Summary
Denne undersøgelse beskriver de kirurgiske procedurer og eksperimentelle teknikker til at udføre vågen cystometri i en frit bevægende mus. Derudover giver den eksperimentelle beviser til støtte for optimering og standardisering.
Abstract
Awake-fyldecystometri er i lang tid blevet brugt til at evaluere blærefunktionen hos frie bevægelige mus, men de specifikke metoder, der anvendes, varierer blandt laboratorier. Målet med denne undersøgelse var at beskrive den mikrokirurgiske procedure, der blev anvendt til at implantere et intravesisk rør og den eksperimentelle teknik til registrering af urinblæretryk i en vågen, frit bevægende mus. Derudover er eksperimentelle data præsenteret for at vise, hvordan kirurgi, såvel som slangetype og -størrelse, påvirker nedre urinvejsfunktion og optagelsesfølsomhed. Virkningen af rørdiameter på trykoptagelse blev vurderet i både polyethylen- og polyurethanrør med forskellige indre diametre. Derefter blev det bedst udførte rør fra begge materialer implanteret kirurgisk i kuplen af urinblæren af han C57BL / 6-mus. Tolv timers miktureringsfrekvens blev optaget i raske, intakte dyr og dyr 2, 3, 5 og 7 dage efter operationen. Ved høst, blærer wEre vurderet for tegn på hævelse ved hjælp af bruttobservation og blev derefter behandlet til patologisk analyse. Det største omfang af hævelse i blæren blev observeret på dag 2 og 3, hvilket korrelerede med adfærdsmæssig voiding-data, der viste signifikant nedsat blærefunktion. Ved dag 5 havde blærehistologi og voiding frekvens normaliseret. Baseret på litteratur og evidens fra vores undersøgelser foreslår vi følgende trin for in vivo optagelse af intravesisk tryk og voided volumen i en vågen mus: 1) Udfør operationen ved brug af et operationsmikroskop og mikrokirurgiske værktøjer. 2) Brug polyethylen-10 Slanger for at minimere bevægelsesgenstande, og 3) Udfør cystometri på postoperativ dag 5, når blærens hævelse løser.
Introduction
Fyldning af cystometri (FC) er en diagnostisk metode, der involverer at placere et kateter i urinblæren for at optage tryk under langsom blærefyldning. Først introduceret i 1927 som en klinisk diagnostisk metode til evaluering af nedre urinvejsfunktion, har den været anvendt i vid udstrækning. 1 I forskningsapplikationer kan FC bruges til at teste blærefunktionen i raske og syge dyremodeller og at studere virkningerne af farmakologiske midler. Gnagere dyremodeller bruges ofte til at undersøge nedre urinvejsfunktion. 2 I denne gruppe af pattedyr blev FC først udviklet til brug hos rotter. 3 Her er metoden til at implantere et rør ind i urinblæren og udføre FC blevet godt beskrevet og anvendt af mange forskere med et acceptabelt niveau for reproducerbarhed. 4 Tilgængeligheden af transgene og knock out stammer gør mus en værdifuld art for mange forskningsområder,Herunder området for nedre urinvejs dysfunktion. Metoden anvendt til at udføre musecystometri varierer betydeligt mellem laboratorier, hvilket gør det vanskeligt at sammenligne resultater. 5
Sammenlignet med ex vivo- modeller bevarer FC lavere urinvejsanatomi, hvilket gør det muligt at vurdere den koordinerede funktion mellem blæren og dens udløb under opbevarings- og voidingfasen af mikturcyklussen. Tidligere undersøgelser viser, at mange, almindeligt anvendte anæstetika undertrykker mikturitionssammentrækning. Agenter, der bevarer urinblærens glatte muskelkontraktion (urethan, α-chloralose, ketamin og xylazin), som gør det muligt for myret at mure, reducerer stadig funktionel blærekapacitet og undertrykker neurotransmission. 6 , 7 , 8 , 9 Selvom teknisk mere udfordrende udførte FC i awAke ambulerende dyr bevarer den funktionelle integritet af micturitionsrefleksen.
