Summary
تصف هذه الدراسة العمليات الجراحية والتقنيات التجريبية لإجراء قياس المثانة مستيقظا في الماوس تتحرك بحرية. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر أدلة تجريبية لدعم الأمثل لها والتوحيد القياسي.
Abstract
استيقظ ملء سيستوميتري استخدمت لفترة طويلة لتقييم وظيفة المثانة في الفئران تتحرك بحرية، ومع ذلك، فإن الطرق المحددة المستخدمة، تختلف بين المختبرات. وكان الهدف من هذه الدراسة لوصف الإجراء المجهري المستخدمة لزرع أنبوب إنترافسيكال وتقنية تجريبية لتسجيل ضغط المثانة البولية في مستيقظا، الماوس تتحرك بحرية. وبالإضافة إلى ذلك، يتم تقديم البيانات التجريبية لإظهار كيف الجراحة، وكذلك نوع أنبوب وحجم، تؤثر على انخفاض وظيفة المسالك البولية وتسجيل حساسية. تم تقييم تأثير قطر الأنبوب على تسجيل الضغط في كل من أنابيب البولي إيثيلين والبولي يوريثان بأقطار داخلية مختلفة. وفي وقت لاحق، تم زرع أفضل أداء أنبوب من كل من المواد جراحيا في قبة المثانة البولية من الذكور C57BL / 6 الفئران. اثنا عشر ساعة، تم تسجيل تردد التبول بين عشية وضحاها في الحيوانات سليمة سليمة والحيوانات 2 و 3 و 5 و 7 أيام بعد الجراحة. في الحصاد، المثانة ثتم تقييمها للحصول على علامات تورم باستخدام الملاحظة الإجمالية، وبعد ذلك تم معالجتها لتحليل المرضية. وقد لوحظ أكبر قدر من تورم المثانة في اليوم 2 و 3، التي ترتبط مع السلوك يفرغ البيانات تظهر بشكل ملحوظ ضعف وظيفة المثانة. بحلول يوم 5، الأنسجة المثانة و يفرغ تردد قد تطبيع. استنادا إلى الأدب والأدلة التي قدمتها دراساتنا، نقترح الخطوات التالية لتسجيل في الجسم الحي من الضغط إنترافسيكال وحجم فوايد في الماوس مستيقظا: 1) إجراء الجراحة باستخدام المجهر التشغيل وأدوات المجهرية، 2) استخدام البولي ايثيلين -10 أنابيب لتقليل التحف الحركة، و 3) إجراء قياس المثانة في يوم ما بعد الجراحة 5، عندما يحل المثانة تورم.
Introduction
ملء قياس المثانة (فك) هو الأسلوب التشخيصي الذي ينطوي على وضع القسطرة في المثانة البولية لتسجيل الضغط أثناء ملء المثانة بطيئة. لأول مرة في عام 1927 كطريقة التشخيص السريرية لتقييم انخفاض وظيفة المسالك البولية، فقد ظلت تستخدم على نطاق واسع. 1 في تطبيقات البحوث، فك يمكن استخدامها لاختبار وظيفة المثانة في نماذج حيوانية صحية ومريضة ودراسة آثار وكلاء الدوائية. وتستخدم النماذج الحيوانية القوارض عادة للتحقيق في انخفاض وظيفة المسالك البولية. 2 في هذه المجموعة من الثدييات، تم تطوير فك لأول مرة لاستخدامها في الفئران. 3 هنا، المنهجية لزرع أنبوب في المثانة البولية وأداء فك وقد وصفت جيدا واستخدامها من قبل العديد من الباحثين مع مستوى مقبول من استنساخه. 4 توافر السلالات المعدلة وراثيا وضرب بها تجعل الفئران أنواعا قيمة لمجالات البحث العديدة،بما في ذلك مجال انخفاض ضعف المسالك البولية. تختلف المنهجية المستخدمة لأداء قياس المثانة الماوس بشكل ملحوظ بين المختبرات، مما يجعل من الصعب مقارنة النتائج. 5
بالمقارنة مع نماذج الجسم الحي السابقين ، فك يحافظ على أقل التشريح المسالك البولية، والسماح وظيفة منسقة بين المثانة ومخرجها خلال مراحل التخزين وفراغ دورة التبول ليتم تقييمها. وتظهر الأبحاث السابقة أن العديد من التخدير شائعة الاستخدام قمع انكماش التبول. وكلاء التي تحافظ على المثانة البول المثانة تقلص العضلات الملساء (يوريثان، α- كلورالوز والكيتامين وزيلازين)، مما يسمح للحيوان ل ميكتورات، لا يزال يقلل بشكل كبير من قدرة المثانة وظيفية وقمع العصبي. 6 ، 7 ، 8 ، 9 على الرغم من أن من الناحية الفنية أكثر تحديا، فك أداء في أوأك الحيوانات الإسعاف يحافظ على سلامة وظيفية من منعكس التبول.
