Summary
Denne studien beskriver kirurgiske prosedyrer og eksperimentelle teknikker for å utføre våken cystometri i en fritt bevegelige mus. I tillegg gir den eksperimentelle bevis for å understøtte optimalisering og standardisering.
Abstract
Vakker fyllingskystometri har lenge vært brukt til å evaluere blærefunksjonen i fritt bevegelige mus, men de spesifikke metodene varierer mellom laboratorier. Målet med denne studien var å beskrive den mikrokirurgiske prosedyre som ble brukt til å implantere et intravesikalrør og den eksperimentelle teknikken for registrering av urinblæretrykk i en våken, fritt bevegelige mus. I tillegg presenteres eksperimentelle data for å vise hvordan kirurgi, samt type og størrelse av slanger, påvirker nedre urinveisfunksjon og innspillingsfølsomhet. Effekten av rørdiameteren på trykkopptak ble vurdert i både polyetylen- og polyuretanrør med forskjellige indre diametre. Deretter ble det mest utførende røret fra begge materialer implantert kirurgisk i kuppelen i urinblæren av mannlige C57BL / 6-mus. Tolv timers miktureringsfrekvens ble registrert hos friske, intakte dyr og dyr 2, 3, 5 og 7 dager etter kirurgi. Ved høsting, blærer wEre vurderes for tegn på hevelse ved bruk av brutto observasjon og ble deretter behandlet for patologisk analyse. Den største utbredelsen av blære hevelse ble observert på dag 2 og 3, som korrelerte med adferdssviktdata som viste signifikant svekket blærefunksjon. Ved dag 5 hadde blærehistologi og voiding frekvens normalisert. Basert på litteratur og bevis gitt av våre studier, foreslår vi følgende trinn for in vivo opptak av intravesisk trykk og volum i en våken mus: 1) Utfør operasjonen ved hjelp av et operasjonsmikroskop og mikrokirurgiske verktøy, 2) Bruk polyetylen-10 Slanger for å minimere bevegelsesartefakter, og 3) Utfør cystometri på postoperativ dag 5, når blærens hevelse løser.
Introduction
Fylling av cystometri (FC) er en diagnostisk metode som innebærer å plassere et kateter i urinblæren for å registrere trykk under langsom blærefylling. Først introdusert i 1927 som en klinisk diagnostisk metode for å evaluere nedre urinveiene, har den vært mye brukt. 1 I forskningsapplikasjoner kan FC brukes til å teste blærefunksjonen i friske og syke dyremodeller og å studere effekten av farmakologiske midler. Gnagerdyrmodeller brukes ofte til å undersøke nedre urinveiene. 2 I denne gruppen av pattedyr ble FC først utviklet for bruk hos rotter. 3 Her er metoden for å implantere et rør inn i urinblæren og utføre FC blitt godt beskrevet og brukt av mange forskere med et akseptabelt reproduksjonsnivå. 4 Tilgjengeligheten av transgene og utstøtende stammer gjør mus til en verdifull art for mange forskningsområder,Inkludert feltet for nedsatt urinveisdysfunksjon. Metoden som brukes til å utføre muscystometri varierer betydelig mellom laboratorier, noe som gjør det vanskelig å sammenligne resultater. 5
Sammenlignet med ex vivo- modeller, beholder FC lavere urinvektsanatomi, slik at den koordinerte funksjonen mellom blæren og utløpet under lagrings- og voidingfasen av mikturssyklusen blir vurdert. Tidligere undersøkelser viser at mange, brukte narkoser undertrykker mikturjonssammentrekning. Agenter som opprettholder urinblærens glatte muskelkontraksjon (uretan, a-kloralose, ketamin og xylazin), slik at dyret mikturerer, reduserer fortsatt funksjonell blærekapasitet og undertrykker nevrotransmisjon. 6 , 7 , 8 , 9 Selv om teknisk mer utfordrende, utførte FC i awAke ambulerende dyr bevarer den funksjonelle integriteten til mikturrefleksen.
Nedre urinveisfunksjon er påvirket av flere faktorer, inkludert postoperativ blæreveggsvev, stress på grunn av smerte og ubehag og miljøpåvirkninger. Ved hjelp av en kirurgisk teknikk som minimerer vevskader under rørimplantasjon og innspillingsmetoder som reduserer rørbevegelsen, samtidig som dyret kan ambulere fritt, er det avgjørende for å oppnå nøyaktige og reproducerbare innspillinger.
