한 부피의 조직 단편을 첨가) 및 얼음에 그들을 유지 HBSS ㎖의 소화 과정.
참고 : HBSS 10 % FCS 솔루션과 얼음이 남아있는 조직이있는 동안 효소 작용을 비활성하는 것이 중요합니다소화. - 나머지 조직 절편을 가진 5 ㎖ 튜브에 미리 가온 된 효소 용액 2 ㎖를 첨가하고 조직이 더 이상 관찰되지 않을 때까지 단계 3.3.4을 반복하여 분해를 계속한다.
참고 : 소화의 약 4 사이클이 완전히 심장 조직 (효소 용액 2 mL를 5 E17.5 마음을) 해리하기에 충분하다.
- 300 XG에서 10 분 동안 현탁 세포와 함께 50 mL의 튜브를 원심 분리 상층 액을 제거한다.
- 상기 세포 펠렛을 재현 탁 HBSS 1 mL의 추가 - / - 1 % FCS를하고, 70 ㎛의 나일론 메쉬 비록 세포 현탁액을 필터. 트리 판 블루 중요한 얼룩을 사용하여 노이 바 우어 챔버와 세포를 계산합니다.
주 : - / - (칼슘 및 마그네슘 양이온 2+)없이 최소화 세포 응집 HBSS로 세포를 재현 탁. 80 사이에 1,000,000 세포는 하나의 E17.5 마음에서 얻을 수 있습니다.
- 37 ° C로 HBSS + / + (이하 효소 용액이라고 함)에 200 ㎍ / ㎖의 콜라게나 제를 미리 가온.
- 형광 항체 심장 세포 염색
참고 : 모든 antibodIES는 이전 세포 집단 (적정 항체가 배치와 다를 수 있음)를 중심 패널에 사용 국지적 항체가 표 1에 나와있는 최적의 정의를 획득하기 위해 적정한다.- 96 웰 플레이트 (환저)를 통해 현탁액의 심장 세포를 분산. 필요한 모든 웰 (웰 당 200 μL)에 걸쳐 균등하게 분배 짧은 스핀 원심 480 XG에서 1 분 동안 96 웰 플레이트, 상청액을 버린다.
참고 : 96 웰 플레이트 (둥근 바닥)의 모든 웰을 사용할 수있다. - 펠렛을 재현 탁하고 항체 칵테일 100 μL (즉, CD45-PE, TER119-PE, CD31-알렉사 647 및 무서 -1- PE-Cyanine5 4 ℃에서 어둠 속에서 20 분 동안 심장 세포를 배양 )에 희석 HBSS - / - 1 % FCS.
- HBSS 200 μL를 첨가하여 과량의 항체로부터 심근 세포를 워시 - / - 1 % FCS 및 480 × g으로 1 분간 원심 분리하여 세포를 짧은 스핀.
- 뜨는 반복 폐기짧은 스핀 원심 분리 (단계 3.4.3).
- - / - HBSS 200 μL에 재현 탁 세포를 1 % FCS 및 이미 HBSS 200 μL 함유하는 5 ㎖ 튜브로 전송 - / - 1 % FCS를.
- 0.5 ㎍ / mL로 된 PI로 1 % FCS 및 70 ㎛의 나일론 메쉬 비록 세포 현탁액을 필터 - / - 취득 전에 HBSS 400 μL를 추가한다.
- 96 웰 플레이트 (환저)를 통해 현탁액의 심장 세포를 분산. 필요한 모든 웰 (웰 당 200 μL)에 걸쳐 균등하게 분배 짧은 스핀 원심 480 XG에서 1 분 동안 96 웰 플레이트, 상청액을 버린다.
스펙트럼 흐름 사이토와 레이블 비장, 창자, 심장 세포의 4. 취득
- 데이터의 수집하기 전에 자동으로 제조업체의 지침에 따라 사이토 스펙트럼을 교정. 실험의 매일 매일 월간 품질 관리 절차를 수행합니다.
