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Biochemistry

वोल्टेज क्लैंप फ्लोराइट्री में Published: May 27, 2017 doi: 10.3791/55598
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Pharmacology and Physiology, University of Montréal, 2Department of Physics, University of Montréal

Summary

यह आलेख पारंपरिक वोल्ट क्लैंप फ्लोरेट्रेट्री (वीसीएफ) की वृद्धि का वर्णन करता है जहां आयन चैनलों में संरचनात्मक पुनर्गठन की जांच के लिए फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक एमिनो एसिड (एफयूएए) का प्रयोग नरमीइड रंगों के बजाय किया जाता है। इस प्रक्रिया में Xenopus oocyte डीएनए इंजेक्शन, आरएनए / एफयूएए सिक्का, और एक साथ वर्तमान और प्रतिदीप्ति माप शामिल हैं।

Abstract

वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री (वीसीएफ) electrogenic झिल्ली प्रोटीन की संरचना और कार्य की जांच करने के लिए पसंद की तकनीक है, जहां प्रतिदीप्ति और धाराओं की वास्तविक समय माप क्रमशः स्थानीय पुनर्संयोजन और वैश्विक समारोह पर रिपोर्ट करता है। जबकि क्रायो-इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी या एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफ़ी जैसे उच्च-रिज़ॉल्यूशन की संरचनात्मक तकनीकें, ब्याज की प्रोटीन की स्थिर छवि प्रदान करती हैं, वीसीएफ गतिशील संरचनात्मक डेटा प्रदान करती है जो हमें संरचनात्मक पुनर्गठन (प्रतिदीप्ति) को गतिशील कार्यात्मक डेटा (इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी) से जोड़ने की अनुमति देता है। अभी तक तक, प्रोटीनों की साइट-निर्देशित फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए इस्तेमाल किए जाने वाले थियोल-रिएक्टिव केमिस्ट्री ने दृष्टिकोण के दायरे को प्रतिबंधित कर दिया क्योंकि अंतर्जात लोगों सहित सभी सुलभ सिस्टीन को लेबल किया जाएगा। इस प्रकार प्रोटीन अंतर्जात cysteines से मुक्त बनाने के लिए आवश्यक था लेबलिंग को बाह्य से जुड़े स्थलों तक भी प्रतिबंधित किया गया थापक्ष। यह ऑर्थोगोनल टीआरएनए और टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी 2 का उपयोग कर कोडन दमन रोकने के लिए विशेष रूप से एक छोटे फ्लोरोसेंट जांच को शामिल करने के लिए फ्लोरोसेंट अनैसर्गिक एमिनो एसिड (एफयूएए) के प्रयोग से बदल गया। वीसीएफ सुधार में डीएनए इंजेक्शन (टीआरएनए / सिंटेटसे जोड़ी) की दो-चरणीय इंजेक्शन प्रक्रिया की आवश्यकता होती है, जिसके बाद आरएनए / एफयूएए सह-इंजेक्शन होता है। अब, दोनों intracellular और दफन साइटों लेबलिंग संभव है, और वीसीएफ के उपयोग में काफी विस्तार किया गया है वीसीएफ तकनीक इस प्रकार प्रोटीन की एक विस्तृत श्रृंखला का अध्ययन करने के लिए आकर्षक हो जाती है और अधिक महत्वपूर्ण बात - कई साइटोस्लिक नियामक तंत्र की जांच करने की अनुमति देता है।

Introduction

विभिन्न रासायनिक और भौतिक गुणों के 200 से अधिक अप्राकृतिक अमीनो एसिड आनुवंशिक रूप से ई। कोलाई , खमीर और स्तनधारी कोशिकाओं में प्रोटीन में शामिल किया गया है। ऑर्थोगोनल इंजीनियर टीआरएनए / सिन्थेटेस जोड़ी के माध्यम से एक विशिष्ट स्टॉप कोडन के जवाब में अप्राकृतिक अमीनो एसिड को शामिल किया गया है। प्रोटीन को संशोधित करने के लिए आनुवंशिक दृष्टिकोण ने प्रोटीन संरचना और फ़ंक्शन में मूल्यवान अंतर्दृष्टि प्रदान की है। यहां, हम एक फ्लोरोसेंट UAA के साथ संयोजन में वोल्टेज क्लैंप फ्लोरामिट्री (वीसीएफ) का उपयोग करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं।

वीसीएफ में, कार्यात्मक डेटा के एक साथ अवलोकन और फ्लोरोसेंट जांच (~ 5 Å) के आसपास स्थानीयकृत संरचनात्मक पुनर्गठन हमें मिलीसेकंड संकल्प 1 के साथ गतिशील सूचना प्राप्त करने की अनुमति देता है। फ्लोरोसेंट जांचें प्रोटीन के स्थानीय आंदोलन पर अपनी शमन स्थिति को बदलती हैं प्रतिदीप्ति में महत्वपूर्ण परिवर्तन के लिए केवल 1-2 Å का एक आंदोलन पर्याप्त होता हैतीव्रता 4 लक्ष्य प्रोटीन में ब्याज की साइट की पहचान के बाद, साइट बिन्दु उत्परिवर्तन द्वारा उत्परिवर्तित हो जाती है। शास्त्रीय रूप से, शेष अवशेष सिस्टीन को बदल दिया गया था, जबकि अब, एम्बर स्टॉप कोडॉन (TAG) आनुवांशिक एफयूएए को शामिल करने के लिए पेश किया गया है। प्रोटीन तब इन विट्रो में लिखित है।

जबकि अन्य अभिव्यक्ति प्रणाली ( जैसे, स्तनधारी कोशिकाओं) 5 , 6 , 7 का इस्तेमाल किया जा सकता है, Xenopus oocytes उनके बड़े आकार की वजह से संरचना-समारोह के अध्ययन के लिए बेहतर है, जिससे आसान हेरफेर और उच्च प्रतिदीप्ति तीव्रता (अधिक फ्लोरोफोर्स) और, से-शोर अनुपात इसके अलावा, Xenopus oocytes 2 , 8 , और endogenous प्रोटीन से पृष्ठभूमि कम है पृष्ठभूमि पोल ढाल पर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति के खिलाफ काले रंग pigmentationवह साइटोसोल Xenopus oocytes को शल्यचिकित्सा हटा दिया जाता है और डीएनए एन्कोडिंग ऑर्थोगोनल टीआरएनए / टीआरएनए-सिंथेटेस जोड़ी एफयूएए के लिए विशिष्ट ओकसाइट्स के न्यूक्लियस में इंजेक्शन होता है। 6-24 एच ऊष्मायन समय के बाद, प्रोटीन आरएनए को एफयूएए के साथ सह-इंजेक्ट किया जाता है जो ओओसीइट्स के साइटोसोल में होता है, इसके बाद 2-3 दिनों की ऊष्मायन अवधि होती है। एफयूएएए (फोटोबलीचिंग) को किसी भी क्षति को रोकने के लिए, फ्लोरोफोरे उत्तेजना से बचने के लिए एनाप सहित प्रक्रियाओं को लाल बत्ती के नीचे ले जाना पड़ता है।

