Summary
Denna studie beskriver kirurgiska ingrepp och experimentella tekniker för att utföra vaken cystometri i en fritt rörlig mus. Dessutom ger det experimentella bevis för att stödja dess optimering och standardisering.
Abstract
Uppvakningsfyllnadscystometri har länge använts för att utvärdera blåsfunktionen hos fritt rörliga möss, men de specifika metoder som används varierar mellan laboratorier. Målet med denna studie var att beskriva det mikrokirurgiska förfarandet som användes för att implantera ett intravesiskt rör och den experimentella tekniken för att registrera urinblåstrycket i en vaken, fritt rörlig mus. Dessutom presenteras experimentella data för att visa hur kirurgi, såväl som slangartyp och -storlek, påverkar nedre urinvägsfunktionen och inspelningskänsligheten. Effekten av rördiametern vid tryckregistrering bedömdes i både polyeten- och polyuretanrör med olika inre diametrar. Därefter implanterades det bästa utförande röret från båda materialen kirurgiskt in i kupolen i urinblåsan hos manliga C57BL / 6-möss. Tolv timmars miktureringsfrekvens över natten registrerades i friska, intakta djur och djur 2, 3, 5 och 7 dagar efter operationen. Vid skörd, blåsor wUtvärderas för tecken på svullnad med användning av bruttobservation och behandlades därefter för patologisk analys. Den största delen av blåsans svullnad observerades på dag 2 och 3, vilket korrelerade med beteendestörande data som visade signifikant nedsatt blåsfunktion. Vid dag 5 hade blåsans histologi och voiding frekvens normaliserats. Baserat på litteraturen och bevisen från våra studier, föreslår vi följande steg för in vivo inspelning av intravesiskt tryck och volymen i en vaken mus: 1) Utför operationen med hjälp av ett operativt mikroskop och mikrokirurgiska verktyg, 2) Använd polyeten-10 Rör för att minimera rörelseartefakter, och 3) Utför cystometri på postoperativ dag 5, när blåsans svullnad löser sig.
Introduction
Fyllning av cystometri (FC) är en diagnostisk metod som innebär att man placerar en kateter i urinblåsan för att registrera tryck under långsam blåsning. Först infördes 1927 som en klinisk diagnostisk metod för att utvärdera nedre urinvägsfunktionen, har den fortsatt stor användning. 1 I forskningsapplikationer kan FC användas för att testa blåsans funktion i friska och sjuka djurmodeller och att studera effekterna av farmakologiska medel. Gnagdjursmodeller används ofta för att undersöka nedre urinvägsfunktionen. 2 I denna grupp däggdjur utvecklades FC först för användning hos råttor. 3 Metoden att implantera ett rör i urinblåsan och utföra FC har väl beskrivits och använts av många forskare med en acceptabel reproducerbar nivå. 4 Tillgängligheten av transgena och utjämningsstammar gör möss till en värdefull art för många forskningsområden,Inklusive området för nedre urinvägar dysfunktion. Metoden som används för att utföra muscystometri varierar avsevärt mellan laboratorier, vilket gör det svårt att jämföra resultat. 5
Jämfört med ex vivo- modeller, bevarar FC lägre urinvägsanatomi, vilket möjliggör att den samordnade funktionen mellan blåsan och dess utlopp under lagrings- och voidingfasen hos micturitionscykeln ska bedömas. Tidigare forskning visar att många, allmänt använda anestetika undertrycker micturitionssammandragning. Agenter som bevarar urinblåsans glattmuskelkontraktion (uretan, a-kloralos, ketamin och xylazin), vilket gör att djuret mikturerar, ändå signifikant minskar funktionell blåskapacitet och undertrycker neurotransmission. 6 , 7 , 8 , 9 Även om tekniskt mer utmanande utförde FC i awAke ambulerande djur bevarar den funktionella integriteten hos micturitionsreflexen.