- 세포 계수기가 준비되면, 모든 항체로 표시된 세포 현탁액을 포함하는 샘플의 미리보기를 시작합니다.
참고 : 취득하지 마십시오. - 모든 레이저는 필요에 있는지 확인하십시오. 모든 셀 각각에 표시되도록 상기 FSC 게인을 조정플롯. 게이트 세포군 및 488 nm의 상기 405분의 638 nm의 레이저에 대응하는 두 개의 스펙트럼 플롯이 게이트를 적용한다.
주 : 형광 색소는 638 nm의 레이저에 의해 여기되는 경우 (638 nm의 레이저에있을 때, 즉,), 보호막이 PMT에 빛나는에서 638 nm의 레이저를 방지 617-662 nm의 빛을 마스크가있다. 이 스펙트럼의 부분의 손실을 유발하므로 이러한 발광 파장에 가까운 염료의 하부 분리시킨다. 그러나, 전체 신호가 획득을 위해 필요하지 않은 경우, 638 nm의 레이저를 전환하여 회수 할 수있다. - 모든 형광 색소는 488 nm 내지 638분의 405를 표시하는 두 개의 다른 스펙트럼 플롯에서 y- 축 (1-10 6)에 표시되는 휘도의 범위 내에 있는지 (PMT) 전압 (%) 예 32 채널 사진 배율을 조정 나노 기진.
참고 : 교육은 사용 된 모든 형광 색소의 스펙트럼을 인식해야합니다. - 샘플을 획득하기 시작합니다. 클릭 "; 미리보기 "화면에 세포를 시각화하고 다음을 클릭합니다"샘플을 기록하는 "취득 각각의 샘플에서 2 × 10 6 이벤트까지 저장합니다..
- 스테인드 샘플을 획득 한 후, 다음 생체 염료 개별적으로 사용 된 모든 항체로 염색 보상 비드 물들 샘플을 획득. 화면의 세포를 시각화하기 위해 "미리보기"를 클릭 한 후 "획득"에 샘플을 기록 할 수 있습니다.
참고 : 모든 샘플 및 컨트롤 (즉, 구슬과 염색 샘플)에 대해 동일한 PMT 전압을 유지; 5000 이벤트는 크게 충분하다. - 마지막으로, 흠없는 세포 현탁액의 데이터를 취득. 화면의 세포를 시각화하기 위해 "미리보기"를 클릭 한 후 "획득"에 샘플을 기록 할 수 있습니다.
참고 : 실험의 끝에서 흠없는 샘플을 획득 형광 세포의 이월을 최소화한다. - 제조업체의 지침 다음 사이토를 청소포착 폴더에서 실험을 닫을 거라고.
참고 : 실험을 닫은 후 그것을 저장하고 분석 할 수.
스펙트럼 FCM 소프트웨어와 데이터의 5 분석
- 은 "분석"탭의 "색상 표"창에서 사용 된 각 형광 색소와 해당 마커를 추가하여 패널에 모든 매개 변수를 등록 (사용 가능한 목록에서 선택하거나 새 매개 변수를 추가). 또한, 자동 형광과 생존 매개 변수를 포함; 선택한 모든 매개 변수는 "unmixing"창에 표시됩니다.
- 은 "분석"탭에서이 실험의 "튜브 목록"에서 "컨트롤"창에서 (보상 구슬 완료) 첫 싱글 스테인드 샘플을 선택합니다. 워크 시트에서 "다각형 디자인 도구"를 클릭하고 FSC / SSC 플롯에서 비드 인구에 게이트를 설계합니다. 스펙트럼 또는 도트 플롯을 열 게이트의 상단을 두 번 클릭딸 플롯의 게이트 구슬을 시각화합니다.
