Summary
Deze studie beschrijft de chirurgische procedures en experimentele technieken voor het uitvoeren van wakker cysteometrie in een vrij bewegende muis. Daarnaast biedt het experimentele bewijsmateriaal ter ondersteuning van de optimalisatie en normalisatie.
Abstract
Wakker cystometrie is al lang gebruikt om de blaasfunctie in vrij bewegende muizen te beoordelen, maar de specifieke methoden variëren van laboratoria. Het doel van deze studie was om de microchirurgische procedure te beschrijven die gebruikt werd om een intravesische buis te implantaten en de experimentele techniek voor het opnemen van urineblaasdruk in een wakker, bewegende muis. Daarnaast worden experimentele gegevens voorgesteld om aan te geven hoe de operatie, evenals type en grootte van de buis, invloed hebben op de lagere urinewegfunctie en de opnamegevoeligheid. Het effect van buisdiameter op drukopname werd beoordeeld in zowel polyethyleen als polyurethaanbuis met verschillende inwendige diameters. Vervolgens werd de best presterende buis van beide materialen ingezet in de koepel van de urine blaas van mannelijke C57BL / 6 muizen. Twaalf uur 's nachts mictuurfrequentie werd opgenomen in gezonde, intacte dieren en dieren 2, 3, 5 en 7 dagen na de operatie. Bij oogst, blaas wEre werd beoordeeld op tekenen van zwelling met behulp van grove waarneming en werden vervolgens verwerkt voor pathologische analyse. De grootste mate van blaaszwelling werd waargenomen op dag 2 en 3, die gecorreleerd was met gedragsverwijderingsgegevens die aanzienlijk verminderde blaasfunctie vertoonden. Op dag 5 was de blaar histologie en voiding frequentie genormaliseerd. Op basis van de literatuur en het bewijs dat door onze studies wordt verstrekt, stellen we de volgende stappen in voor in vivo opname van intravesische druk en vochtvolume in een wakker muis: 1) Doe de operatie met behulp van een operationele microscoop en microchirurgische hulpmiddelen. 2) Gebruik polyethyleen-10 Buizen om bewegingsartifacten te minimaliseren, en 3) Cystometrie op postoperatieve dag 5 uitvoeren wanneer blaaszwelling wordt opgelost.
Introduction
Vulcystometrie (FC) is een diagnostische methode waarbij een katheter in de urine blaas wordt geplaatst om druk op te nemen tijdens langzame blaasvulling. Eerst geïntroduceerd in 1927 als een klinische diagnostische methode om de lagere urinewegfunctie te evalueren, is het veel gebruikt. 1 Bij onderzoeksapplicaties kan FC worden gebruikt om blaasfunctie in gezonde en zieke diermodellen te testen en de effecten van farmacologische middelen te onderzoeken. Knaagdierenmodellen worden vaak gebruikt om de lagere urinewegfunctie te onderzoeken. 2 In deze groep zoogdieren werd FC eerst ontwikkeld voor gebruik bij ratten. 3 Hierbij is de methodologie om een buis in de urine blaas te implanteren en FC uit te voeren, goed beschreven en gebruikt door veel onderzoekers met een aanvaardbaar reproduceerbaarheidsniveau. 4 De beschikbaarheid van transgene en knock-out stammen maakt muizen een waardevolle soort voor talrijke onderzoeksgebieden,Inclusief het gebied van dysfunctie van de lagere urinewegen. De methodologie die wordt gebruikt voor het uitvoeren van muiscystometrie varieert aanzienlijk tussen laboratoria, waardoor het moeilijk is om resultaten te vergelijken. 5
In vergelijking met ex vivo modellen behoudt FC de lagere urineweganatomie, waardoor de gecoördineerde functie tussen de blaas en zijn uitlaat tijdens de opslag- en voidingfasen van de mictuurcyclus kan worden beoordeeld. Uit het vorige onderzoek blijkt dat talrijke, meest gebruikte anesthetica onderdrukking van de micturie onderdrukken. Agenten die de samenvatting van de blaasvliesspier (urethaan, a-chloralose, ketamine en xylazine) behouden, laten het dier mictureren, functioneren de functionele blaaskapaciteit aanzienlijk en onderdrukken neurotransmissie. 6 , 7 , 8 , 9 Hoewel technisch meer uitdagend, FC uitgevoerd in awAke ambulerende dieren behoudt de functionele integriteit van het micturiteitsreflex.