انخفاض وظيفة المسالك البولية يتأثر بعوامل متعددة، بما في ذلك ما بعد الجراحة تورم جدار المثانة، والإجهاد بسبب الألم وعدم الراحة، والتأثيرات البيئية. باستخدام تقنية الجراحية التي تقلل من تلف الأنسجة أثناء زرع أنبوب وتسجيل الأساليب التي تقلل من حركة الأنبوب، في حين يسمح في وقت واحد الحيوان إلى أمبولات بحرية، ضرورية للحصول على تسجيلات دقيقة وقابلة للتكرار.
إذا أجريت بشكل كاف، في الجسم الحي فك في الحيوانات تتحرك بحرية يمكن أن توفر البيانات التي تعكس بشكل موثوق وظيفة المثانة الفسيولوجية. 10 فك في الحيوانات تتحرك بحرية يمكن أن توفر بيانات عن المعلمات التالية؛ الضغط القاعدي أو الأساسي: الحد الأدنى من الضغط بين اثنين من التبول. ضغط إنتيركتيتوريتيون: متوسط الضغط بين اثنين من التبول. عتبة الضغط: الضغط داخل الرحم إمإدياتيلي قبل التبول. أقصى ضغط: أقصى ضغط المثانة خلال دورة التبول. النشاط العفوي (أو يعني إنتيرميكتوريتيون الضغط التذبذبي): ضغط إنترميكتوريتيون ناقص الضغط القاعدي. عدم انكماش التفریغ: زیادة الضغط الداخلي داخل مرحلة التعبئة، غیر المرتبطة بإطلاق السوائل. المثانة الامتثال: قدرة المثانة مقسوما على ضغط عتبة ناقص الضغط القاعدي. تردد التبول: عدد من التبول لكل وحدة من الزمن. إنتيرميكتوريتيون الفاصل الزمني: الفترة بين اثنين أقصى ضغط يفرغ. قدرة المثانة: حجم مرتب مقسوما على عدد من التبول. وقد سبق نشر وصف مفصل لهذه البارامترات والمصطلحات الموحدة. 11
فك يمكن أن يؤديها باستخدام مستمر أو دورة واحدة طريقة التسريب إنترافسيكال. يسمح قياس المثانة المستمر لتسجيل دورات التبول متعددة واختيار البيانات التمثيلية القائمةعلى استنساخه. دقتها في قياس قدرة المثانة محدودة بسبب حجم المتبقية غير معروف. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه من الصعب جمع أحجام صغيرة باطلة (التي تقوم على سلالة والجنس تختلف بين 30 و 184 ميكرولتر) في الفئران الإسعاف بحرية. باستخدام هذه الطريقة لتسجيل حجم باطلة هو أقل دقة مقارنة مع إعداد تخدير، لكنه متفوق في أنه يتجنب الآثار القمعية من التخدير على وظيفة المثانة. وينبغي استخدام قياس المثانة دورة واحدة لتقييم قدرة المثانة. في هذه الطريقة، يتم إفراغ المثانة عن طريق الطموح قبل التسريب ويتم حساب القدرة كدالة لمعدل ضخ مضروبا في الوقت إلى أقصى قدر من الضغط.
على الرغم من أن تقنية أداء قياس المثانة في القوارض الصغيرة قد نشرت، ووصف الجراحة التي أجريت في الفئران وأوصت أن يتم إجراء قياس المثانة الماوس تحت التخدير يوريتان. 10 الهدف من هذا التواصل هو to وصف كل من التقنيات المجهرية المستخدمة لزرع أنبوب إنترافسيكال في قبة المثانة البولية والتجريبية انشاء تستخدم لتسجيل وظيفة المسالك البولية السفلى، في الجسم الحي ، أثناء ملء المثانة المستمر و ميكتوريتيون في الماوس مستيقظا تتحرك بحرية. وبالإضافة إلى ذلك، أجريت تجارب لمعالجة كيفية طول الأنابيب، قطر، والمواد، فضلا عن منهجية لأداء في الجسم الحي فك، تؤثر على التسجيل. هذا البروتوكول التجريبي يلخص التقنيات المنشورة سابقا ويقترح عددا من التعديلات على أساس النتائج التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم إيواء الحيوانات في منشأة رعاية الحيوان بجامعة فيرمونت وفقا للمبادئ التوجيهية المؤسسية. أجريت جميع التجارب على الحيوانات بها وفقا للمعاهد الوطنية للصحة دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية.