- 정극에 대한 하나 개의 게이트 및 스펙트럼 또는 도트 플롯상의 어느 음극 비드 하나의 게이트 디자인. 각각의 양 및 음의 부분에 대한 두 세트의 레이저에 대응하는 전체의 스펙트럼을 확인하고 연속적 게이팅 및 도터 인구를 확인하는 게이트 클릭하여 특이점을 제거한다. 은 "Unmixing"창에서 부정과 긍정적 인 게이트를 입력합니다.
- 각 단일 스테인드 샘플 단계를 반복 5.2.
참고 :이 모든 샘플에 위치하는 프로그램이 수 있지만, 양극과 음극 게이팅 전략 분석되고있는 샘플에 해당하는주의하십시오. 대신, 각각의 단일 염색 표본 부정적인 부분을 결정하는, 보편적 제외를 설정할 흠 비드 샘플을 사용한다.
- 은 "튜브 목록"및 autofluorescent을위한 디자인 게이트 및 비 autofluorescent 세포의 흠없는 세포 샘플을 선택합니다. <자동 형광 및 생존 능력을 포함한 모든 매개 변수에 대한 모든 부정과 긍정적 인 게이트가의 "Unmixing"창에서 선택하면 리>에 '계산'버튼을 눌러주십시오. 샘플에 unmixing을 적용하는 분석한다.
- 게이트 설계와 두 파라미터의 플롯을 작성하여 데이터를 분석한다.
- 먼저, FSC 대 SSC하는 게이트를 설계하고 생존 마커 (CD45 대 PI)로 표시된 모든 셀을 제외한 죽은 세포를 제거한다. 전지의 나머지 부분에서, 각각의 세포 현탁액에 기재된 전략에 따라 관심있는 모든 집단 디자인 게이트 (도 1-3).
참고 : 필요한 경우에 보상 조정 "기준 스펙트럼 조정을." 이 알고리즘이 완벽하게 할 수없는 경우 각 형광 색소의 양 인구의 중간을 다시 조정하는 unmixing 후 사용할 수있는 도구입니다.
- 먼저, FSC 대 SSC하는 게이트를 설계하고 생존 마커 (CD45 대 PI)로 표시된 모든 셀을 제외한 죽은 세포를 제거한다. 전지의 나머지 부분에서, 각각의 세포 현탁액에 기재된 전략에 따라 관심있는 모든 집단 디자인 게이트 (도 1-3).
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Representative Results
21 파라미터 비장 세포를 분석 스펙트럼 FCM 패널
CD45 모든 조혈 유핵 세포를 라벨 동안도 1, T, B, NK 수지상 및 골수 세포의 서브 세트를 인식하는 다른 항체를 포함하는 비장 세포에 적용되는 19 형광 항체 패널로 얻은 결과를 나타낸다. 패널은 또한 생존 염료 (PI)뿐만 아니라 크기 (FSC)와 단위 (SSC) 파라미터를 포함한다. 도 1a는 기준 형광 색소의 스펙트럼을 나타낸다. CD45 + 게이트 (도 1b)에서 죽은 세포의 제거 후, 분석은 CD3 + T 세포가 TCRβ 쇄를 발현 및 CD4 T 세포의 CD25 + 세포의 예상 CD4 / CD8 분포 비율을 보여준다. CD8 T 세포는 CD44- 및 Ly49D 발현 세포의 정규 분포를 보여줍니다. CD19 + B 세포 공동 표현 B220기로성숙한 비장 B 세포의 전형적인 D MHCII뿐만 아니라 및 IgM의 IgD의. NK1.1 + NK 세포의 서브 세트 Ly49D 표현 공동 비장 림프구의 작은 서브 세트를 나타낸다. 남은 세포는 CD11b +도 있었다 일부 MHC II, 높은 수준의 CD11c + 수지상 세포의 작은 서브 세트를 포함한다. 조직 특성 상주 식세포 공동 익스프레스는 CD11b 및 비장에서 발견되는 CD44의 가장 높은 레벨은 F4 / 80 + 세포. 나머지 세포 (CD19 - Nk1.1 - CD3 - F4 / 80 - 중 CD11c은 -) 이중 양성 세포의 작은 서브 세트가 또한 가능성이 조상에 대응 CD44 높은 수준의 발현과 CD11b GR1,의 식에 의해 분할 될 수있다 비장 낮은 주파수에서 존재하는 것으로 알려져. 큰 분획은 세 마커 부정적이었다. 도 2는 보상 조정은 동일한 분석을 나타낸다.