De lagere urinewegfunctie wordt beïnvloed door meerdere factoren, waaronder postoperatieve blaaswandzwelling, stress door pijn en ongemak, en milieu-invloeden. Met behulp van een chirurgische techniek die weefselbeschadiging minimaliseert tijdens de implantatie van de buis en opnamemethoden die de buisbeweging verminderen, terwijl het dieren ook vrij kunnen worden gelukt, zijn essentieel voor het verkrijgen van nauwkeurige en reproduceerbare opnames.
Indien adequaat uitgevoerd, in vivo FC in vrij bewegende dieren kan gegevens verschaffen die de fysiologische blaasfunctie betrouwbaar weerspiegelen. 10 FC in vrij bewegende dieren kan gegevens verstrekken over de volgende parameters; Basale of baseline druk: Minimale druk tussen twee micturities. Intermicturitaire druk: Beteken druk tussen twee micturities. Drempeldruk: Intravesische druk immPrecies voor micturitie. Maximale druk: Maximale blaasdruk tijdens een mictuurcyclus. Spontane activiteit (of gemiddelde intermicturitaire oscillatorische druk): Intermicturiedruk minus basale druk. Non-voiding contracties: Toename in intravesische druk tijdens de vulfase, niet geassocieerd met de afgifte van vloeistof. Blaasovereenkomst: Blaascapaciteit gedeeld door drempeldruk minus basale druk. Micturiteitsfrequentie: Aantal micturities per tijds eenheid. Intermicturiet interval: Periode tussen twee maximale voidingdrukken. Blaascapaciteit: Infused volume gedeeld door het aantal micturities. Een gedetailleerde beschrijving van deze parameters en gestandaardiseerde terminologie is eerder gepubliceerd. 11
FC kan worden uitgevoerd met behulp van een intraveneuze infusiemethode met continue of enkelvoudige cyclus. Doorlopende cystometrie maakt het mogelijk om meerdere mictuurcycli te registreren en representatieve gegevens te selecterenOp reproduceerbaarheid. De nauwkeurigheid van het meten van blaaskapaciteit is beperkt door het onbekende restvolume. Daarnaast is het uitdagend om kleine volgehouden volumes (die gebaseerd zijn op de spanning en het geslacht variëren tussen 30 en 184 μL) in vrije ambulerende muizen te verzamelen. Met behulp van deze methode om volgelopen volume te registreren is minder nauwkeurig in vergelijking met een verdovingspreparaat, maar het is superieur doordat het de onderdrukkende effecten van verdovingsmiddelen op de blaasfunctie vermijdt. Enkelcycluscystometrie moet worden gebruikt om de blaaskapaciteit te beoordelen. Bij deze methode wordt de blaas leeggemaakt door aspiratie voorafgaand aan de infusie en wordt de capaciteit berekend als een functie van de infusiesnelheid vermenigvuldigd met de tijd tot de maximale druk.