Nedre urinvejsfunktion påvirkes af flere faktorer, herunder postoperativ blærevægssvulmen, stress på grund af smerte og ubehag og miljøpåvirkninger. Ved brug af en kirurgisk teknik, der minimerer vævsskade under rørimplantation og optagelsesmetoder, der reducerer rørbevægelsen, samtidig med at dyret kan ambulere frit, er det vigtigt at opnå nøjagtige og reproducerbare optagelser.
Hvis det udføres tilstrækkeligt, in vivo FC i fritflytende dyr kan levere data, der pålideligt afspejler fysiologisk blærefunktion. 10 FC i fritflytende dyr kan give data om følgende parametre; Basal eller baseline tryk: Mindste tryk mellem to micturitions. Intermicturition press: Mean tryk mellem to micturitions. Tærskeltryk: Intravesisk tryk immEdiately før micturition. Maksimalt tryk: Maks. Blæretryk i løbet af en mikturcyklus. Spontan aktivitet (eller mellemliggende oscillerende tryk mellem intermicturition): Intermicturitionstryk minus basaltryk. Ikke-voidende sammentrækninger: Forøgelse af intravesikalt tryk i fyldningsfasen, der ikke er forbundet med frigivelse af væske. Blæreoverholdelse: Blærekapacitet divideret med tærskeltryk minus basaltryk. Mikturitionsfrekvens: Antal micturitions pr. Tidsenhed. Intermicturitionsinterval: Periode mellem to maksimale lufttryk. Blærekapacitet: Infunderet volumen divideret med antallet af mikturer. En detaljeret beskrivelse af disse parametre og standardiseret terminologi er tidligere offentliggjort. 11
FC kan udføres under anvendelse af en intravenøs infusionsmetode med kontinuerlig eller enkelt cyklus. Kontinuerlig cystometri gør det muligt at optage flere mikturcykler og vælge repræsentativ databaseretOm reproducerbarhed. Dens nøjagtighed ved måling af blærekapacitet er begrænset på grund af det ukendte restvolumen. Derudover er det udfordrende at samle små voluminerede volumener (som er baseret på belastning og køn varierer mellem 30 og 184 μL) i frit ambulerende mus. Brug af denne metode til optagelse af volumen er mindre nøjagtigt sammenlignet med et bedøvet præparat, men det er overlegent, fordi det undgår de bedøvende virkninger af anæstetika på blærefunktionen. Enkeltcykluscystometri bør anvendes til at vurdere blærekapacitet. Ved denne metode tømmes blæren ved aspiration før infusion, og kapaciteten beregnes som en funktion af infusionshastigheden multipliceret med tiden til det maksimale tryk.
Selvom teknikken til udførelse af cystometri i små gnavere er blevet offentliggjort, beskrev den operationen udført i en rotte og anbefalede at muscystometri skulle udføres under urethananæstesi. 10 Formålet med denne meddelelse er tO beskriver både de mikrokirurgiske teknikker, der anvendes til at implantere et intravesikalt rør ind i urinblærens kuppel og den eksperimentelle opstilling, der anvendes til at registrere nedre urinvejsfunktion in vivo under kontinuerlig blærefyldning og mikturion i en vågen, frit bevægende mus. Derudover blev der udført eksperimenter for at angive, hvordan rørlængde, diameter og materiale samt metoden til at udføre in vivo FC påvirker optagelsen. Denne eksperimentelle protokol opsummerer tidligere offentliggjorte teknikker og foreslår en række ændringer baseret på eksperimentelle resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr blev anbragt i University of Vermont Animal Care Facility i henhold til institutionelle retningslinjer. Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med National Institutes of Health guide til pleje og brug af forsøgsdyr.
1. Intravesical Tube Implantation
- Forberedelse af slanger og instrumenter til den kirurgiske procedure
- Skær et 7 cm stykke PE10 rør for at gøre kateteret til implantation.
- Lav en flare i den ene ende af PE10-røret ved langsomt at fremme slutningen mod en åben flamme.
BEMÆRK: Tag straks røret ud, så snart blusen udvikler sig. - Påfør 3 dråber almindelig varm lim ved hjælp af den lave varmeindstilling på en limpistol, 4,5, 5 og 5,5 cm fra den udfladte ende på ydersiden af PE10-røret. Disse vil hjælpe med at sikre røret på dyrets ryg. ( Figur 1 )
- Steriliser slangen ved at blødgøre den i 70%Ethanol og derefter skylle det med sterilt 0,9% NaCl før brug. Lad røret fyldes for at undgå at indføre luftbobler ind i systemet.