Hvis det utføres tilstrekkelig, in vivo FC i frittflyttende dyr kan gi data som på en pålitelig måte reflekterer fysiologisk blærefunksjon. 10 FC i frittflyttende dyr kan gi data om følgende parametere; Basal eller baseline trykk: Minimumtrykk mellom to micturitions. Intermicturition press: Mean press mellom to micturitions. Terskeltrykk: Intravesisk trykk immEdiately før mikturition. Maksimalt trykk: Maksimum blærtrykk under en mikturssyklus. Spontan aktivitet (eller gjennomsnittlig intermicturisjons-oscillerende trykk): Intermicturisjonstrykk minus basaltrykk. Non-voiding sammentrekninger: Økning i intravesikal trykk under fyllingsfasen, ikke forbundet med frigjøring av væske. Blæreoverholdelse: Blærekapasitet dividert med terskeltrykk minus basaltrykk. Mikturfrekvens: Antall micturitions per tidsenhet. Intermicturition Intervall: Periode mellom to maksimale lufttrykk. Blærekapasitet: Infused volum divideres med antall micturitions. En detaljert beskrivelse av disse parametrene og standardisert terminologi er tidligere publisert. 11
FC kan utføres ved bruk av en kontinuerlig eller enkelt syklus intravesikal infusjonsmetode. Kontinuerlig cystometri tillater registrering av flere mikturssykluser og valg av representativ data basertPå reproduserbarhet. Nøyaktigheten i måling av blærekapasitet er begrenset på grunn av det ukjente restvolumet. I tillegg er det utfordrende å samle små voidvolumer (som er basert på belastning og kjønn varierer mellom 30 og 184 μL) i fritt ambulerende mus. Ved å bruke denne metoden for å registrere void volum er mindre nøyaktig sammenlignet med et bedøvet preparat, men det er overlegent fordi det unngår de undertrykkende effektene av anestetika på blærefunksjonen. Enkeltcykluscystometri bør brukes til å vurdere blærekapasiteten. I denne metoden tømmes blæren ved aspirasjon før infusjon og kapasiteten beregnes som en funksjon av infusjonshastigheten multiplisert med tid til maksimalt trykk.
Selv om teknikken for å utføre cystometri i små gnagere har blitt publisert, beskrev den operasjonen som ble utført i en rotte og anbefalte at muscystometrien skulle utføres under uretanbedøvelse. 10 Målet med denne kommunikasjonen er tO beskriver både de mikrokirurgiske teknikkene som brukes til å implantere et intravesikalrør inn i urinblærens kuppel og den eksperimentelle oppsettet som brukes til å registrere nedre urinveisfunksjon, in vivo , under kontinuerlig blærefylling og mikturering i en våken, fritt bevegelige mus. I tillegg ble det utført eksperimenter for å angi hvordan rørlengden, diameteren og materialet, samt metoden for å utføre in vivo FC, påvirker opptaket. Denne eksperimentelle protokollen oppsummerer tidligere publiserte teknikker og foreslår en rekke modifikasjoner basert på eksperimentelle resultater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr ble plassert i University of Vermont Animal Care Facility i henhold til institusjonelle retningslinjer. Alle dyreforsøk ble utført i samsvar med National Institutes of Health guide for pleie og bruk av laboratoriedyr.
1. Intravesical Tube Implantation
- Forberedelse av slanger og instrumenter for den kirurgiske prosedyren
- Klipp en 7 cm PE10-rør for å gjøre kateteret til implantasjon.
- Lag en bluss i den ene enden av PE10-røret ved å sakte fremme enden mot en åpen flamme.
MERK: Trekk straks røret så snart flaren utvikler seg. - Påfør tre dråper allsidig varm lim ved hjelp av lavvarmeinnstillingen på limpistol, 4,5, 5 og 5,5 cm fra den flared ende på utsiden av PE10-røret. Disse vil bidra til å sikre røret på dyrets rygg. ( Figur 1 )
- Steriliser slangen ved å suge den i 70%Etanol og deretter skylle det med sterilt 0,9% NaCl før bruk. La røret fylle for å unngå å innføre luftbobler inn i systemet.