1. إنترافسيكال أنبوب زرع
- إعداد أنابيب وأدوات لإجراء العمليات الجراحية
- قطع قطعة 7 سم من أنابيب PE10 لجعل القسطرة للزرع.
- إنشاء مضيئة في نهاية واحدة من أنبوب PE10 عن طريق التقدم ببطء نهاية نحو لهب مفتوح.
ملاحظة: سحب أنبوب بسرعة بمجرد تطور مضيئة. - تطبيق ثلاث قطرات من الغراء الساخن لجميع الأغراض، وذلك باستخدام الإعداد الحرارة المنخفضة على بندقية الغراء، في 4.5، 5، و 5.5 سم من نهاية اندلعت على الخارج من أنبوب PE10. هذه سوف تساعد على تأمين الأنبوب في ظهر الحيوان. ( الشكل 1 )
- تعقيم الأنابيب عن طريق تمرغ في 70٪الإيثانول ومن ثم تدفق مع معقمة 0.9٪ كلوريد الصوديوم قبل الاستخدام. ترك أنبوب مليئة لتجنب إدخال فقاعات الهواء في النظام.
- إنشاء قابس 30 قياس لإغلاق نهاية القسطرة PE10 عن طريق فصل إبرة قياس 30 من المحور عن طريق التلاعب يدويا في الطرف الداني جنبا إلى جنب. تطبيق قطرة من الغراء الساخن إلى النهاية. تأكد من أن الختم مقاوم للماء. ( الشكل 2 )
- استخدام الأدوات المجهرية التالية: اثنين من أزواج من دومون # 7 منحنية ميكروفورسيبس، واثنين من أزواج من دومونت # 5 منحنية ميكروفورسيبس، إبرة 21 G، متناهية الصغر مرقئ مستقيم، مقص الصغيرة، مقص صغير تشريح، وحامل إبرة الصغيرة.
- تعقيم جميع الصكوك قبل بدء الإجراء.
- إعداد الحيوان
- بعد تخدير الحيوان، ويحلق النصف السفلي من البطن أولا، ثم تتحول عرضة للحيوان ويحلق وتنظيف المنطقة على الجزء العلوي الخلفي مع الكحول 70٪ تليها بيتادين. تطبيق طبيب بيطري مرهم للعيون لمنع جفاف. بعد ذلك، استخدم زوج من مقص مستقيم، حادة وزوج من الميكروفوربس منحنية دومون # 7 لجعل شق الجلد طويلة 1.5 سم بين كتف ووضع مستلق الحيوان على رأس وسادة التدفئة (37 درجة مئوية) مغطاة الستائر معقمة.
- وأخيرا، وتنظيف البطن مع الكحول وبيتادين.
- الإجراء الجراحي
ملاحظة: تنفيذ جميع الإجراءات الجراحية تحت المجهر التشغيل مع التكبير تتراوح من 3.15X إلى 20X. بعد وضع الحيوان على الستائر المعقمة، وضعت على قفازات معقمة. الاستمرار في استخدام الإجراءات المعقمة في جميع أنحاء الجراحة برمتها.- وضع الحيوان في مربع تحريض وتخدير باستخدام 2٪ استنشاق إيسوفلوران مع الناقل الأكسجين (1 لتر / دقيقة). الحفاظ على التخدير في جميع أنحاء الإجراء عن طريق وضع رأس الحيوان في مخروط الأنف واستخدام 2٪ إيسوفلوران استنشاق مع الناقل الأكسجين (1 لتر / دقيقة). تبدأ الجراحة بعد تلقي نيغاستجابة أتييف من أخمص القدمين قرصة الاختبار.
- استخدام زوج من مستقيم، مقص حادة وزوج من دومونت # 7 منحنية ميكروفورسيبس لجعل أقل 1.5 سم، خط الوسط شق البطن من خلال الجلد. في وقت لاحق، وخلق شق مطابقة من خلال اللفافة على طول ألبا لينيا والعضلات لفضح القبة والنصف العلوي من المثانة البولية. تجنب إصابة المثانة عن طريق تطبيق الجر التصاعدي إلى كل طبقة الأنسجة باستخدام زوج من دومونت # 7 منحنية ميكروفورسيبس. الحفاظ على أحشاء البطن من الجفاف عن طريق إضافة قطرات من المالحة الفسيولوجية الدافئة.