- Opret en 30-gauge stik for at forsegle enden af PE10 kateteret ved at adskille en 30-gauge nål fra navet ved manuelt at manipulere den proximale ende side til side. Påfør en dråbe varm lim til enden. Sørg for, at forseglingen er vandtæt. ( Figur 2 )
- Brug følgende mikrokirurgiske instrumenter: To par Dumont # 7 buede mikroforceps, to par Dumont # 5 buede mikroforceps, en 21 G nål, ultrafine lige hæmostat, mikro saks, små dissecting saks og en mikro nålholder.
- Steriliser alle instrumenter, før proceduren startes.
- Forberedelse af dyret
- Efter bedøvelse af dyret skal du først barbere den nedre halvdel af underlivet og derefter dreje dyret mod og barbere og rense området på den øvre del af ryggen med 70% alkohol efterfulgt af betadin. Påfør vetens salve til øjnene for at undgå tørhed. Brug derefter et par lige, stumme saks og par Dumont # 7 buede mikroforceps for at lave et 1,5 cm langt hudindsnit mellem scapulae og placere dyret liggende oven på en varmepude (37 ° C) dækket med sterile gardiner.
- Endelig, rengør abdomen med alkohol og betadin.
- Kirurgisk procedure
BEMÆRK: Udfør alle kirurgiske procedurer under et driftsmikroskop med forstørrelse fra 3,15X til 20X. Når du har lagt dyret på de sterile gardiner, skal du sætte på sterile handsker. Fortsæt med at anvende sterile procedurer gennem hele operationen.- Anbring dyret i en induktionsboks og bedøv den ved anvendelse af 2% inhaleret isofluran med en oxygenbærer (1 liter / min). Vedligehold anæstesi gennem hele proceduren ved at placere dyrets hoved i en næse kegle og anvende 2% inhaleret isofluran med en oxygenbærer (1 l / min). Start operationen efter at have modtaget en negAtivt svar fra tåhårstesten.
- Brug et par lige, stumme saks og par Dumont # 7 buede mikroforceps til at lave et 1,5 cm lavere, midtergående abdominal snit gennem huden. Derefter skabes et matchende snit gennem fascia langs linea alba og muskler for at udstille kuplen og øvre halvdel af urinblæren. Undgå at skade blæren ved at anvende opadgående trækkraft på hvert vævslag ved hjælp af et par Dumont # 7 buede mikroforceps. Hold mavesekken fra udtørring ved at tilføje dråber varm fysiologisk saltvand.
- Drej dyret på sin side for at få adgang til snittet på nakken. Skub en smal hemostat subkutant gennem snittet. Den subkutane kanal skal starte på bagsiden og fortsætte langs siden.
- Når spidsen af instrumentet når bunden af ribbenburet, drej spidsen mod midterlinjen og indersiden af maven (der vil være en lille pop, når man gennembler mavemusklerne). Fortsæt fremad med hæmostaten, indtil spidsen er eksponeret ved mavens indsnit under muskulaget. ( Figur 3 )
- Tag fat i den "ikke-flared" ende af slangen med hæmostaten og træk langsomt værktøjet ud, og træk enden af røret ud gennem snittet bag på halsen. Juster rørets udvidede ende, så den ligger direkte over blærens kuppel.
- Lav en løs slips med 6-0 monofilament sutur (ikke-absorberbar) og læg den oven på blærekuppelen. Denne slips vil blive brugt senere for at sikre slangen i blæren.
- Placer en lille rulle lintfri væv i maven og bag blæren for at hjælpe med at stabilisere og hæve det.
- Forbered dig på at indsætte den udvidede ende af PE10-kateteret ind i blæren.
- I den ikke-dominerende hånd skal du holde blærenes kuppel med Dumont # 7 buede mikroforceps og opretholde dette greb, indtil kateteret er placeret i blæren.
- Brug en 21 gauge nål tO lave en cystotomi i toppen af kuplen Sond forsigtigt cystotomi med et lukket par # 5 buede mikroforceps for at sikre kateteret let kan passere gennem hullet.