Hoewel de techniek van het uitvoeren van cystometrie bij kleine knaagdieren is gepubliceerd, beschreef het de operatie die in een rat werd uitgevoerd en aanbevolen dat de muiscystometrie onder urethaan verdoving moet worden uitgevoerd. 10 Het doel van deze communicatie is tO beschrijf zowel de microchirurgische technieken die gebruikt worden om een intravesische buis in de koepel van de urine blaas te implantaten en de experimentele opstelling die gebruikt wordt om de onderste urinewegfunctie in vivo op te nemen tijdens de continue blaasvulling en micturitie in een wakker, vrij bewegende muis. Daarnaast werden experimenten uitgevoerd om aan te geven hoe slanglengte, diameter en materiaal, evenals de methodologie voor het uitvoeren van in vivo FC, de opname beïnvloeden. Dit experimentele protocol geeft een overzicht van eerder gepubliceerde technieken en stelt een aantal wijzigingen voor die gebaseerd zijn op experimentele resultaten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren werden gehuisvest in de Universiteit van Vermont Animal Care Facility volgens de institutionele richtlijnen. Alle dierproeven werden uitgevoerd in overeenstemming met de gids National Institutes of Health voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren.
1. Intravesische Tube Implantatie
- Voorbereiding van buizen en instrumenten voor de chirurgische procedure
- Knip een 7 cm stuk PE10-buis om de katheter te maken voor implantatie.
- Maak een flare aan het ene uiteinde van de PE10 buis door het einde langzaam naar een open vlam te brengen.
OPMERKING: Verwijder de buis zo snel als de ontploffing ontstaat. - Breng drie druppels all-purpose hot lijm aan, met behulp van de lage hitte instelling op een lijmpistool, op 4,5, 5 en 5,5 cm van het gebogen einde aan de buitenkant van de PE10 buis. Deze helpen bij het veilig maken van de buis bij het dier. ( Figuur 1 )
- Steriliseer de slang door het in 70%Ethanol en dan spoelen met steriele 0,9% NaCl voor gebruik. Laat de buis vol om te voorkomen dat luchtbellen in het systeem worden ingevoerd.
- Maak een 30-gauge stekker om het uiteinde van de PE10-katheter te verzegelen door een 30-gauge naald van de naaf te scheiden door het proximale uiteinde aan de hand handmatig te manipuleren. Breng een druppel heet lijm aan het einde aan. Zorg ervoor dat de zeehond waterdicht is. ( Figuur 2 )
- Gebruik de volgende microchirurgische instrumenten: Twee paar Dumont # 7 gebogen microforceps, twee paar Dumont # 5 gebogen microforceps, een 21 G-naald, ultrafijne rechte hemostat, microschaar, kleine dissecterende schaar en een micro-naaldhouder.
- Steriliseer alle instrumenten voordat u de procedure start.
- Voorbereiding van het dier
- Na het verdoving van het dier, scheer de onderste helft van de buik eerst af, draai het dier dan weer genezen en scheer en reinig het gebied op de bovenrug met 70% alcohol, gevolgd door betadine. Breng de vetalf aan de ogen aan om droogheid te voorkomen. Gebruik vervolgens een paar rechte, stompe scharen en een paar Dumont # 7 gebogen microforceps om een 1,5 cm lange huidinsnijding tussen de scapulae te maken en het dier op de bovenkant van een verwarmingsblok (37 ° C) bedekt met steriele gordijnen te plaatsen.
- Maak tenslotte de buik schoon met alcohol en betadine.
- Chirurgische procedure
OPMERKING: Voer alle chirurgische procedures uit onder een operationele microscoop met vergroting van 3,15 tot 20x. Zet de steriele handschoenen nadat u het dier op de steriele gordijnen plaatste. Doorgaan met het gebruik van steriele procedures gedurende de gehele operatie.- Plaats het dier in een inductiebox en verdovende met 2% inhalatie van isofluraan met een zuurstofdrager (1 L / min). Houd anesthesie door de procedure door het hoofd van het dier in een neuskegel te plaatsen en 2% inhalatie van isofluraan met een zuurstofdrager (1 L / min) te gebruiken. Begin de operatie na ontvangst van een negAtieve respons uit de teenknijp test.
- Gebruik een paar rechte, stompe scharen en een paar Dumont # 7 gebogen microforceps om een 1,5 cm lagere, middellijnse buiksnede door de huid te maken. Vervolgens creëer u een bijpassende incisie door het fascia langs de linea alba en spier om de koepel en de bovenste helft van de urineblaas bloot te leggen. Vermijd de blaas te verwonden door opwaartse tractie aan elke weefsellaag toe te passen met behulp van een paar Dumont # 7 gebogen microforceps. Houd de buikviscera van uitdroging door druppels warme fysiologische zoutoplossing toe te voegen.