ओक्साइट्स एक कट-ओकटाइट वोल्टेज-क्लैंप सेटअप पर अध्ययन किया जाता है, जो ईमानदार प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर मुहिम लगाई जाती है, और इलेक्ट्रिकल वर्तमान और प्रतिदीप्ति परिवर्तन एक साथ 9 , 10 दर्ज किए जाते हैं। वैकल्पिक रूप से, दो इलेक्ट्रोड वोल्टेज दबाना 1 या पैच-क्लैम्प कॉन्फ़िगरेशन 11 का उपयोग किया जा सकता है। कम आरएमएस शोर के साथ उपयुक्त तरंग दैर्ध्य द्वारा प्रतिदीप्ति उत्साहित है और उत्सर्जन उच्च प्रवर्धन के साथ एक एम्पलीफायर से जुड़े photodiode का उपयोग कर दर्ज की गई।

वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री में फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक अमीनो एसिड (एफयूएए) का उपयोग करने के कई फायदे हैं। एक झिल्ली प्रोटीन के साइटोसोलिक पक्ष तक पहुंच है; कई नियामक प्रक्रियाएं यहां स्थित हैं ( जैसे, सीए 2 + - या न्यूक्लियोटाइड बाध्यकारी साइटें, वोल्टेज-गेट वाले आयन चैनलों के तेज और बंद-राज्य निष्क्रियता, ताकना खोलने, मॉड्यूल युग्मन)। इन सभी प्रक्रियाएं अब फ्लोरोसेंट लेबलिंग के लिए सुलभ हैं

एक अन्य लाभ प्रोटीन की कम गड़बड़ी के कारण जांच के छोटे आकार का है। अब तक, दो ओर्थोगोनल टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस युग्ज के लिए एफयूएएएस का इंजिनियरिंग 12 , 13 है , जहां 3- (6-एसिलीनफथलेन-2-य्लमिनो) -2-एमिनोप्रोप्रोनोइक एसिड (एनाप) एकमात्र एफयूएएए है जिसका उपयोग एक्सनोपस ओक्साइट्स में किया गया है 2 ,"Xref"> 8 एनाप एक पर्यावरणीय रूप से संवेदनशील फ्लोराफोरे है, जिसमें 272.3 ग्राम / एमओएल के आणविक वजन हैं और यह ट्रिप्टोफैन 12 ( आंकड़े 1 ए, 1 बी ) से थोड़ी ही बड़ी है। अपने छोटे आकार के कारण, लिंकर (आमतौर पर 500 ग्राम / मॉल से अधिक) के माध्यम से जुड़ा हुआ पारंपरिक फ्लोरोफोर्स की तुलना में फ्लोरोफोरे द्वारा कम कार्बनिक प्रभाव लाया जा सकता है। इसके अलावा, अनप के मामले में, फ्लोरायोफोरे सिस्टीन से जुड़े लोगों की तुलना में प्रोटीन रीबोन के करीब स्थित है, और इसके परिणामस्वरूप, अनप अधिक स्थानीयकृत पुनर्व्यवस्था की जांच कर रहा है। अंत में, परंपरागत वीसीएफ में अंतर्जात cysteines को हटाने के लिए साइट-विशिष्ट लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए अब UAA-VCF में एक आवश्यकता नहीं है और इसलिए (i) प्रोटीन को छोड़कर (लगभग) अपने मूल राज्य में छोड़ देता है और (ii) वीसीएफ को लागू करने की अनुमति देता है एक व्यापक श्रेणी के प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए जिसमें फ़ंक्शन सिस्टीन प्रतिस्थापन द्वारा बदल सकता है

आकृति 1 चित्रा 1 : Anap और प्रतिदीप्ति स्पेक्ट्रा ( ए ) अनाप के रासायनिक संरचना ( बी ) 1 एनएम अनाप के लिए सामान्य अवशोषण स्पेक्ट्रम और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा, एनाप प्रतिदीप्ति की संवेदनशीलता को विलायक हाइड्रोफॉबिसिटी के लिए प्रदर्शित करते हुए। उत्सर्जन स्पेक्ट्रा 350 एनएम पर रोमांचक द्वारा प्राप्त किए गए थे। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

फ्लोरोसेंट UAA का उपयोग करने के एक नुकसान यह है कि प्रोटीन की एक विषम जनसंख्या रोक codon readthrough, translational reinitiation, सी टर्मिनल truncated प्रोटीन या endogenous aminoacylation के साथ crosstalk से हो सकता है अगर aminoacedlated tRNAs की मात्रा दुर्लभ है इस तरह के रिसाव की अभिव्यक्ति की जांच हमेशा के लिए की जानी चाहिए क्योंकि एफयूएए और टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी के अभाव में। हमने ट्रांस के मुद्दे को संबोधित कियालैंसल रिनीनीशन और एन-टर्मिनल सम्मिलन साइटों के लिए पहले से 14 के लिए इसे कैसे निरोधक करना हालांकि, जब एफयूएए, टीआरएनए और टीआरएनए सिंथेटेस संतृप्त मात्रा में मौजूद हैं, तो केवल रिसाव अभिव्यक्ति की कम संभावना बनी हुई है।

एफयूएए-वीसीएफ और परंपरागत वीसीएफ के बीच प्रमुख प्रक्रियात्मक अंतर ओक्साइट्स का इंजेक्शन और हैंडलिंग है; डीएनए एन्कोडिंग डीएनए एन्कोडिंग टीआरएनए और टीआरएनए सिन्थेटेस (पीएएनएपी) को एनाप की शुरूआत के बाद किया जाता है, जो प्रोटीन एमआरएनए के साथ सह-इंजेक्ट होता है या वैकल्पिक रूप से एटेटोक्सीमाइथाइल (एएम) एस्टर के रूप में ऊष्मायन समाधान में जोड़ा जाता है।