- Mens du stadig holder blærekuppelen i den ikke-dominerende hånd, skal du placere den blussede ende af PE10-kateteret i blæren (skub blussen ned til blærehalsen, så den ikke glider ud, mens den sikres).
- Bind 6-0 monofilament suturen omkring blærens kuppel og rør med slipset anbragt forreste for slangen. Sørg for at binde suturen så højt som muligt på blæren for at undgå kunstigt at reducere blærekapaciteten. ( Figur 4 )
- Alternativt skal kateteret sikres ved hjælp af en sutur i pungestrengen som følger. Lav en løs pung streng sutur på blærenes kuppel ved hjælp af 6-0 monofilament. Følg trin 1.3.8.1 - 1.3.8.3 for at udføre cystotomi og indsæt kateteret. Fastgør røret ved at binde pungstrengens sutur. ( Figur 5 )
- Test patency og tætning af røret i blæren ved at fastgøre en 0,5 ml insulin sprøjte med en 30 gauge nål til den distale ende af røret. Fyld blæren langsomt med 0,1-0,2 ml 0,9% NaCl, indtil der kommer en dråbe på urinrøret og tøm blæren ved aspiration. Det er vigtigt, at blæren både kan fyldes og tømmes.
- Hvis der ikke opstår lækkeri i kuppelen, skal du bøje blæren med et par buede mikroforceps og trække forsigtigt på slangen indtil flare hviler mod indersiden af blærekuppelen.
- Før lukning skal du fjerne den lille rulle væv og sørge for, at blæren er i normal position.
- Luk mavevæggen i to lag (muskel og hud) med 6-0 løbende sutur. Det er bedre at approximere rectus abdominis muskel ved at sutere kun kanterne af den forreste abdominale fascia (den forreste mur af rectuskappen).
- For at sikre slangen til dyrene tilbage, blidt roTate dyret på sin mave. Indsæt den subkutane del af metalankeret i det interskapulære snit. ( Figur 12 ) Brug en 6-0 sutur til at sikre røret og ankeret ved at omkredse dem med en vertikal madras sutur.
- Sørg for, at en limboble forbliver over og under huden for at forhindre røret i at trække ud. Klip røret ca. 2 cm over huden.
- Sæt forsigtigt 30-gauge-stikket (trin 1.1.5) ind i enden af røret for at forhindre, at urinen lækker ud.
- Injicer 0,5 ml 0,9% NaCl subkutant til hydratisering. Giv postoperativ analgesi umiddelbart efter operation og opretholde i 48 timer.
- Placer dyret tilbage i sit bur placeret under en infrarød lampe. Bevar konstant observation, indtil dyret bevæger sig frit rundt om buret.
- Overvåg dyret dagligt og lad det genoprette i 5 dage før optagelse.
2. vække cysteOmetry optagelse
- Forberedelse af optagelsesprogrammet, tryktransduceren og infusionspumpen.
- Før anæstetisering af dyret skal du forbinde infusionspumpen, tryktransduceren og 22 G drejning ved hjælp af PE50 rør. ( Figur 6 )
- Åbn optagelsesprogrammet (se tabel over materialer til et eksempel) på en computer for at kalibrere systemtrykket og forberede optagelsen. Sørg for at bruge de samme indstillinger under kalibrering og optagelse.
- Fyld en 20 ml sprøjte med 10-15 ml stuetemperatur 0,9% NaCl og læg ind i infusionspumpen. Program pumpen til infusion med en hastighed på 0,6 ml / h.
- Fastgør tryktransduceren i samme højde som dyrets blære eller bunden af optagekassen.
- Fastgør 22 gauge drejeren til enden af tryktransduceren (PE50 - rør - tryktransduceren til drejning)
BEMÆRK: Drejeren bruges til at forhindre røret i at dreje eller knække aS bevæger dyret sig. - Før sprøjtepumpen for at skylle 0,9% NaCl gennem systemet. Sørg for at fjerne alle luftbobler inden kalibrering.
- Når optagelsesprogrammet kører, skal du bruge en linjal til at kalibrere trykket (cm / H 2 O). Flyt langsomt enden af PE50 tetheren fra 0 til 30 cm. Indstil nulet, hvis det er nødvendigt.