- Draai het dier op zijn zijde om de snede op de nek van de nek te bereiken. Duw een smalle hemostaat subcutaan door de incisie. Het subcutane kanaal moet aan de achterkant beginnen en langs de zijkant gaan.
- Zodra het uiteinde van het instrument de bodem van de ribbekap bereikt, draai de punt naar de middellijn en binnenkant van de buik (er zal een lichte pop zijn wanneer de buikspieren doordringen). Ga verder met de hemostat totdat de punt wordt blootgesteld aan de buikspleet onder de spierlaag. ( Figuur 3 )
- Pak het "niet-gevlekte" uiteinde van de buis met de hemostat en trek het gereedschap langzaam terug, trek het uiteinde van de buis uit via de incisie aan de achterkant van de nek. Pas het gevlekte einde van de buis aan, zodat het direct boven de koepel van de blaas ligt.
- Maak een losse das van 6-0 monofilament suture (niet-absorbeerbaar) en plaats het boven op de blaaskop. Deze band wordt later gebruikt om de buis in de blaas te bevestigen.
- Plaats een kleine rol lintvrij weefsel in de buik en achter de blaas om te helpen stabiliseren en verheffen.
- Bereid je voor om het gevlekte einde van de PE10-katheter in de blaas in te voeren.
- In de niet-dominante hand houd de koepel van de blaas vast met Dumont # 7 gebogen microforceps en houd deze grip vast totdat de katheter in de blaas is geplaatst.
- Gebruik een 21-gauge naald tO Maak een cystotomie in de top van de koepel. Zacht de cystotomie voorzichtig met een gesloten paar # 5 gebogen microforceps om ervoor te zorgen dat de katheter gemakkelijk door het gat kan passeren.
- Terwijl u de blaaskoepel nog steeds in de niet-dominante hand houdt, plaatst u het gevlekte einde van de PE10-katheter in de blaas (druk de flare naar de blaasnek zodat deze niet uitschuift tijdens het vastzetten).
- Bind de 6-0 monofilament hechting rond de koepel van de blaas en de buis met de das geplaatst voor de buis. Zorg ervoor dat u de hechting zo hoog mogelijk op de blaas bindt om kunstmatig de blaaskapas te voorkomen. ( Figuur 4 )
- Alternatief, beveilig de katheter met behulp van een handtasstring als volgt. Maak een losse sluiting op de koepel van de blaas met behulp van 6-0 monofilament. Volg de stappen 1.3.8.1 - 1.3.8.3 om de cystotomie uit te voeren en plaats de katheter. Bevestig de buis door de sluiting van de portemonnee te binden. ( Figuur 5 )
- Test de patiënt en de afdichting van de buis in de blaas door een 0,5 ml insulinspuit met een 30-gaas naald aan het distale uiteinde van de buis vast te leggen. Vul de blaas langzaam met 0,1 - 0,2 ml 0,9% NaCl tot een druppel op de urethrale opening verschijnt, en leog de blaas door aspiratie. Het is belangrijk dat de blaas zowel gevuld en leeggemaakt kan worden.
- Als er geen lekken optreden in de koepel, braceer de blaas met een paar gebogen microforceps en trek de buis voorzichtig tot de flare tegen de binnenkant van de blaaskoepel rust.
- Voordat u sluit, verwijder de kleine rolweefsel en zorg ervoor dat de blaas in de normale positie staat.
- Sluit de buikwand in twee lagen (spier en huid) met 6-0 lopende hechting. Het is de voorkeur om de rectus abdominis-spier te benaderen door alleen de randen van de anterior buikfasma (voorste wand van de rectusschede) te suteren.