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Protocol

मेंढक जोड़तोड़ को कनाडा के दिशानिर्देशों के अनुरूप किया गया था और मॉन्ट्रियल विश्वविद्यालय के नैतिक समिति (सीडीईए, प्रोटोकॉल # 15-042) ने उन्हें मंजूरी दे दी है।

1. एफयूएए निगमन के लिए एमआरएनए तैयारी

  1. प्रोटीन में रूचि की एक साइट चुनें, जहां गठनात्मक परिवर्तन होने की संभावना है। एफयूएए के लिए प्रतिस्थापित किए जाने वाले इस क्षेत्र में एमिनो एसिड का चयन करें।
    नोट: स्थिति का चयन संरचनात्मक पुनर्गठनों पर आधारित होता है जो अपेक्षित हैं। यदि एक उच्च संकल्प संरचना मौजूद है और अपेक्षित आंदोलनों की एक परिकल्पना है, तो एनाप को इस तरह रखा जाना चाहिए कि रासायनिक वातावरण बदल जाएगा; यह या तो ढांकता हुआ निरंतर (हाइड्रोफोबिक बनाम हाइड्रोफिलिक पर्यावरण) में एक परिवर्तन हो सकता है या फिर, अन्य अमीनो एसिड द्वारा शमन की संभावना अधिक हो सकती है। सबसे अच्छा quenchers tryptophans हैं Anap एक राज्य (वाइन-डर-वाल radii के ओवरलैप) में बुझानेवाले के साथ संपर्क में होना चाहिए और इसमें से मुक्तअन्य। यदि कोई उच्च-रिज़ॉल्यूशन संरचना या मॉडल मौजूद नहीं हैं, तो एक को रुचि के क्षेत्र को स्कैन करना होगा। किसी भी मामले में, यह अभिव्यक्ति और प्रतिदीप्ति संकेत प्राप्त करने की संभावना को बढ़ाने के लिए कई पास के स्थानों का चयन करने के लिए सलाह दी जाती है। प्रोटीन परिपक्वता और / या समारोह के दौरान स्टेरिक प्रभाव को कम करने के लिए, एक बड़े और खुशबूदार अमीनो एसिड (Phe, Trp, Tyr) को बदलने का विकल्प चुन सकता है। हालांकि लेखकों ने अनुभव किया है कि प्रतिस्थापित अमीनो एसिड की परवाह किए बिना एफयूएए सम्मिलन के लिए ब्याज की एक क्षेत्र स्कैनिंग अधिक उत्पादक है।
  2. साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन 15 का उपयोग कर चयनित साइट पर एक एम्बर स्टॉप कोडन (टैग) डालें। सुनिश्चित करें कि ब्याज की प्रोटीन एक एम्बर स्टॉप कोडॉन (TAG) पर समाप्त नहीं होती है। यदि हां, तो एक अलग (गेरु या ओपल स्टॉप कोडन) को बदलना डीएनए बढ़ाएं, अलग करें और अनुक्रम करें। इन विट्रो प्रतिलेखन के साथ प्रोटीन एमआरएनए प्राप्त करें और 20 डिग्री सेल्सियस या 80 डिग्री सेल्सियस पर एमआरएनए स्टोर करें।
    3. </ Ol>

    2. Oocyte तैयारी और इंजेक्शन

    1. शल्यचिकित्सा Xenopus laevis मेंढक से स्टेज वी या छः ऑक्साईट प्राप्त करते हैं और पहले से वर्णित 17 के रूप में collagenase के साथ defolliculate।
      1. अनुमोदित पशु प्रोटोकॉल (यहां: 3-एमिनोबेंज़ोइक एसिड एथिल एस्टर) के अनुसार उचित संवेदनाहारी के साथ मेंढ़कों को एनेस्थेटिज़ करें। जब वे पैर की टिप-टिप (वापसी प्रतिवर्त की हानि) को एक कोमल चुटकी का सामना करने में विफल रहते हैं, तो वे सर्जरी के लिए उपयुक्त रूप से संवेदनाहृत होते हैं।
      2. तुरंत संवेदनाहारी समाधान से मेंढक को हटा दें और ताजा पानी से अपनी त्वचा को अच्छी तरह से कुल्ला। यह कुल्ला जानवर की त्वचा की सतह से अनबॉस्ड रासायनिक निकालने से एनेस्थेसिया के गहरे स्तर तक गिरने से रोक सकता है।
      3. शल्यक्रिया से एक ओर से अंडाशय नोड्स को निकालें और दो संदंशों का उपयोग करके नोड्स खोलें। "मानक ऊसाइट समाधान" (एसओएस) में 1% (w / v) collagenase युक्त 20 से 30 मिनट के लिए oocytes सेते और आंदोलनDefolliculate करने के लिए एसओएस समाधान के साथ तीन बार धोएं
      4. बड़े और स्वस्थ oocytes का व्यक्तिगत रूप से चयन करें और बार्ट के समाधान में एंटीबायोटिक दवाओं (100 यू / एमएल पेनिसिलिन, 100 माइक्रोग्राम / एमएल स्ट्रेप्टोमाइसिन, 10 मिलीग्राम / 100 एमएल कानामाइसिन) और 5% घोड़े सीरम के साथ 18 डिग्री सेल्सियस पर इंजेक्शन से कम से कम 4 एच ।
        नोट: 2-4 सर्जरी के बीच में 4 महीने के विलंब के साथ, Xenopus laevis लंबे समय तक (> 1 एच) 3-एमिनोबेंझोइक एसिड एथिल एस्टर के साथ ऊष्मायन द्वारा euthanized हैं।
    2. डीएनए के परमाणु इंजेक्शन के लिए, नाभिक तक पहुंचने में सक्षम होने के लिए लंबी और पतली इंजेक्शन टिप तैयार करें और ओओसीट को हानि करने से बचें। इंजेक्शन टिप को तेल के साथ भरें और उसे नैनोइन्जेक्टर डिवाइस पर माउंट करें।
      1. एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के तहत नैनो-इंजेक्टर स्थापित करें और टिप के अंत को तोड़ने के लिए संदंश का उपयोग करें। टिप के अंत में फंसे कोई हवाई बुलबुले नहीं होने तक तेल निकालें।
    3. 1 μL 0.1 माइक्रोग्राम /# 181; एल्यूएपीएप में एनआईएचएच युक्त 1 एनएएच (1 ​​एनएओएचएच का 1%) ट्राइरोस्कोप के तहत पैराफिलम पर डीएनए के साथ इंजेक्शन टिप भरें।
    4. एंटीबायोटिक दवाओं के साथ पूरक बार्थ के समाधान युक्त एक जाल-लेपित इंजेक्शन डिश में 40 ऑओसाइट्स ट्रांसफर करें।
      नोट: मेष-लेपित इंजेक्शन डिश बनाने के लिए, एक पोलीस्टीरीन पेट्री डिश भरने के लिए 800 सुक्ष्ममापी नायलॉन मेष के उचित आकार के टुकड़े को काट लें। केंद्र में क्लोरोफॉर्म जोड़ें और फिर शीर्ष पर मेष रखें। प्लास्टिक सेट तक मेष फ्लैट पकड़ो
    5. जैसा कि ओओकाइट न्यूक्लियस जानवर (अंधेरे) ध्रुव में स्थित है, पशु ध्रुव के केंद्र में इंजेक्शन टिप का लक्ष्य रखना और ऐसा प्रतीत करना कि टिप पशु गोलार्ध के केंद्र के पास पहुंचता है (या आरएनए इंजेक्शन की तुलना में 2-3x की गहराई )। प्रत्येक oocyte के न्यूक्लियस में पीएनेप के 9.2 एनएल इंजेक्ट करें। पतली टिप और छोटे इंजेक्शन की मात्रा अनियमित इंजेक्शन या अवरुद्ध टिप में हो सकती है। कभी-कभी जांचें कि क्या इंजेक्शन हवा में इंजेक्शन द्वारा काम करता है।
      नोट: डीएनए नाभिक में ठीक से इंजेक्ट किया गया है या नहीं अनिश्चित है। इसलिए टीआरएनए / सिंथेटेस जोड़ी को व्यक्त नहीं करने के लिए 10 से 40% oocytes की अपेक्षा करें। अधिक विस्तार के लिए चर्चा देखें।