Lägre urinvägsfunktion påverkas av flera faktorer, inklusive postoperativ blåsväggsvullnad, stress på grund av smärta och obehag och miljöpåverkan. Med hjälp av en kirurgisk teknik som minimerar vävnadsskada under rörimplantation och inspelningsmetoder som minskar rörrörelsen, samtidigt som djuret tillåter ambulering, är det viktigt att få noggranna och reproducerbara inspelningar.
Om det utförts tillräckligt, in vivo FC i fritt rörliga djur kan tillhandahålla data som på ett tillförlitligt sätt speglar fysiologisk blåsfunktion. 10 FC i fritt rörliga djur kan tillhandahålla data om följande parametrar; Basalt eller baslinjetryck: Minsta tryck mellan två mikturer. Intermicturition press: Medel tryck mellan två micturitions. Tröskeltryck: Intravesical pressure immRedaktivt före mikturen. Maximalt tryck: Maximalt blåstryck under en miktureringscykel. Spontan aktivitet (eller medelvärde mellan oscillerande tryck): Intermiktureringstryck minus basaltryck. Non-voiding contractions: Ökning av intravesikal tryck under fyllningsfasen, inte associerat med frisättning av vätska. Blåsans överensstämmelse: Blåskapacitet dividerad med tröskeltryck minus basaltryck. Micturitionsfrekvens: Antal micturitions per tidsenhet. Intermicturitionsintervall: Period mellan två maximala lufttryck. Blåskapacitet: Infunderad volym dividerat med antalet mikturer. En detaljerad beskrivning av dessa parametrar och standardiserad terminologi har tidigare publicerats. 11
FC kan utföras med en intravesisk infusionsmetod med kontinuerlig eller enstaka cykel. Kontinuerlig cystometri möjliggör registrering av flera micturitionscykler och val av representativ databasOm reproducerbarhet. Dess noggrannhet vid mätning av blåskapaciteten är begränsad på grund av den okända restvolymen. Dessutom är det utmanande att samla små volymer (som är baserade på stam och sex varierar mellan 30 och 184 μL) i fritt ambulerande möss. Genom att använda denna metod för att spela in volymen är mindre noggrann jämfört med en bedövad beredning, men det är överlägsen, eftersom det undviker narkotikas undertryckande effekter på blåsfunktionen. Cystometri med encykel bör användas för att bedöma blåskapaciteten. I denna metod töms blåsan genom aspiration före infusion och kapaciteten beräknas som en funktion av infusionshastigheten multiplicerad med tiden till det maximala trycket.
Även om tekniken för att utföra cystometri i små gnagare har publicerats beskrev den operationen som utfördes i en råtta och rekommenderade att muscystometri skulle utföras under uretananestesi. 10 Målet med denna kommunikation är tO beskriva både de mikrokirurgiska teknikerna som används för att implantera ett intravesiskt rör i urinblåsans kupol och den experimentella uppställningen som används för att registrera nedre urinvägsfunktionen in vivo under kontinuerlig blåsfyllning och mikturion i en vaken, fritt rörlig mus. Dessutom utfördes försök för att ta itu med hur tublängden, diameteren och materialet, liksom metoden för att utföra in vivo FC, påverkar inspelningen. Detta experimentella protokoll sammanfattar tidigare publicerade tekniker och föreslår ett antal modifieringar baserat på experimentella resultat.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Djur hölls på University of Vermont Animal Care Facility enligt institutionella riktlinjer. Alla djurförsök utfördes i enlighet med National Institutes of Health guide för vård och användning av laboratoriedjur.
1. Intravesical Tub Implantation
- Förberedelse av rör och instrument för det kirurgiska förfarandet
- Skär en 7 cm lång PE10-rör för att göra kateteret för implantation.
- Skapa en flare i ena änden av PE10-röret genom att långsamt förflytta änden mot en öppen flamma.
OBS: Dra snabbt ut röret så fort flaren utvecklas. - Applicera tre droppar smältlim med hjälp av låg värmeinställning på limpistol, 4,5, 5 och 5,5 cm från den utbrända änden på utsidan av PE10-röret. Dessa hjälper till att säkra röret vid djurets rygg. ( Figur 1 )
- Sterilisera röret genom att blötlägga det i 70%Etanol och spola sedan med sterilt 0,9% NaCl före användning. Lämna röret fyllt för att undvika att luftbubblor införs i systemet.