- Om de buis aan de dieren te beveiligen, rustig rustigTat het dier op zijn buik. Plaats het subcutane gedeelte van het metalen anker in de interscapulaire incisie. ( Figuur 12 ) Gebruik een 6-0 suture om de buis en het anker te bevestigen door ze te omringen met een verticale matrashechting.
- Zorg ervoor dat een lijmbubbel boven en onder de huid blijft om te voorkomen dat de buis erin trekt. Knip de buis ongeveer 2 cm boven de huid.
- Steek de 30-gauge stekker (stap 1.1.5) voorzichtig in het uiteinde van de buis om te voorkomen dat de urine lekt.
- Injecteer 0,5 ml 0,9% NaCl subcutaan voor hydrering. Geef na-operatieve analgesie onmiddellijk na de operatie en houd deze gedurende 48 uur onderhouden.
- Plaats het dier terug in zijn kooi onder een infraroodlamp. Bevestig constante observatie tot het dier vrij rond de kooi beweegt.
- Monitor het dier dagelijks en laat het 5 dagen voor opname herstellen.
2. Ontwaak CysteOmetry opname
- Voorbereiding van het opname programma, druk transducer, en infusiepomp.
- Voordat u het dier verdooft, sluit u de infusiepomp, drukomvormer en 22 G draaien met PE50-buizen. ( Figuur 6 )
- Open het opname programma (zie tabel van materialen voor een voorbeeld), op een computer om de systeemdruk te kalibreren en voor te bereiden op de opname. Zorg ervoor dat u dezelfde instellingen gebruikt tijdens kalibratie en opnemen.
- Vul een 20 ml spuit met 10-15 ml kamertemperatuur 0,9% NaCl en laad de infusiepomp in. Programmeer de pomp met een snelheid van 0,6 ml / h.
- Bevestig de drukomvormer op dezelfde hoogte als de blaas van het dier of de bodem van de opname kooi.
- Bevestig de 22 gauge draaibaar aan het einde van de drukomvormer (PE50-buis - druk transducer om te draaien)
OPMERKING: Met de draaiknop wordt voorkomen dat de buis draait of kinktHet dier beweegt. - Bevorder de spuitpomp om 0,9% NaCl door het systeem te spoelen. Zorg ervoor dat u alle luchtbellen verwijdert alvorens te kalibreren.
- Gebruik het regelprogramma om de druk te kalibreren (cm / H 2 O). Verplaats het uiteinde van de PE50-band langzaam van 0 tot 30 cm. Stel indien nodig het nul aan.
OPMERKING: Het 0 cm-teken moet op dezelfde hoogte zijn als de vloer van de opnamekooi en drukomvormer.
- Schuif de 22-gauge draaibaar boven het midden van de opnamekooi. Zorg ervoor dat de kooibodem de urine op de verzamelinrichting laat vallen van het evenwicht dat onder de kooi zit. Pas de hoogte van de band aan zodat de muis vrij rond de kooi kan bewegen zonder de buis te verlengen of uit te strekken. ( Figuur 7 )
- Controleer bij het voltooien dat het systeem en de externe PE50-buis vol 0,9% NaCl zijn en alle luchtbellen zijn verwijderd.
- PrepAratie van het dier voor opname
- Verdoof het dier met 2% inhalatie van isofluraan en plaats het op zijn buik. Verwijder de 30-gauge stekker en schuif de PE10-buis (blaaskatheter) in het uiteinde van de PE50-band. Gebruik hete lijm om een waterdichte afdichting te vormen.
- Zet de anesthesie uit en plaats het dier in de opnamekooi met een paralleldraadvloer, waardoor de urine direct op een verzamelingsapparaat valt die bovenop een analytische balans staat. ( Figuur 7 )
- Start de opname zodra het dier in de kooi zit, maar begin niet met infuus. Bewaak het dier totdat het volledig van de verdoving komt. Zodra de blaasdruk stabiliseert, begin met 0,9% NaCl infusie met een snelheid van 0,6 ml / h.