BEMÆRK: 0 cm-mærket skal være i samme højde som gulvet i optagekassen og tryktransduceren.
- Suspension 22-gauge drejning over midten af optageburet. Sørg for, at burbunden gør det muligt for urinen at falde på opsamlingsanordningen af balancen placeret under buret. Juster tøjets højde, så musen frit kan bevæge sig rundt i buret uden at strække eller strække slangen. ( Figur 7 )
- Når du er færdig, skal du kontrollere, at systemet og det eksterne PE50-rør er fyldt med 0,9% NaCl, og alle luftbobler er blevet fjernet.
- ForberedDyrkning af dyret til optagelse
- Bedøve dyret med 2% inhaleret isofluran og læg det på sin mave. Fjern 30-gauge stikket og skub PE10 slangen (blærekateter) ind i enden af PE50 tetheren. Brug varm lim til at danne en vandtæt forsegling.
- Sluk anæstesien og læg dyret i optagekassen med et parallelt trådgulv, hvilket gør det muligt for urinen at falde direkte på en samleanordning placeret oven på en analytisk balance. ( Figur 7 )
- Start optagelsen, når dyret er i buret, men start ikke med infusionen. Overvåg dyret, indtil det fuldt ud vender sig fra bedøvelsen. Når blæretrykket stabiliseres, begynder man at inficere 0,9% NaCl i en hastighed på 0,6 ml / h.
BEMÆRK: Lav en note i optagelsesprogrammet, når der foretages ændringer. Det er vigtigt at registrere, hvornår infusionen starter, stopper eller uregelmæssigheder opstår. - Kontroller systemet for lækager og sørg for at dyret har let adgangEss til mad og vand.
- Fortsæt optagelse i et roligt rum, indtil der opnås tre reproducerbare mikturcykler.
BEMÆRK: Dyret skal være fuldstændig uforstyrret gennem hele optagelsen. Brug fortrinsvis fjern videoovervågning til at observere adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Der var ingen signifikant forskel mellem rørmaterialerne og diametrene i konsistensen af trykstigning og falder inden for systemet under rørtilslutning. Blærevæske hævelse efter intravesical tube implantation var signifikant for både polyethylen (PE) og polyurethan (PU) materialer. På dag 2 udviklede alvorlig submukosal hævelse. Det optog halvdelen af blærens tværsnit, hvilket fører til obstruktion af lumen. På dag 5 besluttede ødemet fuldstændigt og efterlod de submukosale områder infiltreret med inflammatoriske celler, der delvis invaderede muskulæren. På dag 7 blev den inflammatoriske infiltration reduceret signifikant, og blærevægshistologien vendte tilbage til normal ( figur 8 ). Det største omfang af vævsopsvulmning observeret på dag 2 og dag 3 korrelerede med adfærdsmæssig voiding-data, der viste signifikant nedsat blærefunktion ( figur 9 ). Voiding frekvens normaliseret af po St operative dag 5.
Intravesikalt tryk i en vågen, frit bevægende mus (med minimale bevægelsesgenstande) er karakteriseret ved et baseline tryk på 10-15 cm H20, som kan forblive uændret eller gradvist stige med højst 10 cm H20 under fyldningscyklussen , Efterfulgt af en pludselig, pulserende trykforøgelse og dernæst fald under oprivning ( fig. 10 og 11 ).
Figur 1: PE10 slange til implantation i urinblæren. ( A ) En 7 cm PE10-rør med dråber varm lim ved 4,5, 5 og 5,5 cm fra den flaredende ende. ( B og C ) Et detaljeret billede, der viser rørets fladende ende (bruges til at sikre slangen i blæren).Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Venligst klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Stik til den eksterne del af PE10-blæren. Stik er lavet af en 30 G nål og varm lim. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Kursus af blærerør. Skematisk linjetegning, der illustrerer placeringen af slangen gennem maven og dens subkutane rute mod nakken. Klik her for at se en størreVersion af denne figur.