- Skapa en 30-gaugeplugg för att täta änden av PE10-katetern genom att separera en 30-gauge nål från navet genom att manuellt manipulera den proximala änden från sida till sida. Applicera en droppe varm lim till slutet. Se till att tätningen är vattentät. ( Figur 2 )
- Använd följande mikrokirurgiska instrument: Två par Dumont # 7 krökta mikroforceps, två par Dumont # 5 krökta mikroforceps, en 21 G nål, ultrafina rak hemostat, mikro sax, liten dissekeringsaxa och en mikronålhållare.
- Sterilisera alla instrument innan proceduren startas.
- Framställning av djuret
- Efter anestetisering av djuret raka först underkanten av buken, vrid sedan djuret benäget och raka och rengör området på överkanten med 70% alkohol följt av betadin. Applicera veterinärsalva i ögonen för att förhindra torrhet. Använd sedan ett par raka, trubbiga saxar och ett par Dumont # 7 böjda mikroforceps för att göra ett 1,5 cm långt hudinsnitt mellan scapulae och placera djuret bakom ovanpå en värmeplatta (37 ° C) täckt med sterila draperier.
- Slutligen rengör buken med alkohol och betadin.
- Kirurgiskt ingrepp
OBS: Utför alla kirurgiska ingrepp under ett operativmikroskop med förstoringsgrad från 3,15X till 20X. När du har placerat djuret på de sterila gardinerna, sätt på sterila handskar. Fortsätt använda sterila procedurer under hela operationen.- Placera djuret i en induktionslåda och bedöva med 2% inhalerad isofluran med en syrebärare (1 liter / min). Behåll anestesi genom hela proceduren genom att placera djurets huvud i en näskegel och använd 2% inandad isofluran med en syrebärare (1 liter / min). Börja operationen efter att ha fått en negAtivt svar från täpptestet.
- Använd ett par raka, trubbiga saxar och ett par Dumont # 7 krökta mikroforceps för att göra en 1,5 cm nedre midjans bukhalvsnitt genom huden. Därefter skapar du ett matchande snitt genom fascien längs linjen alba och muskeln för att exponera kupolen och den övre halvan av urinblåsan. Undvik att skada blåsan genom att applicera uppåtgående dragkraft på varje vävnadsskikt med hjälp av ett par Dumont # 7 krökta mikroforceps. Håll bukhinnan från uttorkning genom att lägga droppar av varm fysiologisk saltlösning.
- Vrid djuret på sin sida för att komma åt snittet på nacken. Skjut en smal hemostat subkutant genom snittet. Den subkutana kanalen bör börja på baksidan och fortsätt längs sidan.
- När spetsen av instrumentet når botten av ribbburet, vrid spetsen mot mittlinjen och inuti buken (det kommer att finnas en liten pop när du tränger in i bukväggen). Fortsätt framhäva hemostat tills spetsen exponeras vid bukhålan under muskulagret. ( Figur 3 )
- Ta tag i den "icke-flakade" änden av röret med hemostat och dra långsamt verktyget, dra rörets ände ut genom snittet på baksidan av nacken. Justera rörets utsträckta ände så att den ligger direkt ovanför blåsans kupol.
- Gör en lös slips med 6-0 monofilament sutur (icke-absorberbar) och placera den ovanpå blåsans kupol. Denna slips används senare för att säkra röret i blåsan.
- Lägg en liten rulle luddfri vävnad i buken och bakom blåsan för att stabilisera och lyfta upp det.
- Förbered dig för att sätta in den utsträckta änden av PE10-katetern i blåsan.
- I den icke dominerande handen håller du kupolen på blåsan med Dumont # 7 böjda mikroforceps och behåller detta grepp tills katetern placeras i blåsan.
- Använd en 21-gauge nål tO gör en cystotomi i toppens kupol Prova försiktigt cystotomin med ett slutet par # 5 böjda mikroforceps för att säkerställa att katetern lätt kan passera genom hålet.