그림 1 : 쥐 비장 세포의 분석을 위해 19 색 항체 패널. (A) 마우스 비장 세포는 이전 항체 조합으로 염색되는 CD45는 진화는-655을 첨가 하였다. 모든 형광 색소의 기준 스펙트럼을 나타낸다. 형광 표지 된 CD45은 적색 화살표로 표시된다. 형광 색소는 등고선 플롯은, T, NK, 수지상 또는 골수 세포를 B의 다른 집단을 분리하기 위해 다중 파라미터 분석 차별 능력을 보여주는 표 1 (B)에 표시된다. 분석은 디컨 볼 루션을 unmixing 후 기존의 FCM 소프트웨어에서 이루어졌다.
그림 2 : 쥐 비장 세포의 분석을 위해 19 색 항체 패널. 그림 1과 같은 분석은 adjus 전에 이루어졌다기준 스펙트럼 조정기와 보상 tment.
소장 내 상피 림프구
몇몇 T 세포 개체군은 상피 세포 층 (5, 6) 내의 부위에서 발견된다. 이러한 종래의 서브 세트의 분리는 상피 세포 림프구를 분리하는 밀도 구배를 포함한다. 그러나, 이러한 준비는 섬세하고, 많은 시간이 소요 및 셀 손실이 발생합니다. 정량을 향상시키고 실험 절차를 용이하게하기 위해, 상피 세포의 많은 부분에서 장 림프구 집단을 구별하는 스펙트럼 FCM의 전위를 시험 하였다. 상피 조직의 기계적 중단 한 후, 세포 현탁액은 일반적으로 장내 상피 세포에있는 T 세포를 αβ의 하위 집합을 라벨 및 γδ 항체로 염색 하였다. 그만큼세포는 두 종래 세포 계측기 및 스펙트럼 FCM으로 분석 하였다.
도 3은 PI 음성 세포를 게이팅 사균의 제거와 유사한 게이팅 전략을 수행 한 후 그 결과를 나타낸다. 자동 형광 관리자는 살아있는 세포의 불량 판정 결과 (상부 패널, 적색 화살표)를 불 활성화 될 때 자동 - 형광 세포의 존재는 종래의 모든 세포 계측기 및 분광 계측법에서 명백하다. 모든 플롯에서, FSC-A / SSC-A 림프구 게이트 내의 세포를 빨간색으로 표시되어 큰 산란 (상피 세포 게이트) 푸른 세포에 나타낸다. 모두 기존의 장비는 나머지 세포 (파란색)이 CD3 + T 세포의 부분 집합 (청록색 화살표)를 해결할 수 없습니다. 따라서, TCRβ - 세포 (녹색 화살표)가 CD3 + TcRγδ 오염 - 인구의 separati 감지되지 않을 생물학적으로 불가능한 부분 집합상피 세포에서 림프구에. 대조적으로, 스펙트럼 FCM에 자동 형광 관리 한 후, 다른 T 세포 서브 세트의 분석은 상피 세포의 존재에 의해 손상되지 않은, 인구는 잘 분리하고, CD3 +에는 TCR - 음성 세포가 없었다 문.