- Opprett en 30-gaugeplugg for å forsegle enden av PE10-kateteret ved å separere en 30-gauge nål fra navet ved å manuelt manipulere den proximale ende siden til side. Påfør en dråpe varmt lim til slutten. Pass på at tetningen er vanntett. ( Figur 2 )
- Bruk følgende mikrokirurgiske instrumenter: To par Dumont # 7 buede mikroforceps, to par Dumont # 5 buede mikroforceps, en 21 G nål, ultrafine rett hemostat, mikrosaks, liten disseksjonssaks og en mikronålholder.
- Steriliser alle instrumenter før du starter prosedyren.
- Forberedelse av dyret
- Etter anesthetisering av dyret, barber du den nedre halvdelen av magen først, og slår deretter dyret opp og barber og rengjør området på øvre del med 70% alkohol etterfulgt av betadin. Påfør vetens salve i øynene for å unngå tørrhet. Deretter bruker du et par rette, stumpe saks og et par Dumont # 7 buede mikroforceps for å lage et 1,5 cm langt hudinnsnitt mellom scapulae og plassere dyret liggende på toppen av en varmepute (37 ° C) dekket med sterile gardiner.
- Til slutt, rengjør magen med alkohol og betadin.
- Kirurgisk prosedyre
MERK: Utfør alle kirurgiske prosedyrer under et operasjonsmikroskop med forstørrelse fra 3,15X til 20X. Etter å ha plassert dyret på de sterile gardinene, sett på sterile hansker. Fortsett å bruke sterile prosedyrer gjennom hele operasjonen.- Plasser dyret i en induksjonsboks og bedøves med 2% inhalert isofluran med en oksygenbærer (1 liter / min). Opprettholder anestesi gjennom hele prosedyren ved å plassere dyrets hode i en nesekegle og bruke 2% inhalert isofluran med en oksygenbærer (1 liter / min). Start operasjonen etter å ha mottatt et negAtiv respons fra tåneknikk testen.
- Bruk et par rette, stumpe saks og par Dumont # 7 buede mikroforceps for å lage en 1,5 cm nedre, midtre bukeskjæring gjennom huden. Deretter skal du lage et samsvarende snitt gjennom fascia langs linea alba og muskel for å avsløre kuppelen og øvre halvdel av urinblæren. Unngå å skade blæren ved å bruke oppadgående trekkraft til hvert vevslag ved hjelp av et par Dumont # 7 buede mikroforceps. Hold magesekken fra torking ved å legge til dråper varm fysiologisk saltvann.
- Drei dyret på siden for å få tilgang til snittet på nakken. Skyv en smal hemostat subkutant gjennom snittet. Den subkutane kanalen skal starte på baksiden, og fortsett langs siden.
- Når spissen av instrumentet når bunnen av ribbeholderen, vri spissen mot midterlinjen og innsiden av magen (det vil være en liten pop når du går gjennom bukveggmuskulaturene). Fortsett å øke hemostaten til spissen blir eksponert ved magesnittet under muskellaget. ( Figur 3 )
- Ta tak i den "ikke-flakkede" enden av slangen med hemostat og sakte trekke verktøyet, trekker enden av røret ut gjennom snittet på baksiden av nakken. Juster rørets flared ende slik at den ligger rett over blærens kuppel.
- Lag en løs slips med 6-0 monofilament sutur (ikke-absorberbar) og legg den på toppen av blærekuppelen. Dette slipset blir brukt senere for å sikre røret i blæren.
- Legg en liten rulle lintfritt vev i magen og bak blæren for å stabilisere og heve den.
- Forbered deg på å sette den flammeende enden av PE10-kateteret inn i blæren.
- I den ikke-dominerende hånden holder du blærenes kuppel med Dumont # 7 buede mikroforceps og opprettholder dette grepet til kateteret er plassert i blæren.
- Bruk en 21-gauge nål tO gjør en cystotomi i toppet av kuppelen. Snu forsiktig cystotomi med et lukket par # 5 buede mikroforceps for å sikre at kateteret lett kan passere gjennom hullet.
- Mens du fortsatt holder blærekuppelen i den ikke-dominerende hånden, plasser den flammeende enden av PE10-kateteret i blæren (skyv blussen ned til blærhalsen slik at den ikke glir ut mens den festes).