- Medan du håller fortfarande blåskupolen i den icke dominerande handen, placera den utsträckta änden av PE10-katetern i blåsan (tryck flaren ner till blåsans nacke så att den inte släpper ut medan den säkras).
- Tie 6-0 monofilament sutur runt kupolen av blåsan och slangen med slipset placerat främre mot slangen. Var noga med att binda suturen så högt upp på blåsan som möjligt för att undvika artificiellt minskad blåskapacitet. ( Figur 4 )
- Alternativt, säkra katetern med hjälp av en handväska sutur enligt följande. Gör en lös handväska sutur på kupolen av blåsan med 6-0 monofilament. Följ steg 1.3.8.1 - 1.3.8.3 för att utföra cystotomi och sätt in katetern. Säkra röret genom att binda hängen i handväskan. ( Figur 5 )
- Testa patenten och tätningen av röret i blåsan genom att fästa en 0,5 ml insprutningsspruta med en 30-gauge nål i rörets distala ände. Fyll långsamt blåsan med 0,1-0,2 ml 0,9% NaCl tills en droppe framträder vid urinrörets öppning och töm sedan blåsan genom aspiration. Det är viktigt att blåsan kan fyllas och tömmas.
- Om inga läckor inträffar vid kupolen, stansar du blåsan med ett par krökta mikroforceps och dra försiktigt på röret tills flaren ligger mot insidan av blåsans kupol.
- Innan du stänger, ta bort den lilla rullen av vävnad och se till att blåsan är i sin normala position.
- Stäng bukväggen i två lager (muskel och hud) med 6-0 löpande sutur. Det är att föredra att approximera rectus abdominis-muskeln genom att sutra endast kanterna på den främre bukfasan (den främre väggen av rektusmanteln).
- För att säkra röret vid djuren tillbaka, försiktigt roTata djuret på buken. Sätt in den metalliska ankars subkutan del i det interscapulära snittet. ( Figur 12 ) Använd en 6-0 sutur för att säkra röret och ankare genom att omsluta dem med en vertikal madrass sutur.
- Se till att en limbubbla förblir över och under huden för att förhindra att röret släpper ut. Skär röret ungefär 2 cm över huden.
- Sätt försiktigt in 30-gaugepluggen (steg 1.1.5) i rörets ände för att förhindra att urinen läcker ut.
- Injicera 0,5 ml 0,9% NaCl subkutant för hydratisering. Ge postoperativ analgesi omedelbart efter operation och behåll i 48 timmar.
- Placera djuret tillbaka i buret under en infraröd lampa. Behåll konstant observation tills djuret rör sig fritt omkring buret.
- Övervaka djuret dagligen och låt det återhämta sig i 5 dagar före inspelning.
2. Vakna CystOmetry inspelning
- Förberedelse av inspelningsprogram, tryckgivare och infusionspump.
- Innan du bedövar djuret, anslut infusionspumpen, tryckgivaren och 22 G-svängningen med PE50-rör. ( Figur 6 )
- Öppna inspelningsprogrammet (se tabell med material för ett exempel), på en dator för att kalibrera systemtrycket och förbereda inspelningen. Se till att du använder samma inställningar under kalibrering och inspelning.
- Fyll en 20 ml spruta med 10-15 ml rumstemperatur 0,9% NaCl och sätt in i infusionspumpen. Programmera pumpen för infusion med en hastighet av 0,6 ml / h.
- Säkra tryktransducern i samma höjd som djurets blåsa eller botten på inspelningskorgen.
- Fäst 22-gauge-svängaren till änden av tryckgivaren (PE50-rör - tryckgivare till svängning)
OBSERVERA: Svängaren används för att förhindra att röret vrider eller knyter aS flyttar djuret. - Fortsätt sprutpumpen för att spola 0,9% NaCl genom systemet. Se till att ta bort alla luftbubblor före kalibrering.