Figur 4: Sammenligning af blære / slange og trin, der bruges til at indsætte og fastgøre røret ved hjælp af en lose monofilament sutur. Intraoperative fotografier, der skildrer: ( A ) Billede sammenligner PE50 og PE10 med en mus urinblære. ( B ) En lille sløjfe med 6-0 monofilament sutur anbragt omkring blæren. Et par # 5 mikroforceps klemmer blærens kuppel, mens en 21 G nål bruges til at fremstille cystotomi. ( C ) uden at frigive blærenes kuppel, prober et par # 5 mikroforceps i den modsatte hånd hullet, inden der sættes i PE10 kateteret. ( D ) PE10-kateter fastgjort i blærenes kuppel med 6-0 monofilament sutur. Venligst klik herFor at se en større version af denne figur.
Figur 5: En Purse String Suture kan bruges som en alternativ metode til sikring af røret i blæren. ( A ) Purse streng sutur i blærenes kuppel. ( B ) PE10 rør indsat gennem et center af pungestrengen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Eksperimentel opsætning. Sprøjte indeholdende 0,9% NaCl i infusionspumpen forbundet i serie til tryktransduceren og intravesisk kateter. Computer skærmen nederst til højre viser tre reproducerbare mictUrition cykler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 7: Eksperimentel optagelsesopsætning. ( A ) 22 G drejning suspenderet over et optage bur og balance. ( B ) Fotografi, der viser hele længden af den eksterne del af infusionsslangen med en 22 G drejning og en PE50 tether. ( C ) En 22 G drejning med en fjeder kappe dækker PE50 rør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 8: Histologisk evaluering af ReSponse af urinblærevæggen til en implanteret PE10 rør. Tværsnit af urinblæren farvet med hæmatoxylin og eosin (H & E) før, 2, 3, 5 og 7 dage efter operationen. Blærevægs hævelse løst på postoperativ dag 5. Klik venligst her for at se en større version af denne figur.
Figur 9: Funktionsblæreevaluering ved hjælp af Voiding Spot Assay. Urinpletter på filterpapir set med UV-lys, der dokumenterer det repræsentative micturitionsmønster på dag 0 (før rørimplantat), 2, 3, 4, 5 og 7 post-intravesisk rørimplantat. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 10: Cystometrogram. Repræsentativt spor af intravesikal blæretryk i en vågen, frit bevægende mus. Spor der viser 3 reproducerbare mikturcykler. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 11: Mikturitionsfase. Spor, der viser miktureringsfasen med højfrekvente svingninger under den indledende stigning i tryk, toptryk og et hurtigt trykfald til baseline. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 12: Forankring af tetheren. ( A ) Anker bruges til at sikre PE10-kateteret i dyret og forhindre røret i at pulse på blæren. Disken er fastgjort til fjederkappen. ( B ) Intern PE10-kateter forbundet til det eksterne PE50-rør. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 13: Drejeanker. Subkutan del af ankeret bestående af ( 1 ) en skive fremstillet af stof og ( 2 ) en metalsløjfe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal materiale og størrelse af intravesical tubing
For at bestemme effekten af rørdiameteren på trykoptagelser, testede vi forskellige mikrofluidiske rør; PE50 (0,58 mm ID), polyurethan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) og PE10 (0,28 mm ID). For hvert rør blev der registreret tryk, mens infusionspumpen kørte ved 1 ml / time, mens røret hurtigt bevægede sig vertikalt fra 0 til 30 cm. Initielle in vivo forsøg forsøgte at anvende PE50 slange, men var mislykkede på grund af slangenes størrelse sammenlignet med musblæren ( Figur 4A ). Selvom dette understøtter Smiths og Kuchels opfattelse, der foreslår at bruge PE50-slanger til vågen cysteometri i en mus, skaber artefakter, hvilket gør det vanskeligt at fortolke dataene. 12 Det er vigtigt at bemærke, at andre med succes har brugt PE50-slanger i begge våde, ikke-rustede , Vågen tilbageholdenhed og bedøvet musecystometri. 9 , <Sup class = "xref"> 13 , 14 Sammenlignet med PE50 er PE10 mere fleksibel, hvilket reducerer mængden af spænding, som røret anvender på blæren, når musen bevæger sig og reducerer bevægelsesgenstande. Det er vigtigt, at sektionen af PE10 er så kort som muligt (≤ 7cm). Langere PE10 slange fører til større sandsynlighed for, at trykaflæsningen bliver dæmpet. Selvom der er en teoretisk fordel at anvende et blødere, mere bio-inert materiale som PU til intravesikal implantation for at mindske den inflammatoriske reaktion, resulterede det ikke i en signifikant forskel i postoperativ blærekvældning. Yderligere forsøg, der anvendte den blødere PU slange, var forbundet med kinking og plugging.