    चित्र 2
    चित्रा 2 : एनाप इनकॉर्पोरेशन के लिए Xenopus Oocytes में डीएनए और आरएनए इंजेक्शन का चित्रण।
    सबसे पहले, पीएएनपी को Xenopus oocyte ( 1 ) के नाभिक में अंतःक्षिप्त किया जाता है। 6-24 घंटे के बाद, एनाप और चैनल आरएनए को वनस्पति ध्रुव ( 2 ) में जोड़ दिया जाता है। Anap ओर्थोगोनली एएमआईओसीओलएट हो जाएगा जो टीआरएनए के साथ एम्बर स्टॉप एंटी-कोडन को लेकर होगा, एनोनोसेएल-टीआरएनए सिंथेटेस द्वारा जो पीएएनपी द्वारा एन्कोड किया गया है। इस प्रकार, एमिनोइएलेटेड एनाप-टीआरएनए को आरबीओएसओएम द्वारा डाली गई एम्बर स्टॉप कॉडॉन में चैनल में पहचाना जाता हैएल आरएनए, जिसके परिणामस्वरूप रोक कोडन को दमन और अनाप की प्रविष्टि इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    1. एनाप विशिष्ट टीआरएनए और टीआरएनए-सिंथेटेस के मजबूत अभिव्यक्ति की अनुमति देने के लिए 6-24 घंटे के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर एंटिबायोटिक्स और 5% हार्स सीरम (एचएस) के साथ 2 एमएल बार्थ के समाधान में ओकोसाइट्स सेते हैं।
      नोट: डीएनए ऊष्मायन समय आरएनए इंजेक्शन से कई दिनों तक खत्म हो सकता है, लेकिन यह अभिव्यक्ति में वृद्धि नहीं करता है।
    2. आरएनए इंजेक्शन के लिए नैनो इंजेक्टर तैयार करें (वही 2.2 जैसा है लेकिन इंजेक्शन टिप डीएनए इंजेक्शन के लिए पतले होने की आवश्यकता नहीं है)। अनप की फोटोबलेचिंग को रोकने के लिए केवल इस बिंदु से लाल बत्ती के नीचे काम करें।
    3. पैराफिल के एक टुकड़े पर 1 माइक्रोग्राम / μL एमआरएनए के 1 μL के साथ 1 एमएल एनाप के 1 μL को मिलाएं और मिश्रित समाधान के साथ इंजेक्शन टिप भरें। वनस्पति में झिल्ली के नीचे सिर्फ इम्पेसल(उज्ज्वल) ध्रुव और प्रत्येक पीएएनएप-इंजेक्शन oocyte में 46 एनएल इंजेक्षन।
      नोट: आवश्यक एमआरएनए एकाग्रता ब्याज की प्रोटीन पर निर्भर करता है।
    4. बाइट के समाधान में एंटीबायोटिक दवाओं के पूरक में एक बॉक्स में प्रकाश से संरक्षित oocytes या एल्यूमीनियम पन्नी में लिपटे, और 2-3 दिनों के लिए 18 डिग्री सेल्सियस पर 5% घोड़ा सीरम सेते हैं। हर दिन नए बार्थ के समाधान के साथ एक्सचेंज करें और प्रदूषण से बचने के लिए मृत ऑओसाइट्स को हटा दें।