- När inspelningsprogrammet körs, använd en linjal för att kalibrera trycket (cm / H 2 O). Långsamt flytta änden av PE50-tältet från 0 till 30 cm. Justera noll om det behövs.
OBS: 0 cm-märket bör ligga i samma höjd som golvet i inspelningsburet och tryckgivaren.
- Stäng 22-gauge-svängen ovanför mitten av inspelningsburet. Se till att bottenbunken gör att urinen faller på uppsamlingsanordningen av balansen placerad under buret. Justera töjningshöjden så att musen fritt kan röra sig runt buret utan att spänna eller sträcka röret. ( Figur 7 )
- När du är klar kontrollerar du att systemet och den yttre PE50-rören är fulla med 0,9% NaCl och alla luftbubblor har tagits bort.
- PrepAration av djuret för inspelning
- Bedöda djuret med 2% inandad isofluran och placera den på buken. Ta bort 30-gaugepluggen och skjut PE10-röret (blåskateter) i slutet av PE50-tätningen. Använd hett lim för att bilda en vattentät tätning.
- Stäng av anestesi och placera djuret i inspelningsburet med ett parallellt trådgolv, vilket gör att urinen faller direkt på en uppsamlingsanordning placerad ovanpå en analytisk balans. ( Figur 7 )
- Starta inspelningen när djuret befinner sig i buret, men börja inte införa. Övervaka djuret tills det helt återhämtar sig från anestesen. När blåsertrycket stabiliseras börjar man införa 0,9% NaCl med en hastighet av 0,6 ml / h.
OBS! Gör en anteckning i inspelningsprogrammet när några ändringar görs. Det är viktigt att registrera när infusionen startar, slutar eller oregelbundenhet uppstår. - Kontrollera systemet för läckage och se till att djuret har lätt accEss till mat och vatten.
- Fortsätt spela in i ett tyst rum tills tre reproducerbara miktureringscykler erhålls.
OBS! Djuren ska vara helt ostörd under hela inspelningen. Använd helst fjärrvaktövervakning för att observera beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det fanns ingen signifikant skillnad mellan slangmaterialen och diametrarna i konsistensen av tryckhöjning och faller inom systemet under rörlockering. Blåsväggen svullnad efter intravesikal rörimplantation var signifikant för både polyeten (PE) och polyuretan (PU) material. På dag 2 utvecklades allvarlig submukosal svullnad. Det upptog halva tvärsnittet av blåsan vilket ledde till obstruktion av lumenet. På dag 5 löste ödemet fullständigt och lämnade de submukosala områdena infiltrerade med inflammatoriska celler som delvis invaderade muskulären. På dag 7 reducerades den inflammatoriska infiltrationen avsevärt och blåsväggen histologi återvände till normal ( Figur 8 ). Den största delen av vävnadssvullnad observerad på dag 2 och dag 3 korrelerade med beteendestörande data som visade signifikant nedsatt blåsfunktion ( Figur 9 ). Voiding frekvens normaliserad av po St operative dag 5.
Intravesikt tryck i en vaken, fritt rörlig mus (med minsta rörelseartefakter) kännetecknas av ett baslinjetryck på 10-15 cm H2O, vilket kan förbli oförändrat eller gradvis öka med högst 10 cm H2O under fyllningscykeln , Följt av en plötslig, pulsatil tryckökning och därefter droppe under borttagning (figurerna 10 och 11 ).
Figur 1: PE10-slang för implantation i urinblåsan. ( A ) En 7 cm PE10-rör med droppar varm lim vid 4,5, 5 och 5,5 cm från den utsträckta änden. ( B och C ) En detaljerad bild som visar rörets utsträckta ände (används för att säkra röret i urinblåsan).Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Plugg för den yttre delen av PE10-bladröret. Pluggen är tillverkad av en 30 G nål och varmt lim. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Körning av urinblåsan. Schematisk linje ritning som visar placeringen av röret genom buken och dess subkutan väg mot nacken. Vänligen klicka här för att se en störreVersion av denna figur.