OPMERKING: Maak een notitie in het opnameprogramma wanneer er veranderingen worden aangebracht. Het is belangrijk om een record te krijgen van wanneer de infusie begint, stopt of onregelmatigheden optreden. - Controleer het systeem voor lekkages en zorg ervoor dat het dier makkelijk in gebruik heeftEss voor eten en water.
- Ga verder met opname in een stille kamer tot drie reproduceerbare mictuurcycli worden verkregen.
OPMERKING: Het dier moet tijdens de opname volledig ongestoord zijn. Gebruik bij voorkeur remote video monitoring om gedrag te waarnemen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er was geen significant verschil tussen de buismaterialen en de diameters in de consistentie van drukstijging en vallen binnen het systeem tijdens buisbezetting. Blaaswand zwelling na intravesische buis implantatie was significant voor zowel polyethyleen (PE) en polyurethaan (PU) materialen. Op dag 2 ontwikkelde ernstige submucosale zwelling. Het heeft de helft van de doorsnede van de blaas bezet, waardoor het lumen verstoord raakt. Op dag 5 is het oedeem volledig opgelost, waardoor de submucosale gebieden geïnfiltreerd zijn met ontstekingscellen die de muscularis gedeeltelijk binnendringen. Op dag 7 was de ontstekingsinfectie significant verminderd en de blaaswandhistologie keerde terug naar normaal ( Figuur 8 ). De grootste mate van weefselzwelling waargenomen op dag 2 en dag 3 is gecorreleerd met gedragsmatige gegevens die een significante verminderde blaasfunctie vertonen ( figuur 9 ). Voiding frequentie genormaliseerd door po St operatieve dag 5.
Intravesische druk in een wakker bewegende muis (met minimale bewegingsartifacten) wordt gekenmerkt door een basislijndruk van 10-15 cm H 2 O, die onveranderd mag blijven of geleidelijk toenemen met niet meer dan 10 cm H 2 O tijdens de vulcyclus , Gevolgd door een plotselinge, pulserende drukverhoging en vervolgens laten vallen tijdens het vullen ( figuren 10 en 11 ).
Figuur 1: PE10-buis voor implantatie in de urine blaas. ( A ) Een 7 cm stuk PE10-buis met druppels warme lijm op 4,5, 5 en 5,5 cm van het opgeblazen einde. ( B en C ) Een gedetailleerde afbeelding die het gevlekte einde van de buis toont (gebruikt om de buis in de blaas te beveiligen).Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Plug voor de externe portie van de PE10-blaasbuis. Plug is gemaakt van een 30 G-naald en hete lijm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Cursus van de blaasbuis. Schematische lijntekening die de plaatsing van de buis door de buik en zijn subcutane route naar de nek van de nek illustreert. Klik hier om een groter te bekijkenVersie van deze figuur.
Figuur 4: Compressie van blaas / buis en stappen die gebruikt worden om de buis in te voegen en te beveiligen met behulp van een losse monofilament hechting. Intraoperatieve foto's die uitbeelden: ( A ) Beeld vergelijken PE50 en PE10 met een urine blaas van de muis. ( B ) Een kleine lus van 6-0 monofilament hechting geplaatst rond de blaas. Een paar # 5 microforceps klampt de koepel van de blaas terwijl een 21 G-naald wordt gebruikt om de cystotomie te maken. ( C ) Zonder de koepel van de blaas vrij te maken, probeert een paar # 5 microforceps in de tegenovergestelde hand het gat voordat de PE10-katheter wordt geplaatst. ( D ) PE10 katheter beveiligd in de koepel van de blaas met 6-0 monofilament hechting. Klik hier alsjeblieftOm een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 5: Een Purse String Suture kan gebruikt worden als een alternatieve methode voor het beveiligen van de buis in de blaas. ( A ) Purse string suture in de koepel van de blaas. ( B ) PE10-buis ingevoegd door middel van een middelpunt van de tas. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Experimentele opstelling. Spuit met 0,9% NaCl in de infusiepomp die in serie is aangesloten op de druk transducer en intravesische katheter. Het computerscherm rechtsonder toont drie reproduceerbare mictUritie cycli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Experimentele opname instellen. ( A ) 22 G draaibaar geschorst over een opname kooi en evenwicht. ( B ) Foto die de volledige lengte van het externe gedeelte van de infusieslang toont met een 22 G draaibaar en een PE50 tether. ( C ) Een 22 G draaibaar met een PE50 buisbekleding. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Histologische evaluatie van de ReSpons van de urine blaaswand naar een geïmplanteerde PE10 buis. Dwarsdoorsneden van de urine blaas gekleurd met hematoxyline en eosine (H & E) vóór, 2, 3, 5 en 7 dagen na de operatie. Blaaswandzwelling is opgelost op postoperatieve dag 5. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te zien.