- تدوير الحيوان على جانبها للوصول إلى شق على مؤخر العنق. دفع مرقئ ضيق تحت الجلد على الرغم من شق. قناة تحت الجلد يجب أن تبدأ على ظهره، والاستمرار على طول الجانب.
- مرة واحدة غيض من الصك تصل إلى الجزء السفلي من القفص الصدري، وتحويل طرف نحو خط الوسط وداخل البطن (سيكون هناك البوب طفيف عند ثقب عضلات جدار البطن). مواصلة النهوض مرقئ حتى يتعرض الطرف في شق البطن تحت طبقة العضلات. ( الشكل 3 )
- فهم "غير المشتعلة" نهاية الأنبوب مع مرقئ وتراجع ببطء الأداة، وسحب نهاية الأنبوب من خلال شق في الجزء الخلفي من الرقبة. ضبط نهاية المشتعلة من الأنابيب بحيث تقع مباشرة فوق قبة المثانة.
- جعل ربطة عنق فضفاضة من 6-0 حيدة خياطة (غير قابلة للامتصاص) ووضعه على رأس قبة المثانة. هذا التعادل سيتم استخدامها في وقت لاحق لتأمين أنبوب في المثانة.
- وضع لفة صغيرة من الأنسجة الخالية من الوبر في البطن وراء المثانة للمساعدة في تحقيق الاستقرار ورفعه.
- إعداد لإدراج نهاية اندلعت من القسطرة PE10 في المثانة.
- في اليد غير المهيمنة، عقد قبة المثانة مع ميكروفورسيبس منحنية دومون # 7 والحفاظ على هذه قبضة حتى يتم وضع القسطرة في المثانة.
- استخدام إبرة قياس 21o جعل بضع المثانة في قمة القبة. التحقيق بلطف بضع المثانة مع زوج مغلق من # 5 منحنية ميكروفورسيبس للتأكد من أن القسطرة يمكن أن تمر بسهولة من خلال ثقب.
- في حين لا تزال تحتجز قبة المثانة في اليد غير المهيمنة، ووضع نهاية اندلعت من القسطرة PE10 في المثانة (دفع مضيئة وصولا الى الرقبة المثانة بحيث لا ينزلق في حين تأمين ذلك).
- ربط خياطة حيدة 6-0 حول قبة المثانة وأنابيب مع التعادل وضعت الأمامي إلى الأنابيب. تأكد من ربط خياطة على ارتفاع يصل على المثانة ممكن لتجنب خفض مصطنع قدرة المثانة. ( الشكل 4 )
- بدلا من ذلك، تأمين القسطرة باستخدام خياطة سلسلة محفظة على النحو التالي. جعل فضفاضة محفظة خياطة سلسلة على قبة المثانة باستخدام 6-0 حيدة. اتبع الخطوات 1.3.8.1 - 1.3.8.3 لأداء بضع المثانة وإدخال القسطرة. تأمين الأنبوب عن طريق ربط خياطة سلسلة محفظة. ( الشكل 5 )
- اختبار المباح وختم الأنبوب في المثانة عن طريق ربط حقنة الأنسولين 0.5 مل مع إبرة 30 قياس إلى نهاية البعيدة من الأنبوب. ملء ببطء المثانة مع 0.1 - 0.2 مل من 0.9٪ كلوريد الصوديوم حتى يظهر قطرة في فتحة مجرى البول، ثم إفراغ المثانة عن طريق الشفط. من المهم أن يتم ملء المثانة وتفريغها.
- إذا لم تحدث أي تسرب في القبة، واستعد المثانة مع زوج من ميكروفورسيبس منحنية وسحب بلطف على الأنابيب حتى مضيئة يستريح ضد داخل قبة المثانة.
- قبل الإغلاق، وإزالة لفة صغيرة من الأنسجة، وتأكد من أن المثانة هي في وضعها الطبيعي.
- إغلاق جدار البطن في طبقتين (العضلات والجلد) مع 6-0 تشغيل خياطة. فمن الأفضل لتقريب العضلات المستقيمة البطنية عن طريق خياطة فقط حواف الأمامي اللفافة البطن (الجدار الأمامي من غمد المستقيمة).