Figur 4: Jämförelse mellan blåsor / slangar och steg som används för att infoga och säkra röret med hjälp av en löst monofilamentsutur. Intraoperativa fotografier som visar: ( A ) Bild som jämför PE50 och PE10 med en urinblåsan från musen. ( B ) En liten slinga av 6-0 monofilament sutur placeras runt blåsan. Ett par # 5 mikroforceps klämmer fast kupolen i blåsan medan en 21 G nål används för att göra cystotomin. ( C ) Utan att släppa blåsans kupel sondar ett par # 5 mikroforceps i motsatt hand i hålet innan man sätter in PE10-katetern. ( D ) PE10-kateter fäst i blåsans kupol med 6-0 monofilament sutur. Vänligen klicka härFör att se en större version av denna figur.
Figur 5: En Purse String Suture kan användas som en alternativ metod för att säkra röret i urinblåsan. ( A ) Halsbandssuture i blåsans kupol. ( B ) PE10-rör insatt genom ett centrum av handväskan. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 6: Experimentell inställning. Spruta innehållande 0,9% NaCl i infusionspumpen ansluten i serie till tryckgivare och intravesikal kateter. Dataskärmen längst ned till höger visar tre reproducerbara mictUritionscykler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 7: Experimentell inspelningsinställning. ( A ) 22 G svängbart upphängt över en inspelningsbur och balans. ( B ) Fotografi som visar hela längden på infusionsrörets yttre del med en 22 G svivel och en PE50-tätare. ( C ) En 22 G svängbar med en fjäderhylsa täckande PE50 slang. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 8: Histologisk utvärdering av ReSpon av urinblåsans vägg till en implanterad PE10-rör. Tvärsnitt av urinblåsan färgad med hematoxylin och eosin (H & E) före, 2, 3, 5 och 7 dagar efter operationen. Bladväggen svullnad löst på postoperativ dag 5. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 9: Funktionsblåsutvärdering med hjälp av Voiding Spot-analys. Urinfläckar på filterpapper betraktat med UV-ljus som dokumenterar det representativa micturitionsmönstret på dag 0 (före rörimplantat), 2, 3, 4, 5 och 7 post-intravesikalt rörimplantat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 10: Cystometrogram. Representativt spår av intravesikalblåstryck i en vaken, fritt rörlig mus. Spår som visar 3 reproducerbara micturitionscykler. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 11: Mikturitionsfas. Spår som avbildar mikturfasen med högfrekventa oscillationer under den initiala ökningen av tryck, topptryck och ett snabbt tryckfall till baslinjen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 12: Förankring av tetheren. ( A ) Ankar används för att fästa PE10-katetern i djuret och förhindra att röret pulserar på blåsan. Skivan är fäst vid fjädermanteln. ( B ) Intern PE10-kateter ansluten till det yttre PE50-röret. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 13: Swivel Anchor. Subkutan del av ankaren bestående av ( 1 ) en skiva gjord av tyg och ( 2 ) en metallslinga.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal material och storlek på intravesikalröret
För att bestämma vilken effekt tubdiametern har på tryckinspelningar testade vi olika mikrofluidiska rör; PE50 (0,58 mm ID), polyuretan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) och PE10 (0,28 mm ID). För varje rör registrerades tryck med infusionspumpen som kördes vid 1 ml / h, medan röret rör sig snabbt vertikalt från 0 till 30 cm. Initiala in vivo-försök försökte använda PE50-rör, men misslyckades på grund av rörets storlek jämfört med musblåsan ( Figur 4A ). Även om detta stöder upptäckten av Smith och Kuchel, som föreslår att man använder PE50-rör för vaken cystometri i en mus skapar artefakter, vilket gör det svårt att tolka data. 12 Det är viktigt att notera att andra framgångsrikt har använt PE50-rör i både vakna icke-begränsade , Vaken fasthållen och bedövad muscystometri. 9 , <Sup class = "xref"> 13 , 14 Jämfört med PE50 är PE10 mer flexibel, vilket minskar mängden spänning röret applicerar på blåsan när musen rör sig, vilket reducerar rörelseartefakter. Det är viktigt att sektionen av PE10 är så kort som möjligt (≤ 7cm). Längre PE10-rör leder till större sannolikhet för att tryckavläsningen kommer att dämpas. Även om det finns en teoretisk fördel att använda ett mjukare, mer biologiskt inert material som PU för intravesikal implantation för att minska inflammatorisk reaktion, resulterade det inte i någon signifikant skillnad i postoperativ blåsans svullnad. Vidare var försök som använde den mjukare PU-tuben associerade med kinkning och pluggning.