- Fest 6-0 monofilament sutur rundt kuppelen av blæren og slangen med slipset plassert foran slangen. Pass på å knytte suturen så høyt oppe på blæren som mulig for å unngå kunstig å redusere blærekapasiteten. ( Figur 4 )
- Alternativt, sikre kateteret ved hjelp av en sokkelstreng sutur som følger. Lag en løs veske streng sutur på kuppelen av blæren ved hjelp av 6-0 monofilament. Følg trinn 1.3.8.1 - 1.3.8.3 for å utføre cystotomi og sett inn kateteret. Fest røret ved å knytte vesken suturen. ( Figur 5 )
- Test patronen og tetningen i røret i blæren ved å feste en 0,5 ml insulin sprøyte med en 30-gauge nål til den distale enden av røret. Fyll blæren sakte med 0,1-0,2 ml 0,9% NaCl til en dråpe kommer frem i urinrøret, og tøm blæren ved aspirasjon. Det er viktig at blæren kan fylles og tømmes.
- Hvis det ikke oppstår lekkasje ved kuppelen, må du bøye blæren med et par buede mikroforceps og trekk forsiktig på røret til flaren hviler mot innsiden av blærekuppelen.
- Før du lukker, fjern den lille rullen av vev og sørg for at blæren er i sin normale stilling.
- Lukk bukveggen i to lag (muskel og hud) med 6-0 løpende sutur. Det er å foretrekke å omtrentliggjøre rectus abdominis-muskelen ved å sutere kun kantene av den fremre bukfasaden (den fremre veggen av rectusskjeden).
- For å sikre slangen på dyrene tilbake, forsiktig roTette dyret på magen. Sett inn den subkutane delen av metallanker i interscapular snitt. ( Figur 12 ) Bruk en 6-0 sutur for å sikre røret og ankeret ved å omgjøre dem med en vertikal madrass sutur.
- Pass på at en limboble forblir over og under huden for å forhindre røret i å trekke ut. Klipp røret ca. 2 cm over huden.
- Sett forsiktig 30-gaugepluggen (trinn 1.1.5) inn i enden av røret for å forhindre at urinen lekker ut.
- Injiser 0,5 ml 0,9% NaCl subkutant for hydratisering. Gi postoperativ analgesi umiddelbart etter operasjon og opprettholde i 48 timer.
- Sett dyret tilbake i buret sitt under en infrarød lampe. Opprettholde konstant observasjon til dyret beveger seg rundt buret fritt.
- Overvåk dyret daglig og la det gjenopprette i 5 dager før opptak.
2. Våkn opp cysteOmetry Opptak
- Forberedelse av innspillingsprogrammet, tryktransduseren og infusjonspumpen.
- Før anesthetisering av dyret, koble til infusjonspumpe, trykkomvandler og 22 G sving med PE50-rør. ( Figur 6 )
- Åpne opptaksprogrammet (se tabell med materialer for et eksempel), på en datamaskin for å kalibrere systemtrykket og forberede seg på opptak. Pass på at du bruker de samme innstillingene under kalibrering og opptak.
- Fyll en 20 ml sprøyte med 10-15 ml romtemperatur 0,9% NaCl og legg inn i infusjonspumpen. Program pumpen for å infuse med en hastighet på 0,6 ml / t.
- Sikre tryktransduceren i samme høyde som dyrets blære eller bunnen av opptakskassen.
- Fest 22-gauge svivelen til enden av trykkransduseren (PE50-rør - trykkgiver til svingbar)
MERK: Dreiebenken brukes til å hindre at røret snor seg eller kinker aS dyret beveger seg. - Før sprøytepumpen for å skylle 0,9% NaCl gjennom systemet. Pass på å fjerne alle luftbobler før du kalibrerer.
- Når opptaksprogrammet kjører, bruk en linjal for å kalibrere trykket (cm / H 2 O). Flytt sakte enden av PE50-tetten fra 0 til 30 cm. Juster null hvis nødvendig.
MERK: Markeringen på 0 cm skal være i samme høyde som gulvet på opptakskassen og trykkgiveren.
- Stopp 22-gauge svivelen over midten av innspillingsburet. Sørg for at bunnbunnen gjør det mulig for urinen å falle på oppsamlingsanordningen av balansen plassert under buret. Juster turenes høyde slik at musen fritt kan bevege seg rundt buret uten å strekke eller strekke slangen. ( Figur 7 )
- Når du er ferdig, må du kontrollere at systemet og den eksterne PE50-slangen er fulle av 0,9% NaCl, og alle luftbobler er fjernet.