Figuur 9: Functionele Blaas Evaluatie met behulp van Voiding Spot Assay. Urinevlekjes op filterpapier die worden bekeken met UV-licht dat het representatieve micturiepatroon op dag 0 (voor buisimplantaat), 2, 3, 4, 5 en 7 post-intravesisch buisimplantaat documenteert. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 10: Cystometrogram. Representatief spoor van intravesische blaasdruk in een wakker, vrij bewegende muis. Trace met 3 reproduceerbare mictuurcycli. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 11: Micturitiefase. Trace die de micturiteitsfase illustreert met hoge frequentie-oscillaties tijdens de initiële toename van druk, piekdruk en een snelle drukdaling naar basislijn. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 12: Verankering van de Tether. ( A ) Anker gebruikt om de PE10-katheter in het dier te bevestigen en te voorkomen dat de buis op de blaas pompt. De schijf is aan de veermantel bevestigd. ( B ) Interne PE10-katheter aangesloten op de externe PE50-buis. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 13: Swivel Anchor. Subcutaan gedeelte van het anker bestaande uit ( 1 ) een schijf gemaakt van stof en ( 2 ) een metalen lus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimale materiaal en grootte van intravesical tubing
Om te bepalen welke effect de diameter van de buis heeft op drukopnamen, hebben we verschillende microfluïdische buizen getest; PE50 (0,58 mm ID), polyurethaan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) en PE10 (0,28 mm ID). Voor elke buis werd druk geregistreerd met de infusiepomp met 1 ml / h, terwijl de buis de verticale beweging van 0 tot 30 cm snel verplaatst. Aanvankelijke in vivo-experimenten probeerden PE50-buizen te gebruiken, maar waren niet succesvol door de grootte van de buizen in vergelijking met de muisblaas ( Figuur 4A ). Terwijl dit de bevinding van Smith en Kuchel ondersteunt, die suggereren dat het gebruik van PE50-buizen voor wakker cysteometrie in een muis artefacten maakt, waardoor het moeilijk is om de gegevens te interpreteren, 12 het is belangrijk om op te merken dat anderen met succes de PE50-buis in beide wakker nonrestrained , Wakker bewaard, en verdoofde muiscystometrie. 9 , <Sup class = "xref"> 13 , 14 In vergelijking met PE50 is PE10 flexibel, wat de hoeveelheid spanning vermindert die de buis op de blaas toepast wanneer de muis beweegt, waardoor bewegingsartifacten worden verminderd. Het is belangrijk dat de sectie PE10 zo kort mogelijk is (≤ 7cm). Langer PE10 slangen leidt tot grotere waarschijnlijkheid dat de druk lezing zal worden gedempt. Hoewel er een theoretisch voordeel is om een zachter, meer bio-inert materiaal zoals PU te gebruiken voor intravesale implantatie om de ontstekingsreactie te verminderen, resulteerde het niet in een significant verschil in postoperatieve blaaszwelling. Verder werden proeven die de zachtere PU-buizen gebruiken, geassocieerd met kinken en pluggen.