- لتأمين الأنابيب في الحيوانات مرة أخرى، رو بلطفتاتي الحيوان على بطنه. إدراج الجزء تحت الجلد من مرساة معدنية في شق بين الحواجب. ( الشكل 12 ) استخدام خياطة 6-0 لتأمين أنبوب ومرساة عن طريق تطويق لهم خياطة فراش العمودي.
- تأكد من وجود فقاعة الغراء فوق وتحت الجلد لمنع أنبوب من الانسحاب. قطع الأنبوب حوالي 2 سم فوق الجلد.
- إدراج بلطف المكونات 30 قياس (الخطوة 1.1.5) في نهاية الأنبوب لمنع تسرب البول خارج.
- حقن 0.5 مل 0.9٪ كلوريد الصوديوم تحت الجلد لترطيب. إعطاء تسكين بعد الجراحة مباشرة بعد الجراحة والحفاظ على لمدة 48 ساعة.
- وضع الحيوان مرة أخرى في قفصه تقع تحت مصباح الأشعة تحت الحمراء. الحفاظ على الملاحظة المستمرة حتى يتحرك الحيوان حول القفص بحرية.
- مراقبة الحيوان يوميا والسماح لها لاستعادة لمدة 5 أيام قبل التسجيل.
2. مستيقظ الكيستسجيل القياسات
- إعداد برنامج التسجيل، محول الضغط، ومضخة التسريب.
- قبل تخدير الحيوان، وربط ضخ مضخة، محول الضغط، و 22 G قطب باستخدام أنابيب PE50. ( الشكل 6 )
- افتح برنامج التسجيل (انظر جدول المواد على سبيل المثال)، على جهاز كمبيوتر لمعايرة ضغط النظام والاستعداد للتسجيل. تأكد من استخدام نفس اإلعدادات أثناء املعايرة والتسجيل.
- ملء حقنة 20 مل مع 10 - 15 مل من درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتحميلها في مضخة التسريب. برنامج مضخة لبث بمعدل 0.6 مل / ساعة.
- تأمين محول الضغط في نفس الارتفاع مثانة الحيوان أو الجزء السفلي من قفص التسجيل.
- إرفاق قطب 22 قياس إلى نهاية محول الضغط (PE50 - أنابيب - محول الضغط إلى قطب)
ملاحظة: يتم استخدام قطب لمنع أنبوب من التواء أو كينكينغ أs يتحرك الحيوان. - دفع مضخة حقنة لطرد كلوريد الصوديوم 0.9٪ من خلال النظام. تأكد من إزالة جميع فقاعات الهواء قبل معايرة.
- مع تشغيل برنامج تسجيل، استخدم مسطرة لمعايرة الضغط (سم / H 2 O). حرك ببطء نهاية حبل PE50 من 0 إلى 30 سم. ضبط الصفر إذا لزم الأمر.
ملاحظة: يجب أن تكون علامة 0 سم في نفس ارتفاع الكلمة من قفص التسجيل ومحول الضغط.
- قم بتعليق قطب العيار 22 فوق مركز قفص التسجيل. تأكد من أن القفص السفلي يسمح البول لتسقط على جهاز جمع التوازن وضعه تحت القفص. ضبط ارتفاع الحبل بحيث الماوس يمكن التحرك بحرية حول القفص دون اجهاد أو تمتد الأنبوب. ( الشكل 7 )
- عند الانتهاء، تحقق للتأكد من النظام وأنابيب PE50 الخارجية مليئة 0.9٪ كلوريد الصوديوم وتمت إزالة جميع فقاعات الهواء.
- الإعداديةأراتيون من الحيوان للتسجيل
- تخدير الحيوان مع 2٪ استنشاق إيسوفلوران ووضعه على بطنه. إزالة المكونات 30 قياس وشرائح أنابيب PE10 (المثانة القسطرة) في نهاية الحبل PE50. استخدام الغراء الساخن لتشكيل ختم للماء.
- إيقاف التخدير ووضع الحيوان في تسجيل كاجويث أرضية موازية الأسلاك، والتي سوف تسمح البول لتسقط مباشرة على جهاز جمع وضعت على رأس التوازن التحليلي. ( الشكل 7 )
- بدء التسجيل مرة واحدة في الحيوان هو في القفص، ولكن لا تبدأ غرس. مراقبة الحيوان حتى يتعافى تماما من التخدير. بمجرد استقرار ضغط المثانة، تبدأ غرس 0.9٪ كلوريد الصوديوم بمعدل 0.6 مل / ساعة.