그림 3 : 자동 형광 세포의 존재는 스펙트럼 FCM에서 인트라 상피 림프구의 탐지를 손상하지 않습니다. 상피 세포 및 림프구를 포함 소장 세포, TcRδ, PI, TCRβ Cy7-APC CD3 (패널 B), Vγ7 APC, Vδ4 Cy7-PE (패널 C), 및 CD8 FITC (패널 D)를 인식하는 항체로 염색 하였다. PI는 분석 전에 FACS 완충액에 첨가 하였다. 데이터의 포착은 적절한 품질 관리 후에 3 개 기기에 순차적으로 수행 하였다. 이중선은 elimina했다FSC-H / 테드 FSC-W. 분석은 기존의 FCM 소프트웨어에서 이루어졌다. 플롯은 게이팅 전략의 여러 단계를 보여줍니다. 장 상피 세포 게이트 내의 세포를 빨간색으로 표시되어있는 동안 FSC-A / SSC-A 림프구 게이트 내의 세포를 청색으로 분류된다. 화살표는 서로 다른 인구 왜곡 및 자동 형광을 가리 킵니다. D는 형광도 관리와 unmixing 후 동일한 데이터를 표시하는 반면, 플롯 C는 unmixing에서 자기 형광 스펙트럼 관리없이 FCM에서 획득 된 데이터의 분석을 나타낸다.
배아 심장
종래 FCM은 조혈 세포를 마킹는 CD45 및 덤프 TER119 채널 (PE)의 형광을하기 때문에 분석에서 제외 하였다 자동 형광 세포 (검은 화살표)의 큰 모집단을 보여 주었다. 대조적으로,이 자동 형광 인구 스펙트럼 FCM에 같은 본되지 않았고 CD45에 포함시켰다
그림 4 : E17.5 심장의 세포 현탁액에 자동 형광 세포가 제대로 스펙트럼 FCM의 부정적인 세포 분획에 포함되어 있습니다. (A)에서 하트 태아 세포 현탁액을 항 TER119 및 CD45-PE, 무서 -1- PECy5 및 CD31-APC 세 기기에서 취득한 항체 순차적으로 염색 하였다. 검은 색 화살표는 두 금연실, 자동 형광 세포를 보여ntional 세포 계측기, 이들 세포 계측법 스펙트럼 자동 형광으로 검출되지 않고, 따라서 특정 형광 염색에 대해 분석 할 수있다. (B) (녹색 타원형 게이트 내에서) 자동 형광 세포 아니라 CD31 + 세포 (파란색, 음성 대조군 직사각형 게이트), 심장 트로포 닌의 발현 (TNNT2) 7 심방 경쇄 -2 (MYL7)을 보였다 8 성적 증명서. AU - GAPDH 집 지키는 사본을 임의 단위의 상대적인 위치를 설정합니다. 데이터는 ± SEM으로서 평균값을 제시 하였다.
| 여기 레이저 | 형광 색소 | 특성 | 복제 | |
| 488 nm의 | BB515 | CD8 | 53-6.7 | |
| 488 nm의 FITC | Ly49D | 4E5 | ||
| 488 nm의 | 체육 | F4 / 80 | 6F12 | |
| 488 nm의 | PE-CF594 | NK1.1 | PK136 | |
| 488 nm의 | PE-Cy5에 | CD44 | IM7 | |
| 488 nm의 | PE-Cy7 | CD11b를 | M1 / 70 | |
| 488 nm의 | 를 PerCP-Cy5.5 | IgM의 | R6-60.2 | |
| 488 nm의 | 를 PerCP | GR-1 | RB6-8CS | |
| 488 nm의 | AF532 | CD3 | 17A2 | |
| 488 nm의 | 프로피 디움 요오드 | 생존 능력 | ||
| 405 nm의 | V450 | IgD의 | 11-26c.2a | 405 nm의 | BV421 | 중 CD11c | HL3 |
| 405 nm의 | BV510 | CD19 | 1D3 | |
| 405 nm의 | BV570 | TCRb | H57-597 | |
| 405 nm의 | BV605 | CD4 | RM4-5 | |
| 405 nm의 | BV650 | CD45R / B220 | RA3-6B2 | |
| 405 nm의 | BV711 | IA / IE | M5 / 114 | |
| 405 nm의 | BV786 | CD25 | PC61 | |
| 405 nm의 | 655 진화 | CD45 | 30 F11 | |
| N / A | 정제 | CD16 / CD32 | 2.4G2 | FC 수용체 블록 |
| 항체의 목록 CARDI에 사용AC 세포 현탁액 | ||||
| 638 nm의 | 알렉사 플 루어 647 | CD31 | MEC13.3 | |
| 488 nm의 | 체육 | CD45 | 30 F11 | |
| 488 nm의 | PE-Cy5에 | 무서-1 | D7 | |
| 488 nm의 | 체육 | Ter119 | TER-119 | |
표 1 : 19 컬러 패널과 심장 세포 현탁액에 사용되는 항체의 목록.