Virkninger af operation på blærevæg kontraktilitet og hævelse
Indtil nu var data om blærefunktion og hævelse af blærevæg, postimplantat af et intravesisk rør kun tilgængelige for rotter. Ifølge tidligere sTudies, micturitionsvolumen var lavere og mikturitionsfrekvensen var højere på postoperative dage 1 - 3. 15 Det blev også vist, at ændringer i blærefunktionen hos en rotte var forbundet med svær hævelse af blæren, med ødemet, der begyndte at aftage efter 3 dage. 16 For at få en bedre forståelse for forandringen i urinblærefunktionen, hævelse af blærevæggen og reparation af tidslinjen for mænd, C57BL / 6 mus, der forekommer ved at implantere PE10-slanger, blev 12-timers adfærdsmæssig hukommelsesfrekvens vurderet ved anvendelse af filterpapiroptagelsesmetoden . Efter den sidste optagelse blev musen bedøvet og blæren blev grovt vurderet, høstet, fikseret og evalueret histologisk. På postoperation dag 1 og 2 faldt voidingfrekvensen og spotting efterfulgt af en stigning i voiding efter dag 3. Voidingadfærd normaliseret ved dag 5. Brutto evaluering af blærer ved høst og efter H & E-farvning afslørede den største mængdeAf suburothelial hævelse på postoperativ dag 2 og 3 med blærer, der ligner kontrolblærerne på dag 5 og 7 efter rørimplantatet.
I lighed med kliniske urodynamiske undersøgelser anvendte de fleste laboratorier stuetemperatur 0,9% NaCl. Infusionshastigheden i tidligere undersøgelser varierer betydeligt fra 10 μl / min til 100 μl / min. 17 , 18 En undersøgelse, der sammenligner virkningerne af forskellige infusionshastigheder på blærefunktionen i en mus, er ikke blevet foretaget, men data opnået i større dyreforsøg anbefalede, at langsommere påfyldningshastigheder bør anvendes. På grund af det lille volumen af museblæren er peristaltiske pumper ikke egnede, og en kontinuerlig mekanisme infusionspumpe er nødvendig.
De mest nøjagtige og anvendelige FC-optagelser afbalancerer god transmittans af ændringer i tryk med begrænsede artefakter. Resultaterne opnået under anvendelse afEt kort segment af PE10 slanger, der er tilsluttet direkte til PE50, tilvejebragte en nøjagtig måling af tryk i mus urinblære. Trykvariationer forårsaget af dyrebevægelse kan begrænses ved at forankre slangen til huden på det sted, hvor den kommer ud i halsen ( figur 12 og 13 ). Dette kunne opnås ved hjælp af limbobler og et specielt anker bestående af en metalplastbelagt plade placeret subkutant og det ydre stykke, der er fastgjort til metalfjederen, der dækker røret. Yderligere metoder til at forhindre røret i at trække på blæren omfatter at skabe et buet subkutant spor for den indre del af PE10-slangen, som giver slap i røret og ved hjælp af en drejning og tether, som forhindrer vridning og kinking. Baseret på litteraturen og beviser fra disse undersøgelser anbefales følgende trin at tilvejebringe den mest reproducerbare og fysiologisk præcise metode til in vivoOptagelse af intravesikalt tryk i en mus. Brug et driftsmikroskop og mikrokirurgiske værktøjer til at implantere kateteret ind i urinblærens kuppel. Tillad en 5 dages opsigelsesperiode mellem operationen og optagelsen. Acclimate dyret i samme bur, at optagelsen vil blive udført i og give fri adgang til mad og vand. Udfør eksperimentet i et roligt miljø med minimal menneskelig kontakt. Brug ideel fjernovervågning til at observere dyrets adfærd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