ملاحظة: قم بتدوين ملاحظة في برنامج التسجيل عند إجراء أي تغييرات. من المهم أن يكون لديك سجل عندما يبدأ التسريب، توقف، أو تحدث مخالفات. - تحقق من نظام للتسريبات والتأكد من أن الحيوان لديه سهولة الوصولإس إلى الغذاء والماء.
- مواصلة التسجيل في غرفة هادئة حتى يتم الحصول على ثلاث دورات التكاثر يمكن استنساخها.
ملاحظة: يجب أن يكون الحيوان دون عائق تماما في جميع أنحاء التسجيل. ويفضل استخدام مراقبة الفيديو عن بعد لمراقبة السلوك.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لم يكن هناك فرق معنوي بين مواد الأنبوب والأقطار في اتساق ارتفاع الضغط وتقع ضمن النظام أثناء انسداد الأنبوب. المثانة جدار تورم آخر زرع أنبوب إنترافسيكال كان كبيرا لكل من البولي ايثيلين (بي) ومواد البولي يوريثين (بو). في يوم 2، وتورم تحت المخاطية الشديد المتقدمة. احتلت نصف المقطع العرضي للمثانة، مما يؤدي إلى عرقلة التجويف. في يوم 5، وذمة حل تماما، وترك المناطق تحت المخاطية تسلل مع الخلايا الالتهابية التي غزت جزئيا العضلات. في يوم 7، تم تخفيض تسلل التهابات بشكل كبير وعاد الأنسجة الأنسجة المثانة إلى وضعها الطبيعي ( الشكل 8 ). أكبر قدر من تورم الأنسجة لوحظ في يوم 2 واليوم 3 ترتبط مع السلوك يفرغ البيانات تظهر بشكل ملحوظ ضعف وظيفة المثانة ( الشكل 9 ). تردد فواد تطبيعها بو ست-أوبيراتيف يوم 5.
يتميز الضغط إنترافسيكال في الماوس مستيقظا تتحرك بحرية (مع الحد الأدنى من التحف الحركة) من قبل الضغط الأساسي من 10-15 سم H 2 O، والتي قد تبقى دون تغيير أو زيادة تدريجية بنسبة لا تزيد عن 10 سم H 2 O خلال دورة التعبئة ، تليها زيادة مفاجئة، ضغط نابض ومن ثم إسقاط خلال يفرغ ( الشكلان 10 و 11 ).
الشكل 1: PE10 أنابيب لزرع في المثانة البولية. ( A ) قطعة 7 سم من PE10 أنابيب مع قطرات من الغراء الساخن في 4.5 و 5 و 5.5 سم من نهاية المشتعلة. ( B و C ) صورة مفصلة تبين نهاية اندلعت من أنبوب (المستخدمة لتأمين أنبوب في المثانة).إس / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "تارجيت =" _ بلانك "> الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التوصيل للجزء الخارجي من PE10 أنابيب المثانة. يتكون القابس من إبرة 30 G والغراء الساخن. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: دورة من أنابيب المثانة. رسم خط تخطيطي يوضح وضع الأنابيب من خلال البطن وطريقها تحت الجلد نحو مؤخر العنق. الرجاء انقر هنا لعرض أكبرنسخة من هذا الرقم.