Effekter av operation på blåsans väggkontraktilitet och svullnad
Hittills var uppgifter om blåsfunktion och svullnad i urinväggen, efter implantat av ett intravesiskt rör, endast tillgängliga för råttor. Enligt tidigare sTudies, micturitionsvolymen var lägre och mikturitionsfrekvensen var högre vid postoperativa dagar 1 - 3. 15 Det visades också att förändringar i blåsans funktion hos en råtta var förknippade med svår svullnad i blåsan, med ödem börjar dämpas efter 3 dagar. 16 För att få en bättre förståelse för förändringen i urinblåsfunktionen, svullnad i urinblåsan och reparation av tidslinjen för manliga, C57BL / 6-möss, som uppstår vid implantering av PE10-slang, var 12-timmars beteendevridningsfrekvens bedömd med hjälp av filterpappersinspelningsmetoden . Efter den sista inspelningen bedövades musen och blåsan analyserades, skördades, fixerades och utvärderades histologiskt. Vid postoperation dag 1 och 2 sjönk felfrekvensen och spottning följt av en ökning av voiding vid dag 3. Voiding beteende normaliserad vid dag 5. Brutto utvärdering av blåsor vid skörd och efter H & E-färgning avslöjade den största mängdenAv suburotelial svullnad på postoperativ dag 2 och 3, med blåsor som liknar kontrollblåsorna vid dag 5 och 7 efter rörimplantatet.
Liksom kliniska urodynamiska studier använde de flesta laboratorierna rumstemperatur 0,9% NaCl. 11 Infusionshastigheten i tidigare studier varierar signifikant från 10 μl / min till 100 μl / min. 17 , 18 En studie som jämförde effekterna av olika infusionshastigheter på blåsfunktionen hos en mus har inte gjorts, men data som erhållits i större djurstudier rekommenderade att långsammare fyllningsgrader ska användas. På grund av den lilla volymen av musblåsan är peristaltiska pumpar inte lämpliga och en kontinuerlig mekanismens infusionspump är nödvändig.
De mest exakta och användbara FC-inspelningarna balanserar god transmittans av förändringar i tryck med begränsade artefakter. De erhållna resultaten med användning avEtt kort segment av PE10-rör ansluten direkt till PE50 gav en noggrann mätning av trycket i urinblåsan från musen. Tryckfluktuationer orsakade av djurrörelse kan begränsas genom att förankra röret i huden vid den punkt där den går ut i nacken ( fig 12 och 13 ). Detta kan uppnås med användning av limbubblor och ett speciellt ankare bestående av en metallplastbelagd plåt placerad subkutant och det yttre stycket som är fäst vid metallfjädern som täcker röret. Ytterligare metoder för att hindra röret från att dra på blåsan innefattar att skapa ett böjt subkutant spår för den inre delen av PE10-röret, vilket ger slak i röret och med en sväng och tätning som förhindrar vridning och knäböjning. Baserat på litteraturen och bevis som tillhandahålls av dessa studier rekommenderas följande steg för att ge den mest reproducerbara och fysiologiskt korrekta metoden för in vivoInspelning av intravesiskt tryck i en mus. Använd ett operationsmikroskop och mikrokirurgiska verktyg för att implantera katetern i kupolen i urinblåsan. Tillåt en 5 dagars återhämtningsperiod mellan operationen och inspelningen. Acclimate djuret i samma bur som inspelningen kommer att utföras i och ge fri tillgång till mat och vatten. Utför experimentet i en lugn miljö med minimal mänsklig kontakt, använd helst fjärrövervakning för att observera djurets beteende.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