    3. वीसीएफ सेटअप

    1. कट-ओकटाइट वोल्टेज क्लैंप उपकरण स्थापित करें जैसा कि पहले 18 वर्णित है।
    2. इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी रिकॉर्डिंग सिस्टम को एक सफ़ेद प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप पर एक स्लाइडर पर रिकॉर्डिंग चेंबर को स्थापित करके उस फ्लोरोसेंस मापन ( चित्रा 2 सी ) को प्रदर्शन करने के लिए ओओसीट और माइक्रोस्कोप रखने के लिए मानक त्रिआइस्कोप के बीच चलने की अनुमति देता है।
      नोट: कट-ओक्साइड के लिए कक्ष की ज्यामिति सामान्य ट्रे का उपयोग करने के लिए उपयुक्त नहीं हैहेरफेर के दौरान रोशनी के लिए एनएसएमटीट लाइट इसलिए, लाल फिल्टर के साथ एक "बोजनीकैंक" हलोजन दीपक शीर्ष से ऊपर की तरफ रोशन करने के लिए उपयोग किया जाता है माइक्रोस्कोप के कंडेनसेज़र को हटाया जा सकता है इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी चैंबर के लिए मंच को कम करने के लिए स्थान बना सकता है।
    3. प्रतिदीप्ति सूक्ष्मदर्शी के सी-माउंट निकास पोर्ट ( चित्रा 2 ए ) में एक फोटोोडिड डिटेक्शन सिस्टम को कनेक्ट करें। डिजिटल सिग्नल प्रोसेसर (डीएसपी, एनालॉग / डिजिटल-डिजिटल / एनालॉग कनवर्टर) में दूसरे इनपुट चैनल में फोटोकॉर्चेंट रीडआउट को कनेक्ट करें।
    4. प्रतिदीप्ति उत्तेजना के लिए प्रकाश स्रोत के रूप में 100 डब्ल्यू, 12 वी हलोजन लैंप का उपयोग करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एचजी-बर्नर का उपयोग किया जा सकता है, लेकिन रिकॉर्डिंग के दौरान बहुत तेजी से फोटोबलीचिंग को रोकने के लिए तीव्रता में कम किया जाना चाहिए। एलईडी रोशनी केवल तब ही अनुशंसा की जाती है जब संबंधित एल ई डी उत्तेजना श्रेणी में महत्वपूर्ण तीव्रता दिखाती है ( जैसे, अनाप के लिए ~ 350 एनएम)। अधिकांश सफेद एलईडी अब तक यूवी स्पेक्ट्रम में नहीं पहुंचते हैं।
    5. इन्सउत्तेजना प्रकाश स्रोत और माइक्रोस्कोप के बीच एक विद्युत-नियंत्रित शटर का उपयोग करें और डीएसपी के एक डिजिटल आउटपुट के लिए इसके नियंत्रण (आमतौर पर टीटीएल-पल्स) से कनेक्ट करें। रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में टीटीएल-पल्स (निर्माता दस्तावेज़ीकरण देखें) का समय, जैसे शटर रिकॉर्डिंग की शुरुआत से पहले ~ 100 एमएस खोलता है। इस तरह, उद्घाटन प्रक्रिया के दौरान कोई भी कंपन रिकॉर्डिंग में हस्तक्षेप नहीं करता है। समय शटर की गति और कंपन पर निर्भर करता है। चित्रा 4 में दिखाए गए रिकॉर्डिंग के अंत से पहले पल्स 5ms समाप्त करें। इस तरह, कुल प्रतिदीप्ति के लिए मूल्य भी दर्ज किया जाता है।
    6. फिल्टर क्यूब बुर्ज में एक उपयुक्त फिल्टर क्यूब (उत्तेजना फिल्टर, डाइक्रोरिक मिरर और उत्सर्जन फिल्टर) डालें अनप के लिए, एक्स: 377/50 एनएम बैंडपास, डिच्रोइक 40 9 एनएम लंबापास, और एएम: 470/40 एनएम बैंडपास का उपयोग करें।

    चित्र तीन
    चित्रा 3 < / Strong> : वीसीएफ सेटअप ( ए ) माइक्रोस्कोप के अंदर प्रकाश पथ को दिखाए जाने वाले वीसीएफ सेटअप के साइड व्यू। फिल्टर घन में एक उत्तेजना फिल्टर, डाइक्रोकिक मिरर और एक उत्सर्जन फिल्टर है। ( बी ) चयनित oocyte कक्ष आयाम ऊपरी कक्ष के त्रिज्या (1) के लिए 3.4 सेमी, नीचे चैम्बर लंबाई (2) के लिए 5.5 सेमी, निचला कक्ष चौड़ाई (3) के लिए 1.4 सेमी और मध्यम कक्ष चौड़ाई (4) के लिए 1.7 सेमी है। ( सी ) वीसीएफ सेटअप के सामने का दृश्य बाईं ओर पहला ओकुलर कट-ओपन वोल्टेज क्लैंप चैंबर में ओकटाइट बढ़ाना और पारगम्यता के लिए है। फिर, दाब के दूसरे ओकुलर पर खुर्दबीन के नीचे कक्ष दाग जाता है यहां, वी 1 इलेक्ट्रोड को 4 एक्स उद्देश्य का उपयोग करते हुए ओओसीइट में डाला जाता है, और जल-विसर्जन 40X उद्देश्य का उपयोग करके प्रतिदीप्ति दर्ज किया जाता है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

    4। वीसीएफ रिकॉर्डिंग

    1. कट-ओकटाइट वोल्टेज-क्लैम्प के लिए तैयारी के चरणों का पालन करें, जैसा कि पहले वर्णित है और 18 (अगर सेतु की तैयारी, ओओसाइट, सैपोनिन permeabilization बढ़ते हुए) को देखा गया है। हालांकि, रिकॉर्डिंग से पहले फ्लोरोफोरे को ब्लीच करने से बचने के लिए हर समय लाल बत्ती के तहत काम करते हैं। Oocyte डालते समय, सुनिश्चित करें कि पशु ध्रुव ऊपर की तरफ सामने आता है। साइटोसोल से उत्पन्न आटोफ्लोरेसेंस के खिलाफ पशु पोल झिल्ली ढाल के तहत रंजकता और इसलिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति कम कर देता है।
    2. कक्ष को माइक्रोस्कोप पर स्लाइड करें और एक 4x उद्देश्य का उपयोग कर फ़ोकस करें।
    3. वोल्टेज सेंसिंग वी 1 इलेक्ट्रोड (3 एम केएलएल) के साथ ओओसीइट को ढंकना, 40 एक्स जल-विसर्जन (एनए 0.8 - 0.9) उद्देश्य पर स्विच करें। पशु ध्रुव पर फोकस जो ऊपर की ओर सामना कर रहा है।
    4. लाल बत्ती को बंद करें फिल्टर क्यूब बुर्ज और फोटोडिड से कनेक्ट ऑप्टिकल आउटगोइंग पोर्ट को बदलकर सही फिल्टर क्यूब का चयन करें। हॉल चालू करेंउच्चतम तीव्रता पर दीपक और शीघ्र ही ओकटाइट से उत्पन्न होने वाली पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति तीव्रता को पढ़ने के लिए 2-5 s के लिए शटर खोलें। वर्णित सेटअप के साथ मान अनाप के लिए लगभग 50-200 पीए होना चाहिए।
    5. दबाना चालू करें, बाथ / गार्ड स्विच को सक्रिय करने के लिए फ्लिप करें और मेम्ब्रेन क्षमता (वी 1 - वी 2) को कमांड की क्षमता में समायोजित करें जिससे मैं हेडस्टेज पर घुंडी मोड़ सकता हूं।
    6. रिकॉर्डिंग सॉफ्टवेयर में संभावित, कदम प्रोटोकॉल, संख्या और दालों आदि की लंबाई का चयन करें। रिकॉर्ड वोल्टेज-निर्भर धाराओं और एनाप प्रतिदीप्ति तीव्रता।