- prepDyrking av dyret for opptak
- Bedøv dyret med 2% inhalert isofluran og legg det på magen. Fjern 30-gaugepluggen og skyv PE10-slangen (blærekateteret) inn i enden av PE50-tetten. Bruk varmt lim for å danne en vanntett tetning.
- Slå av anestesien og plasser dyret i opptakskassen med et parallelt trådgulv, noe som gjør det mulig for urin å falle direkte på en oppsamlingsenhet plassert på toppen av en analytisk balanse. ( Figur 7 )
- Start opptaket når dyret er i buret, men ikke start infusjon. Overvåk dyret til det gjenoppretter fullstendig fra anestesen. Når blærtrykket stabiliserer, begynner du å infusere 0,9% NaCl i en hastighet på 0,6 ml / t.
MERK: Lag et notat i opptaksprogrammet når det gjøres endringer. Det er viktig å ha en oversikt over når infusjon starter, stopper eller uregelmessigheter oppstår. - Kontroller systemet for lekkasjer og kontroller at dyret har lett accEss til mat og vann.
- Fortsett å ta opp i et stille rom til tre reproduserbare mikturssykluser er oppnådd.
MERK: Dyret skal være helt uforstyrret gjennom hele opptaket. Bruk helst fjern videoovervåkning for å observere atferd.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Det var ingen signifikant forskjell mellom rørmaterialene og diametrene i konsistensen av trykkstigning og faller inn i systemet under røreklusjon. Blæreveggs hevelse etter intravesikal rørimplantasjon var signifikant for både polyetylen (PE) og polyuretan (PU) materialer. På dag 2 utviklet alvorlig submukosal hevelse. Det okkuperte halvparten av blærens tverrsnitt, noe som førte til hindring av lumen. På dag 5 løst ødemet fullstendig og forlot de submukosale områdene infiltrert med inflammatoriske celler som delvis invaderte muskulaturen. På dag 7 ble den inflammatoriske infiltreringen redusert vesentlig og histologi i blærevegget tilbake til normal ( figur 8 ). Den største utbredelsen av vevssvelling observert på dag 2 og dag 3 korrelert med atferdsrelatert data som viser signifikant svekket blærefunksjon ( figur 9 ). Voiding frekvens normalisert av po St operative dag 5.
Intravesiktrykk i en våken, fritt bevegelige mus (med minimal bevegelsesartefakter) kjennetegnes ved et grunnlinjetrykk på 10-15 cm H20, som kan forbli uendret eller gradvis øke med ikke mer enn 10 cm H20 under fyllingsperioden , Etterfulgt av en plutselig, pulserende trykkøkning og deretter slipp under fukting ( fig. 10 og 11 ).
Figur 1: PE10 Tubing for implantasjon i urinblæren. ( A ) En 7 cm PE10 rør med dråper varm lim på 4,5, 5 og 5,5 cm fra den flaredende. ( B og C ) Et detaljert bilde som viser den flared ende av røret (brukes til å sikre røret i blæren).Es / ftp_upload / 55588 / 55588fig1large.jpg "target =" _ blank "> Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Plugg for den eksterne delen av PE10-blæren. Pluggen er laget av en 30 G nål og varm lim. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kurs av blæren. Skjematisk linjetegning som illustrerer plasseringen av slangen gjennom magen og dens subkutane vei mot nakken. Vennligst klikk her for å se en størreVersjon av denne figuren.