الشكل 4: المثانة / مقارنة الأنابيب والخطوات المستخدمة لإدراج وتأمين أنبوب باستخدام خياطة حيدة. الصور أثناء العملية التي تصور: ( A ) صورة مقارنة PE50 و PE10 إلى المثانة البولية الماوس. ( B ) حلقة صغيرة من 6-0 حيدة خياطة وضعت حول المثانة. زوج من # 5 ميكروفورسيبس المشابك قبة المثانة في حين يستخدم 21 G إبرة لجعل بضع المثانة. ( C ) دون الإفراج عن قبة المثانة، وزوج من # 5 ميكروفورسيبس في يد المعاكس تحقيقات الثقب قبل إدخال القسطرة PE10. ( D ) القسطرة PE10 المضمونة في قبة المثانة مع خياطة 6-0 حيدة. الرجاء الضغط هنالعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5: A محفظة سلسلة خياطة يمكن استخدامها كوسيلة بديلة لتأمين الأنبوب في المثانة. ( A ) محفظة خياطة سلسلة في قبة المثانة. ( B ) PE10 أنابيب إدراجها من خلال مركز سلسلة المحفظة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 6: الإعداد التجريبي. المحاقنة التي تحتوي على 0.9٪ كلوريد الصوديوم في مضخة التسريب متصلة في سلسلة لمحول الضغط والقسطرة إنترافسيكال. شاشة الكمبيوتر في أسفل اليمين يظهر ثلاثة ميكت استنساخهدورات التبول. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 7: إعداد التسجيل التجريبي. ( A ) 22 G قطب معلقة فوق قفص تسجيل والتوازن. ( B ) صورة تظهر كامل طول الجزء الخارجي من أنابيب التسريب مع قطب 22 G وحبل PE50. ( C ) A 22 G قطب مع غمد الربيع التي تغطي أنابيب PE50. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 8: التقييم النسيجي لل ري ورعاية جدار المثانة البولية إلى أنبوب PE10 مزروع. المقاطع العرضية من المثانة البولية ملطخة الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) قبل، 2، 3، 5 و 7 أيام بعد الجراحة. المثانة جدار تورم حلها في يوم ما بعد الجراحة 5. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 9: تقييم المثانة وظيفية باستخدام فواد بقعة الفحص. البقع البول على ورقة الترشيح ينظر مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية توثيق نمط التبول ممثل في يوم 0 (قبل زرع أنبوب)، 2، 3، 4، 5 و 7 بعد زرع أنبوب داخل الرحم. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ogether.within الصفحات = "1"> 
الشكل 10: سيستوميتروجرام. أثر ممثل للضغط المثانة إنترافسيكال في مستيقظا، الماوس تتحرك بحرية. تتبع تظهر 3 دورات ميكروسوريتيون استنساخه. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 11: مرحلة التبول. تتبع تصور مرحلة التبول مع التذبذبات عالية التردد خلال الزيادة الأولية في الضغط، وذروة الضغط، وانخفاض الضغط السريع إلى خط الأساس. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
"1"> 
الشكل 12: تثبيت الحبل. ( A ) مرساة تستخدم لتأمين القسطرة PE10 في الحيوان ومنع أنبوب من بولينغ على المثانة. يتم إرفاق القرص إلى غمد الربيع. ( B ) الداخلية PE10 القسطرة متصلة أنابيب PE50 الخارجية. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 13: مرساة قطب. الجزء تحت الجلد من مرساة تتكون من ( 1 ) قرص مصنوع من النسيج و ( 2 ) حلقة معدنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
المواد المثلى وحجم الأنابيب إنترافسيكال
لتحديد تأثير أنابيب قطره على تسجيلات الضغط، اختبرنا أنابيب ميكروفلويديك مختلفة. PE50 (0.58 مم إد)، بولي يوريثان PU027 (0.4 مم إد)، PE25 (0.46 مم إد)، و PE10 (0.28 مم إد). لكل أنبوب، تم تسجيل الضغط مع مضخة التسريب التي تعمل في 1 مل / ساعة، في حين تتحرك بسرعة أنبوب عموديا من 0 إلى 30 سم. حاولت التجارب الأولية في الجسم الحي لاستخدام أنابيب PE50، لكنها لم تنجح بسبب حجم الأنابيب مقارنة المثانة الماوس ( الشكل 4A ). في حين أن هذا يدعم النتيجة التي كتبها سميث وكوشل، الذين يقترحون أن استخدام أنابيب PE50 لقياس المثانة مستيقظا في الماوس يخلق التحف، مما يجعل من الصعب تفسير البيانات، 12 من المهم أن نلاحظ أن الآخرين قد استخدمت بنجاح أنابيب PE50 في كل من نونسترايند مستيقظا ، مستيقظا ضبط النفس، وتخدير الماوس قياس المثانة. 9 ، <سوب كلاس = "كريف"> 13 ، 14 بالمقارنة مع PE50، PE10 أكثر مرونة، مما يقلل من كمية التوتر ينطبق أنبوب على المثانة كما يتحرك الماوس، والحد من التحف الحركة. من المهم أن القسم من PE10 هو قصيرة قدر الإمكان (≤ 7CM). أطول PE10 أنابيب يؤدي إلى احتمال أكبر أن القراءة الضغط سوف تكون مبللة. على الرغم من أن هناك ميزة نظرية لاستخدام أكثر ليونة، والمواد الحيوية خاملة أكثر مثل بو لزرع إنترافسيكال لتقليل رد فعل التهابات، فإنه لم يسفر عن اختلاف كبير في تورم بعد المثانة الجراحي. وعلاوة على ذلك، والمحاكمات التي تستخدم أنابيب بو ليونة، وترتبط مع التجميع والتوصيل.