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Discussion
종래 FCM은 형광 물질의 여기 광을 방출 광자의 검출에 기초한다. 다른 형광 색소로부터의 신호를 측정하기위한 검출기에서 검출 한 형광 색소의 형광 방출은 물리적 오버랩을 유발한다. 방출 스펙트럼 사이에서이 파급은 보상에 의해 수정 될 필요가있다.
unmixing의 디콘 볼 루션 알고리즘 FCM 스펙트럼 데이터 처리는 다른 스펙트럼 형상을 갖는 것을 제공하는 추가의 보정없이 가까운 발광 피크와 형광 색소의 결합을 허용한다. 분석을 위해 사용되는 알고리즘은 견고한 조직 세포 현탁액에서 비특이적 형광 감산 독립 변수로 자동 형광을 취급한다.
형광 색소 (19)의 패널은 두 개의 레이저 (488 nm 내지 405 nm 인)를 사용하여 면역 세포를 분석하여 조립 하였다. 638 nm의 레이저에있을 때 실제로, 32 채널의 PMT 섹션 대응이 레이저의 여기 파장에 사용할 수 없습니다. PMT를 최대 탐지 능력을 얻으려면 적색 레이저가 꺼져 있었다. 마우스 비장 세포는 조혈 세포의 1 % 미만을 구성하는 일부의 12 개 이상의 서로 다른 세포 집단의 검출을 허용 분석 하였다.
자동 형광 스펙트럼을 관리하는 FCM의 능력을 테스트하기 위해 분석을 손상시킬 수있는 두 가지 상황을 시험 하였다 : 림프구는 상피 세포에 오염 된 하나, 자동 형광 심장 세포를 분석 하였다 하나. 기존의 FCM과는 대조적으로, 스펙트럼 세포 계측법은 작은 부분 집합을 나타냅니다 경우에도, 모든 림프구 아형의 차별을 허용합니다.
성인 심근 9, 10의 재생 능력 주변의 논쟁, 11 인해 창피하기위한 전략의 부재로 일부입니다죄를 지우다과 마음에 가능한 세포의 별개의 부분 집합을 격리 할 것. 상이한 심장 부분 집합을 구별하는 마커의 독특한 조합을 정의하는 다중 파라미터 분석은 분석 될 수 있기 때문에 셀의 다수의 서브 세트 드문의 검출을 가능하게 할 수 있습니다. 태아 하트 (E17.5)를 분석하고, 종래의 FCM에 감지되지했을 자동 형광 세포의 많은 부분이 스펙트럼 FCM에서 비 조혈 가능한 심장 세포 구획에 통합 하였다.
이 방법의 재발 문제는 양질의 형광 표지 된 항체에 대한 요구 사항입니다. 직렬의 성분이 지배적 인 경우, 직렬 염료를 사용하는 경우에 특히 중요하다. 예를 들어, BV786 및 Cy7-PE 각각 BV421 PE와 구분하기 어려울 수있다.