Figur 4: Sammenligning av blære / slanger og trinn som brukes til å sette inn og sikre røret ved hjelp av en Lose Monofilament Suture. Intraoperative fotografier som viser: ( A ) Bilde som sammenligner PE50 og PE10 med en mus urinblære. ( B ) En liten sløyfe med 6-0 monofilament sutur plassert rundt blæren. Et par # 5 mikroforceps klemmer kuppelen av blæren mens en 21 G nål brukes til å gjøre cystotomi. ( C ) Uten å løsne blærenes kupp, sår et par # 5 mikroforceps i motsatt hånd hullet før du setter inn PE10-kateteret. ( D ) PE10 kateter sikret i blærenes kuppel med 6-0 monofilament sutur. Vennligst klikk herFor å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: En Purse String Suture kan brukes som en alternativ metode for sikring av røret i blæren. ( A ) Purse streng sutur i blærenes kuppel. ( B ) PE10 rør innført gjennom et senter av vesken strengen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 6: Eksperimentell oppsett. Sprøyte inneholdende 0,9% NaCl i infusjonspumpe koblet i serie til tryktransduser og intravesikal kateter. Dataskjermen nederst til høyre viser tre reproduserbare miktUrisjonssykluser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 7: Oppsett av eksperimentell opptak. ( A ) 22 G svivel suspendert over et opptakskasse og balanse. ( B ) Fotografi som viser hele lengden på den eksterne delen av infusjonsrøret med en 22 G svivel og en PE50 tether. ( C ) En 22 G svivel med en fjærhylse som dekker PE50 rør. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 8: Histologisk evaluering av reSponse av urinblærevegg til en implantert PE10-rør. Tverrsnitt av urinblæren farget med hematoksylin og eosin (H & E) før, 2, 3, 5 og 7 dager etter kirurgi. Blærevev hevelse løst på postoperativ dag 5. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 9: Funksjonell blæreevaluering ved hjelp av Voiding Spot Assay. Urin flekker på filterpapir sett med UV-lys som dokumenterer det representative mikturjonsmønsteret på dag 0 (før rørimplantat), 2, 3, 4, 5 og 7 post-intravesikalrørimplantat. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 10: Cystometrogram. Representativt spor av intravesikal blære trykk i en våken, fritt bevegelige mus. Spor viser 3 reproduserbare mikturssykluser. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 11: Mikturitionsfase. Spor som viser mikturfasen med høyfrekvente svingninger under den første økningen i trykk, topptrykk og et raskt trykkfall til grunnlinjen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 12: Forankring av tetheren. ( A ) Anker brukes til å feste PE10-kateteret i dyret og forhindre røret i å pulse på blæren. Disken er festet til fjærkappen. ( B ) Internt PE10-kateter koblet til den eksterne PE50-slangen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 13: Dreieanker. Subkutan del av ankeret bestående av ( 1 ) en skive laget av stoff og ( 2 ) en metallsløyfe.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Optimal materiale og størrelse på intravesikalrør
For å bestemme effekten av rørdiameteren på trykkopptak, testet vi forskjellige mikrofluidiske rør; PE50 (0,58 mm ID), polyuretan PU027 (0,4 mm ID), PE25 (0,46 mm ID) og PE10 (0,28 mm ID). For hvert rør ble det registrert trykk med infusjonspumpen som kjørte ved 1 ml / t, mens røret raskt flyttet vertikalt fra 0 til 30 cm. Initielle in vivo eksperimenter forsøkte å bruke PE50-rør, men mislyktes på grunn av størrelsen på slangen sammenlignet med musblæren ( figur 4A ). Mens dette støtter oppdagelsen av Smith og Kuchel, som foreslo at bruk av PE50-rør for våken cystometri i en mus skaper artefakter, noe som gjør det vanskelig å tolke dataene, 12 det er viktig å merke seg at andre har vellykket brukt PE50-rør i begge våkne , Våken opprettholdt, og bedøvet musecystometri. 9 , <Sup class = "xref"> 13 , 14 Sammenlignet med PE50 er PE10 mer fleksibel, noe som reduserer mengden spenning som røret gjelder for blæren når musen beveger seg, og reduserer bevegelsesartefakter. Det er viktig at delen av PE10 er så kort som mulig (≤ 7cm). Lengre PE10 slanger fører til større sannsynlighet for at trykkavlesningen vil bli dempet. Selv om det er en teoretisk fordel å bruke et mykere, mer biologisk inert materiale som PU for intravesikal implantasjon for å redusere inflammatorisk reaksjon, resulterte det ikke i en signifikant forskjell i postoperativ blæreoppsvulming. Videre ble forsøk som brukte den mykere PU-slangen forbundet med kinking og plugging.
Virkninger av operasjon på blærevegg kontraktilitet og hevelse
Inntil nå var data om blærefunksjon og blæreveggs hevelse, postimplantat av intravesikalrør, bare tilgjengelige for rotter. Ifølge tidligere sTudier, mikturjonsvolumet var lavere og mikturfrekvensen var høyere på postoperative dager 1 - 3. 15 Det ble også vist at endringer i blærefunksjonen til en rotte var forbundet med alvorlig hevelse i blæren, med ødemet som begynte å avta etter 3 dager. 16 For å få en bedre forståelse av endringen i urinblærefunksjonen, hevelse av blærevegg og reparasjon av tidslinje for mannlige, C57BL / 6-mus, som oppstår ved implantering av PE10-rør, ble 12-timers adferdssviktfrekvens vurdert ved hjelp av filterpapirregistreringsmetoden . Etter siste opptak ble musen bedøvet og blæren ble grovt vurdert, høstet, fikset og evaluert histologisk. På postoperasjon dag 1 og 2 økte voidingfrekvensen og spotting økte, etterfulgt av en økning i voiding etter dag 3. Voiding oppførsel normalisert etter dag 5. Brutto evaluering av blærer ved høsting og etter H & E-farging avslørte den største mengdenAv suburothelial hevelse på postoperativ dag 2 og 3, med blærer som ligner kontrollblærene på dag 5 og 7 etter rørimplantatet.