آثار الجراحة على انقباض جدار المثانة وتورم
حتى الآن، كانت البيانات عن وظيفة المثانة والمثانة جدار تورم، وزرع آخر من أنبوب إنترافسيكال، المتاحة فقط للجرذان. وفقا ل s السابقةتوديس، وكان حجم التبخر أقل وكان تردد التبول أعلى في أيام ما بعد الجراحة 1 - 3. 15 كما تبين أن التغيرات في وظيفة المثانة من الفئران ارتبطت مع تورم شديد في المثانة، مع وذمة بدأت تهدأ بعد 3 أيام. 16 للحصول على فهم أفضل للتغيير في وظيفة المثانة البولية، وتورم جدار المثانة، وإصلاح الجدول الزمني للذكور، C57BL / 6 الفئران، والتي تحدث من زرع أنابيب PE10، تم تقييم 12 ساعة تردد يفرغ السلوكية باستخدام طريقة تسجيل ورقة الترشيح . بعد التسجيل الأخير، تم تخدير الفأر وتم تقييم المثانة بشكل صارم، وحصدها، وثابت، وتقييمها نسيجيا. في يوم ما بعد الجراحة 1 و 2، وانخفضت تردد يفرغ واكتشاف زيادة، تليها زيادة في يفرغ من قبل يوم 3. السلوك الفوضى تطبيعها يوم 5. كشف التقييم الإجمالي للالمثانة في الحصاد وبعد H & E تلطيخ أكبر قدرمن تورم تحت الظهارية في يوم ما بعد الجراحة 2 و 3، مع المثانة تصبح مماثلة لالمثانة السيطرة في اليوم 5 و 7 بعد زرع أنبوب.
على غرار الدراسات أوروديناميك السريرية، فإن غالبية المختبرات تستخدم درجة حرارة الغرفة 0.9٪ كلوريد الصوديوم. 11 معدل التسريب في الدراسات السابقة يختلف اختلافا كبيرا من 10 ميكرولتر / دقيقة إلى 100 ميكرولتر / دقيقة. 17 ، 18 دراسة لمقارنة آثار معدلات ضخ مختلفة على وظيفة المثانة في الماوس لم يتم القيام به، ومع ذلك، أوصت البيانات التي تم الحصول عليها في الدراسات الحيوانية الكبيرة أن معدلات ملء أبطأ ينبغي أن تستخدم. نظرا لحجم صغير من المثانة الماوس، المضخات التمعجية ليست مناسبة وآلية مستمرة مضخة ضخ ضروري.
الأكثر دقة وقابلة للاستخدام فك تسجيلات التوازن نفاذية جيدة للتغيرات في الضغط مع التحف محدودة. النتائج التي تم الحصول عليها باستخدامقطعة قصيرة من PE10 أنابيب متصلة مباشرة إلى PE50 توفير قياس دقيق للضغط في المثانة البولية الماوس. تقلبات الضغط الناجمة عن حركة الحيوان يمكن أن تكون محدودة عن طريق رسو الأنبوب على الجلد عند النقطة التي يخرج في مؤخر الرقبة ( الشكلين 12 و 13 ). ويمكن تحقيق ذلك باستخدام فقاعات الغراء ومرساة خاصة تتكون من لوحة معدنية مغطاة النسيج وضعت تحت الجلد، والقطعة الخارجية، التي تعلق على الربيع المعدني الذي يغطي الأنبوب. وتشمل الأساليب الإضافية لمنع الأنبوب من الشد على المثانة إنشاء مسار تحت الجلد منحني للجزء الداخلي من أنابيب PE10، والذي يوفر الركود في الأنبوب، واستخدام قطب وحبل، والتي تمنع التواء وكينغ. استنادا إلى الأدب والأدلة المقدمة من هذه الدراسات، ينصح الخطوات التالية لتوفير أكثر استنساخا وفسيولوجيا طريقة دقيقة في الجسم الحيتسجيل الضغط إنترافسيكال في الماوس. استخدام المجهر التشغيل وأدوات المجهرية لزرع القسطرة في قبة المثانة البولية. السماح فترة الانتعاش 5 أيام بين الجراحة والتسجيل. تتأقلم الحيوان في نفس القفص الذي سيتم تنفيذ التسجيل في وتوفير حرية الوصول إلى الغذاء والماء. إجراء التجربة في بيئة هادئة مع الحد الأدنى من الاتصال البشري، من الناحية المثالية استخدام مراقبة الفيديو عن بعد لمراقبة سلوك الحيوان.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