분석법에 기초하여 FCM은 보상 m에 대한 필요없이, 종래의 FCM에 의한 것보다 더 높은 분석력 제공atrices. 이 원고는 높은 분석 능력, 복잡한 보상 행렬의 부재로 인해 자동 형광으로 세포 하위 집합의 손상되지 않은 차별, 여전히 질량 분석 FCM에 필요한 추가 재정 투입을 보여주는 또 다른 방법이 있다는 증거를 제공합니다. 스펙트럼 FCM 따라서 종래 일반적으로 FCM 의무가 종양 발달에 사용될 수없는 고체 다양한 조직으로부터 얻어진 세포의 분석을 위해 선택하는 방법, 그리고 세포 생물학, 줄기 보인다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 또한 비판적으로 원고를 수정 K. 타무라의 스펙트럼 세포 계측법의 기술적, 이론적 기여를 인정합니다. 우리는 C. AIT-만수르, P.-H.에도 빚 비판적 원고를 읽기위한 끝없는 기술 자문 및 지원을위한 Commere, A. Bandeira, 그리고 P. 페레이라. 우리는 또한 안티 Vγ7-APC와 Vδ4 - 비오틴 표지 항체의 선물 P 페레이라합니다. 우리는 환영하고 촬영 물류를 지원하는 파스퇴르 연구소 센터 디부 Enseignements을 aknowledge. 이 작품은 파스퇴르 연구소, 연구소 국립 드 라 상테 등 드 라 공들인 MEDICALE (INSERM)에 의해 지원되었다; 스위스 국립 과학 재단 (National Science Foundation)과 파스퇴르 증권 거래소 루 (SS); Fundação 파라 Ciência의 개 TECNOLOGIA - SFRH / BD / 2,010분의 74,218 (MV); 및 대학 파리 디드로의 회사 직원 국립 드 라 공들인 (ANR) 프로젝트 Twothyme의 ANR 및 프로그램은 (미래를위한 투자를 REVIVE) (AC).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mice | Janvier Labs | CD45.2 | Source of cells |
| Ethanol 70% | VWR | 83801.36 | Sterilization |
| DPBS (Ca2+, Mg2+) | GIBCO ThermoFisher | 14040-174 | Embryos collection |
| Hanks' Balanced Salt Solution (+Ca2+ +Mg2+) (HBSS+/+) | GIBCO Life ThermoFisher | 14025092 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Hanks' Balanced Salt Solution (-Ca2+, -Mg2+) (HBSS-/-) | GIBCO Life ThermoFisher | 14175095 | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Fetal calf serum (FCS) | EUROBIO | CVFSVF00-0U | Dissociation, digestion and staining solutions |
| Collagenase | Sigma | C2139 | Enzymatic solution |
| 90 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T93100 | Embryos and hearts collection |
| 35 x 15 mm, plastic tissue culture Petri dishes. |
TPP | T9340 | Hearts collection |
| Fine iris scissor | Fine Science Tools | 14090-09 | Dissection tools |
| Gross forceps (narrow pattern forceps, curved 12 cm) | Fine Science Tools | 11003-12 | Dissection tools |
| Fine forceps (Dumont no. 7 forceps) | Fine Science Tools | 11272-30 | Dissection tools |
| Scalpel | VWR | 21909-668 | Dissection tools |
| LEICA MZ6 Dissection microscope | LEICA | MZ6 10445111 | Sampling; Occular W-Pl10x/23 |
| Cold lamp source | SCHOTT VWR | KL1500 compact | Sampling; Two goose neck fibers adapted |
| FACS tubes | VWR | 60819-310 | Digesting cells |
| 96 well plate (round bottom) | VWR | 10861-564 | Staining cells |
| Nylon mesh bolting cloth sterilized, 50/50 mm pieces. |
SEFAR NITEX | SEFAR NITEX | Cell filtration |
| UltrasComp eBeads | |||
| Fluorescence labeled antibodies | Biolegend | Catalogue number see table below | Staining cells |
References
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