    5. दो रंग का वीसीएफ

    1. एक साथ एक ही प्रोटीन में दो स्थानों पर निगरानी रखने के लिए, सिस्टीन में एक बाह्य और सुलभ अमीनो एसिट उत्परिवर्तित करें, और थिओल-केमिस्ट्री के साथ विशिष्ट लेबलिंग सुनिश्चित करने के लिए अन्य सिस्टीन को हटा दें।
    2. चरण 2.1-2.5 करें
    3. वीसीएफ रिकॉर्डिंग से पहले, 5 मिनट में 15μ (या अन्य डाई के लिए लेबलिंग समाधान में टीएमआर-मासीमाइड में oocytes सेते हैंअनाप की तुलना में गैर अतिव्यापी स्पेक्ट्रा के साथ)
    4. अतिरिक्त डाई को हटाने के लिए लेबलिंग समाधान से तीन बार ओकोसाइट्स धोएं
    5. चरण 4.1-4.6 करें
    6. फ़िल्टर क्यूब बुर्ज में टीएमआर (उत्तेजना फिल्टर, डाइक्रोक मिरर और उत्सर्जन फिल्टर) के लिए उपयुक्त फिल्टर क्यूब डालें फ़िल्टर बुर्ज को चालू करके TMR फ़िल्टर क्यूब पर स्विच करें
    7. चरण 4.4 में एनाप के लिए वर्णित टीएमआर के लिए पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति पढ़ें।
      नोट: झिल्ली में अनिर्दिष्ट लेबलिंग के कारण उच्च पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति में thiol-chemistry परिणाम के साथ लेबलिंग। इसलिए, टीएमआर पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति प्रवर्धक (> 2,000 पीए) को भंग कर सकता है। उस स्थिति में, प्रकाश की तीव्रता में कमी नहीं करें, लेकिन केवल फोटोडिडा को ऑफसेट चालू करके पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति घटाएं। व्यावसायिक रूप से उपलब्ध सिस्टम में डिटेक्टर सिस्टम पर "नमूना-और-पकड़" सुविधा का उपयोग किया जाता है। एक प्रयोगशाला जम्मू में पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति मूल्य (10x तटस्थ घनत्व फिल्टर का उपयोग करके) को नोट करेंभारतीय, जैसा कि यह मान दर्ज नहीं किया जाएगा (संतृप्ति)
    8. रिकॉर्ड वोल्टेज पर निर्भर धाराओं और TMR प्रतिदीप्ति तीव्रता चरण 4.6 में एक साथ।

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Representative Results

चित्रा 4 चित्रा 4 में पीएनेप और अनाप की उपस्थिति में तेजी से निष्क्रियता हटाए गए (आईआर), एल -382 स्टेप-डब्लू 434 एफ के साथ एक ओओसीटा व्यक्त शकर चैनलों से प्राप्त वीसीएफ रिकॉर्डिंग का एक उदाहरण दिखाता है। W434F उत्परिवर्तन, आयनिक पोटेशियम धाराओं को अवरुद्ध करता है, जो क्षणिक गेटिंग चार्ज विस्थापन (गेटिंग धाराएं) को मापने के लिए संभव बनाता है। विद्रोहीकरण पर गेटिंग धाराओं (ऊपरी निशान) और एनाप प्रतिदीप्ति तीव्रता परिवर्तन (निचला निशान) की एक साथ रिकॉर्डिंग एनाप की स्थिति को एल382 में सफल निगमन दर्शाती है। यहां, अनैप चार एस 4 ट्रांसमैमब्रन हेलीकॉइस के नीचे स्थित है जो कि सक्रियण (एल 382) के दौरान घूमते हैं और इस प्रकार इंट्रासेल्युलर स्थानीय पुनर्व्यवस्थाओं पर रिपोर्ट करते हैं। एक प्रतिदीप्ति परिवर्तन विलायक विश्राम (पर्यावरण ध्रुवीकरण परिवर्तन) और / या अन्य अमीनो एसिड 4 द्वारा शमन के कारण हो सकता है। दोनों तंत्र रिश्तेदार प्रोटीन पुनर्गठन का एक परिणाम हैं। चित्रा 5 एक ही oocyte से प्राप्त कदम प्रोटोकॉल का उपयोग कर Anap और TMR प्रतिदीप्ति संकेतों को प्रदर्शित करता है। L382stop-W434F पृष्ठभूमि में ए 359 सी उत्परिवर्तन जोड़कर और टीएमआर-माइलीइड के साथ लेबलिंग, वर्णित तकनीक के साथ ही एक ही प्रोटीन के विभिन्न क्षेत्रों में वास्तविक समय की आंदोलनों की जांच करना संभव है। इस मामले में, टीएमआर ऊपरी एस 4 हेलिक्स (ए 35 9 सी) की आवाजाही की जांच करता है जबकि एनाप एस 4 (एल 338) के निचले भाग के आंदोलन को जांचता है। प्रतिदीप्ति परिवर्तन के समय के समय से कैनेटीक्स ( आंकड़े 5 ए, 5 बी) का विश्लेषण करके प्रतिदीप्ति द्वारा मॉनिटर संक्रमण के गतिशील जानकारी प्राप्त कर सकते हैं। इसके अलावा, प्रतिदीप्ति-वोल्टेज रिश्ते (एफवी) वोल्टेज के खिलाफ स्थिर-राज्य प्रतिदीप्ति तीव्रता की साजिश रचने से प्राप्त होती है ( चित्रा 5C )। एफवी निगरानी वाले राज्यों के कब्जे के बीच संतुलन को दर्शाता है जो आयन चैनलों के मामले में vओल्टेज संवेदक आंदोलन, या केंद्रीय छिद्र का उद्घाटन। FUAAs का उपयोग करके अब चैनल के अंदर से एफवी प्राप्त करना संभव है। चित्रा 5C से पता चलता है कि एस 4 (टीएमआर) के ऊपरी हिस्से में एस 4 (एनाप) के निचले हिस्से के समान वोल्टेज निर्भरता है।