I likhet med kliniske urodynamiske studier brukte de fleste laboratorier romtemperatur 0,9% NaCl. Infusjonshastigheten i tidligere studier varierer betydelig fra 10 μl / min til 100 μl / min. 17 , 18 En studie som sammenlignet effekten av ulike infusjonshastigheter på blærefunksjonen i en mus, er ikke gjort, men data som er oppnådd i større dyreforsøk, anbefales at tregere fyllingshastigheter skal brukes. På grunn av det lille volumet av muskelblæren er peristaltiske pumper ikke hensiktsmessige, og en kontinuerlig mekanisk infusjonspumpe er nødvendig.
De mest nøyaktige og brukbare FC-opptakene balanserer god transmittans av endringer i trykk med begrensede gjenstander. Resultatene oppnådd ved bruk avEt kort segment av PE10 slanger koblet direkte til PE50 ga en nøyaktig måling av trykk i mus urinblæren. Trykkfluktuasjoner forårsaket av bevegelse av dyr kan begrenses ved å forankre røret til huden ved det punkt der det går ut i nakkenes nakke ( figurene 12 og 13 ). Dette kan oppnås ved bruk av limbobler og et spesielt anker bestående av en metallbelagt plate plassert subkutant, og det ytre stykket som er festet til metallfjæren som dekker røret. Ytterligere metoder for å forhindre røret i å trekke på blæren inkluderer å skape et buet subkutant spor for den indre delen av PE10-slangen, som gir slakk i røret og ved hjelp av en svivel og tetting som forhindrer vridning og kinking. Basert på litteratur og bevis gitt av disse studiene, anbefales følgende trinn å gi den mest reproduserbare og fysiologisk nøyaktige metode for in vivoInnspilling av intravesikal trykk i en mus. Bruk et operasjonsmikroskop og mikrokirurgiske verktøy for å implantere kateteret i kuppelen i urinblæren. Tillat en 5-dagers gjenoppretting mellom operasjonen og opptaket. Acclimate dyret i samme bur som opptaket vil bli utført i og gi fri tilgang til mat og vann. Utfør eksperimentet i et rolig miljø med minimal menneskelig kontakt, ideell bruk ekstern videoovervåkning for å observere dyrets oppførsel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Polyethylene (PE) 10 tubing | Instech | BTPE-10 | Fits 30G connectors/plugs |
| Polyethylene (PE) 50 tubing | Instech | BTPE-50 | Fits 22G connectors/plugs |
| 22 G single channel stainless steel swivel | Instech | 375/22 | |
| High Carbon Steel Utility Extension Spring (9/64" OD) | Grainger | 1NAH1 | Protects PE50 tubing - Cut to length |
| 22 G connector | Instech | SP22/12 | |
| Yutaoz Professional Hot Melt Adhesive Glue Gun | Yutaoz | Use low temperature setting (100 °C) - Any hot melt glue gun with an adjustable temperature range will work | |
| Surebonder DT-2010 all purpose glue stick | Surebonder | Any all purpose hot glue will work | |
| Dumont #5 curved microforceps | World Precision Instruments | 500232 | |
| Dumont #7 curved microforceps | World Precision Instruments | 14188 | |
| Mini dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 503240 | |
| Micro mosquito forceps (12.5 cm) | World Precision Instruments | 500451 | |
| Dissecting scissors - straight | World Precision Instruments | 14393 | |
| Castroviejo Needle Holder | World Precision Instruments | 503258 | |
| Isoflurane, USP | Phoenix | 2%, 1 L/min flow rate | |
| Buprenorphine | 0.05 mg/kg | ||
| 0.9% Sodium Chloride Irrigation, USP | Baxter | ||
| 6-0 Ethilon black monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Bladder tie | |
| 6-0 Vicryl violet braided, absorbable suture | Ethicon | Muscle suture, running | |
| 6-0 Prolene blue monofilament, non-absorbable suture | Ethicon | Skin suture, vertical mattress, buried interrupted | |
| KD Legato 210 infuse/withdraw pump | KD Scientific | 1.5 mL/hr | |
| Disposable pressure transducer | Digitimer | NL108T2 | |
| Pressure Amplifier | Digitimer | NL108A | |
| Power1401-3 data acquisition interface | Digitimer | ||
| Spike2 | Cambridge Electronic Design Limited | PC pressure recording software | |
| Leica MZ6 surgical operating microscope (3.2 - 20X) | Leica Microsystems | Magnification |
References
- Perez, L. M., Webster, G. D. The History of Urodynamics. Neurourol Urodyn. 11 (1), 1-21 (1992).