Effecten van de operatie op de contractiviteit van de blaaswand en zwelling
Tot op heden waren gegevens voor de blaasfunctie en de zwelling van de blaaswand, postimplantaat van een intravesale buis alleen beschikbaar voor ratten. Volgens vorige sTudies, mictuurvolume was lager en micturiteitsfrequentie was hoger op postoperatieve dagen 1 - 3. 15 Ook werd aangetoond dat veranderingen in de blaarfunctie van een rat in verband waren met ernstige zwelling van de blaas, waarbij het oedeem begon te dalen na 3 dagen. 16 Om een beter begrip te krijgen van de verandering in de urine blaasfunctie, blaaswandzwelling en de herstelling van de tijdlijn van mannelijke, C57BL / 6-muizen, die zich voordoen bij het implanteren van PE10-buizen, werd de 12-uur gedragsreferentiefrequentie beoordeeld aan de hand van de filteropname-methode . Na de laatste opname werd de muis verdoofd en de blaas werd grofweg beoordeeld, geoogst, gefixeerd en geëvalueerd histologisch. Op post-operatie dag 1 en 2 is de voidingfrequentie verminderd en de spotting toegenomen, gevolgd door een toename van voiding per dag 3. Voidgedrag genormaliseerd tegen dag 5. Bruto evaluatie van blaas bij oogst en na H & E-kleuring onthulde de grootste hoeveelheidVan suburotheliale zwelling op postoperatieve dag 2 en 3, waarbij blaas op de dag 5 en 7 lijkt op de controle blaasjes na het buisimplantaat.
Net als bij klinische urodynamische studies gebruikte de meerderheid van de laboratoria kamertemperatuur 0,9% NaCl. 11 De infusiesnelheid in eerdere studies varieert aanzienlijk van 10 μl / min tot 100 μl / min. 17 , 18 Een studie die de effecten van verschillende infusiesnelheden op de blaasfunctie in een muis vergelijkt, is niet gedaan, maar gegevens die bij grotere dierstudies zijn verkregen, aanbevolen dat langzamere vullingshoeveelheden gebruikt worden. Vanwege het kleine volume van de muisblaas zijn peristaltische pompen niet geschikt en is een continue infuuspomp nodig.
De meest nauwkeurige en bruikbare FC-opnames evenwicht goede transmissie van veranderingen in druk met beperkte artefacten. De verkregen resultaten onder gebruikmaking vanEen kort segment van PE10-buizen die direct op PE50 zijn aangesloten, zorgde voor een nauwkeurige meting van druk in de urine blaas van de muis. Drukvariaties veroorzaakt door beweging van dieren kunnen beperkt worden door de buis aan de huid te verankeren op het punt waar het op de nek van de nek komt ( figuren 12 en 13 ). Dit zou kunnen worden bereikt met behulp van lijmbellen en een speciaal anker bestaande uit een metalen stofbedekte plaat die subcutaan is geplaatst en het externe stuk, dat is bevestigd aan de metalen veer die de buis hecht. Aanvullende methoden om te voorkomen dat de buis op de blaas trekt, omvat het creëren van een gebogen subcutaan spoor voor het inwendige gedeelte van de PE10-buis, die een slap in de buis biedt, en met behulp van een draaibaar en tether, die verdraaien en kinken voorkomen. Op basis van de literatuur en het bewijs dat door deze studies wordt verstrekt, worden de volgende stappen aanbevolen om de meest reproduceerbare en fysiologisch nauwkeurige methode voor in vivo te verschaffenOpname van intravesische druk in een muis. Gebruik een operationele microscoop en microchirurgische instrumenten om de katheter in de koepel van de urine blaas te implanteren. Laat een herstelperiode van 5 dagen tussen de operatie en de opname toe. Acclimatiseer het dier in dezelfde kooi dat de opname wordt uitgevoerd en gratis toegang tot voedsel en water biedt. Doe het experiment in een rustige omgeving met minimaal menselijk contact, gebruik ideaal gebruik op afstand video monitoring om het gedrag van het dier te observeren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