संकेत-टू-शोर अनुपात मुख्यतः रिश्तेदार प्रतिदीप्ति परिवर्तन (डीएफ / एफ) और कुल प्रतिदीप्ति पर निर्भर है। डीएफ / एफ सिग्नल साइज को परिभाषित करता है जबकि शोर प्रकाश की क्वांटम प्रकृति (पॉसॉन शोर) के कारण कुल प्रतिदीप्ति द्वारा निर्धारित किया जाता है। डीएफ / एफ प्रोटीन के विभिन्न राज्यों में शमन की स्थिति और राज्यों ( जैसे, खुले संभावना) के अधिभोग पर निर्भर करेगा। कुल प्रतिदीप्ति में विशिष्ट लेबलिंग और अनिर्धारित पृष्ठभूमि लेबलिंग से प्रतिदीप्ति शामिल हैं। कुल विशिष्ट प्रतिदीप्ति व्यक्त प्रोटीन की संख्या और फ्लोरोफोरे की क्वांटम उपज से परिभाषित की गई है। Xe की बड़ी सतहनोपस ओओकाइट्स फायदेमंद है क्योंकि यह योगदान प्रोटीन की संख्या को बढ़ाता है।

अनाप की क्वांटम प्राप्ति, अर्थात् प्रति उत्तेजना चक्र के उत्सर्जन में फोटोन की संख्या या फ्लोरोफोरे की "चमक" कम है, जिससे कुल प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाती है और जिससे कम संकेत-टू-शोर अनुपात होता है। उसी समय, एनाप लेबलिंग से कम पृष्ठभूमि प्रतिदीप्ति होता है, जैसे कि एनाप ( आंकड़े 5 ए, 5 बी) के लिए सिग्नल-टू-बैकग्राउंड अनुपात (डीएफ / एफ) अधिक है।

लीक अभिव्यक्ति के प्रभाव का आकलन करने के लिए, Anap की अनुपस्थिति में अभिव्यक्ति की जांच करना एक महत्वपूर्ण नियंत्रण प्रयोग है। यह पहले से दिखाया गया है कि पृथक वोल्टेज सेंसर डोमेन (आईवीएसडी, 1-382) जिसमें एस 4-एस 5 लिंकर की कमी है और ताकना कार्यात्मक रूप से व्यक्त की गई है। इसलिए, अनप की अनुपस्थिति में, एलओएम 2 स्टेप- W434F चैनल आईवीएस के रूप में व्यक्त करते हैंडी एस के रूप में चित्र 6 में दिखाया गया है। अनाप के साथ पूर्ण लंबाई वाले चैनलों की अभिव्यक्ति में कम या कोई आईवीएसडी धाराएं नहीं होती हैं, जबकि छेड़छाड़ किए गए चैनल अनाप की अनुपस्थिति में मजबूत आईवीएसडी धाराओं का प्रदर्शन करते हैं। ऐसे सी-टर्मिनल कटे हुए प्रोटीन की उपस्थिति डाला स्टॉप कोडन की स्थिति पर निर्भर करती है और अस्वाभाविक अमीनो एसिड के साथ काम करते समय हमेशा ध्यान में रखा जाना चाहिए। एनाप के बिना प्रयोगों को नियंत्रित करना सत्यापन की अनुमति देती है कि क्या एनाप के साथ प्रयोग में हेल्थोलॉगस जनसंख्या मौजूद है।

चित्रा 4
चित्रा 4 : एक साथ गेटिंग कर्नेट्स और प्रतिदीप्ति एक सिंटोकोलिक प्रोटीन सतह से परिवर्तन जो वीसीएफ से प्राप्त होता है। पी / 4 घटाव प्रोटोकॉल के साथ गेटिंग धाराएं और विध्रुवण पर प्रतिदीप्ति की एक साथ रिकॉर्डिंग। अनप को शेखर में एलओएम 2 की स्थिति में शामिल किया गया है, जिससे वो को जन्म दिया गया हैएस 4 हेलिक्स के अंतराल के अंत से लेटेवर-निर्भर प्रतिदीप्ति तीव्रताएं। अधिकतम प्रतिदीप्ति तीव्रता "एफ" को दर्शाती है और प्रतिदीप्ति परिवर्तन "डीएफ़" को दर्शाया गया है। प्रतिदीप्ति परिवर्तन के अंत में सितारा इलेक्ट्रिक शटर (नाड़ी से पहले शटर का उद्घाटन नहीं दिखाया जाता है) के समापन का प्रतीक है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 5
चित्रा 5 : एनाप और टीएमआर के साथ दो रंग का वीसीएफ ( ए ) एनाप और ( बी ) टीएमआर फ्लोरोसेंस के बदलाव शेकर ए 359 सी-एल 382 एनाप-डब्ल्यू 434 एफ से प्राप्त हुए, टीओएमआर-मासीमाइड के साथ लेबल किए गए ओओसाइट को व्यक्त करते हैं। ( सी ) ए और बी से प्रतिदीप्ति परिवर्तन झिल्ली क्षमता (एफवी) के खिलाफ प्लॉट किए जाते हैं। डेटा का मतलब दिखाता है7; एसडी के साथ n = 5 oocytes। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

चित्रा 6
चित्रा 6 : सी टर्मिनल कटौती वाले शेखर चैनल अनाप की अनुपस्थिति में व्यक्त किया गया है। पृथक वोल्टेज सेंसर डोमेन (आईवीएसडी, 1-382) को एएपी की अनुपस्थिति में zH4IR-L382stop-W434F के साथ व्यक्त किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप हाइपरपरॉलराइज की गई क्षमता 1 9 में आईवीएसडी धाराएं होती हैं। हालांकि, एनाप की उपस्थिति में, पूर्ण लंबाई शेखर अभिव्यक्ति आईवीएसडी अभिव्यक्ति के साथ प्रतिस्पर्धा करती है, और परिणामस्वरूप, आईवीएसडी की मात्रा कम है। इस आंकड़े के एक बड़े संस्करण को देखने के लिए कृपया यहां क्लिक करें