- Fry, C. H., et al. Animal models and their use in understanding lower urinary tract dysfunction. Neurourol Urodyn. 29 (4), 603-608 (2010).
- Maggi, C. A., Santicioli, P., Meli, A. The nonstop transvesical cystometrogram in urethane-anesthetized rats: a simple procedure for quantitative studies on the various phases of urinary bladder voiding cycle. J Pharmacol Methods. 15 (2), 157-167 (1986).
- Malmgren, A., et al. Cystometrical evaluation of bladder instability in rats with infravesical outflow obstruction. J Urol. 137 (6), 1291-1294 (1987).
- Pandita, R. K., Fujiwara, M., Alm, P., Andersson, K. E. Cystometric evaluation of bladder function in non-anesthetized mice with and without bladder outlet obstruction. J Urol. 164 (4), 1385-1389 (2000).
- Chang, H. Y., Havton, L. A. Differential effects of urethane and isoflurane on external urethral sphincter electromyography and cystometry in rats. Am J Physiol Renal Physiol. 295 (4), F1248-F1253 (2008).
- Matsuura, S., Downie, J. W. Effect of anesthetics on reflex micturition in the chronic cannula-implanted rat. Neurourol Urodyn. 19 (1), 87-99 (2000).
- DePaul, M. A., Lin, C. Y., Silver, J., Lee, Y. S. Peripheral Nerve Transplantation Combined with Acidic Fibroblast Growth Factor and Chondroitinase Induces Regeneration and Improves Urinary Function in Complete Spinal Cord Transected Adult Mice. PLoS One. 10 (10), e0139335 (2015).
- Kadekawa, K., et al. Characterization of bladder and external urethral activity in mice with or without spinal cord injury--a comparison study with rats. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 310 (8), R752-R758 (2016).
- Uvin, P., et al. The use of cystometry in small rodents: a study of bladder chemosensation. J Vis Exp. (66), (2012).
- Andersson, K. E., Soler, R., Fullhase, C. Rodent models for urodynamic investigation. Neurourol Urodyn. 30 (5), 636-646 (2011).
- Smith, P. P., Kuchel, G. A. Continuous uroflow cystometry in the urethane-anesthetized mouse. Neurourol Urodyn. 29 (7), 1344-1349 (2010).
- Aizawa, N., Homma, Y., Igawa, Y. Influence of High Fat Diet Feeding for 20 Weeks on Lower Urinary Tract Function in Mice. Low Urin Tract Symptoms. 5 (2), 101-108 (2013).
- Bjorling, D. E., et al. Evaluation of voiding assays in mice: impact of genetic strains and sex. Am J Physiol Renal Physiol. 308 (12), F1369-F1378 (2015).
- Morikawa, K., et al. Effects of various drugs on bladder function in conscious rats. Jpn J Pharmacol. 50 (4), 369-376 (1989).
- Yaksh, T. L., Durant, P. A., Brent, C. R. Micturition in rats: a chronic model for study of bladder function and effect of anesthetics. Am J Physiol. 251 (6 Pt 2), R1177-R1185 (1986).
- Cornelissen, L. L., Misajet, B., Brooks, D. P., Hicks, A. Influence of genetic background and gender on bladder function in the mouse. Auton Neurosci. 140 (1-2), 53-58 (2008).
- Lemack, G. E., Zimmern, P. E., Vazquez, D., Connell, J. D., Lin, V. K. Altered response to partial bladder outlet obstruction in mice lacking inducible nitric oxide synthase. J Urol. 163 (6), 1981-1987 (2000).