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Discussion

टीआरएनए के सतत अमीनोसेलेशन में, जो सतत टीआरएनए-सिंथेटेस के साथ मिलकर लिखे जा रहे हैं, प्रतिदीप्ति माप के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर को प्राप्त करना संभव बनाता है। कुशल एफयूएए निगमन के लिए, यह महत्वपूर्ण है कि पीएनेप नाभिक में सही रूप से इंजेक्शन है। नाभिक के सटीक स्थान की अनिश्चितता के कारण, डीएनए इंजेक्शन के 10-40% असफल होने की संभावना है, जिसके परिणामस्वरूप गैर-व्यक्त (या रिसाव-व्यक्त) oocytes इसलिए, एनाप और पीएएनपी की अनुपस्थिति में रिसाव चैनलों के मामले में वर्तमान फेनोटाइप और परिमाण की पहचान करने के लिए अभिव्यक्ति की जांच करना महत्वपूर्ण है। इस तरह, असफल डीएनए इंजेक्शन (कोई या कम अभिव्यक्ति, कोई अनाप डीएफ नहीं, वर्तमान फ़िनोटाइप काट दिया गया है) के साथ उन लोगों से उचित डीएनए-इंजेक्शन (उच्च अभिव्यक्ति, अनप डीएफ, पूर्ण लंबाई वर्तमान फेनोटाइप) वाले ओओसाइट्स को अलग करना संभव है। अनप के साथ अभिव्यक्ति की अचानक कमी के मामले में, एनाप के लिए एक नया ऐप तैयार करें क्योंकि एनाप लंबा पेरी के लिए स्थिर नहीं हैजलीय समाधान में ओडीएस (1 वर्ष तक)

वीसीएफ़ के साथ एफयूएएएस का उपयोग फ्लोरोफोर्स की पसंद के द्वारा सीमित है क्योंकि प्रत्येक नए एफयूएएए को इंजीनियर होने के लिए एक ओर्थोगोनल टीआरएनए / टीआरएनए सिंथेटेस जोड़ी की आवश्यकता होती है। अभी तक केवल एनाप ओकोइट्स में प्रोटीन गतिशीलता पर रिपोर्ट करने के लिए कार्यात्मक एफयूएएए के रूप में मौजूद है। एनाप प्रतिदीप्ति परिवर्तन का पता लगाने के लिए उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता होती है और हम साइट की संवेदनशीलता के आधार पर 2 - 4000 माइक्रोन -2 के न्यूनतम प्रोटीन घनत्व का अनुमान लगाते हैं। उदाहरण के लिए, एनाप प्रतिदीप्ति परिवर्तन V234Anap (कट-ओपन वोल्टेज क्लैंप में प्रति clamped क्षेत्र प्रति 2.4 x 10 9 चैनलों) के लिए सिर्फ 0.2 एमओएस ईओण धाराओं पर देखा जा सकता है, जबकि गैटिंग धाराओं के 5 एनसी (1 x 10 6 चैनल चैनल प्रति clamped कट-ओपन वोल्टेज क्लैंप में क्षेत्र) A391Anap-W434F के लिए आवश्यक हैं शेखर एक टेट्रामर के रूप में प्रति चैनल में चार एनाप अणु है। नतीजतन, मंद या मोनोमेरिक प्रोटीन को उच्च अभिव्यक्ति के स्तर की आवश्यकता होती है। furtheरमोर, अनाप के विरंजन कैनेटीक्स, जो रासायनिक पर्यावरण और हल्की तीव्रता पर निर्भर करते हैं, को यह सुनिश्चित करने के लिए सत्यापित किया जाना चाहिए कि पूरे प्रोटोकॉल के लिए पर्याप्त तीव्रता बनी हुई है। हमने पाया कि 1 दूसरी समय सीमा में कैनेटीक्स अभी भी एक विशिष्ट वोल्टेज चरण प्रोटोकॉल के साथ दर्ज किया जा सकता है। ब्लीचिंग को हल्की तीव्रता को कम करके कम किया जा सकता है (धीमी प्रक्रियाओं को अधिक फ़िल्टर किया जा सकता है) या ट्रोलल-स्टेट क्वीनशर्स जैसे ट्रोलॉक्स को जोड़ना (एकल अणु प्रतिदीप्ति अध्ययन से जाना जाता है)। अगर एलईडी उत्तेजना का उपयोग किया जाता है, तो एक 5-10 एमएस प्रति 100 प्रतिदीप्ति प्रतिदीप्ति तीव्रता "नमूना" प्रोटोकॉल भी सेटअप कर सकता है, प्रभावी रूप से उत्तेजना के समय 10-20X को कम कर देता है।

वोल्टेज-दबाना फ्लोरायमेट्री झिल्ली प्रोटीन के संरचना समारोह संबंधों का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली तकनीक रही है, और इसे विभिन्न प्रकार के प्रतिदीप्ति तकनीकों के साथ संयोजित किया गया है जिसमें लेबल लिगैंड्स 11 , लांथानाइड-आधारित और फ़ॉर्स्टर रेज़ोनेंस एनर्जी शामिल हैंवाई स्थानांतरण (LRET / FRET) 20 , 21 और संक्रमण धातु FRET 22 हालांकि, लेबलिंग तकनीकों पर सीमाएं व्यापक अनुप्रयोग को बाधित करती हैं आनुवंशिक रूप से एन्कोडेड फ्लोरोसेंट प्रोटीन, जबकि कई अन्य अनुप्रयोगों में अमूल्य, एक सामान्य विकल्प प्रदान करने के लिए बहुत बड़ी हैं। वे सफलतापूर्वक सी-टर्मिनस 23 और बीके के सीए चैनलों के लिगंड बाध्यकारी डोमेन में कार्यरत हैं, लेकिन प्रोटीन के "हॉटस्पॉट्स" में पेश नहीं किए जा सकते हैं। क्षेत्र में फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक अमीनो एसिड की शुरूआत ने दो तरीकों से तकनीक खोल दी 2 : (i) अधिक प्रोटीन का अध्ययन किया जा सकता है क्योंकि अंतर्जात cysteines को हटाया जाना नहीं है; (Ii) साइटोस्लिक और दफन की साइटों को जांच की जाने वाली विनियामक तंत्र की एक व्यापक श्रेणी की अनुमति देने के लिए लेबल किया जा सकता है।

ऑर्थोगोनल टीआरएनए / सिंथेटेड के भविष्य के इंजीनियरिंगनए एफयूएएई के लिए एएसई जोड़े वीसीएफ की और भी आगे बढ़ने की प्रक्रिया में वृद्धि करेंगे। साथ ही, चार-बेस या पांच-बेस कोडन रणनीति 25 , 26 का उपयोग करके विभिन्न एफयूएए के कई संयोजनों को संभव बनाया जा सकता है। उच्च दक्षता के कारण जिसके द्वारा Xenopus oocytes UAA को शामिल करने में सक्षम हैं और वीसीएफ के व्यापक आवेदन, हमें उम्मीद है कि एफयूएएए-वीसीएफ प्रोटीन संरचना और कार्य के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण तकनीक बनने के लिए होगा।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासे के लिए कुछ भी नहीं है।

Acknowledgments

पैनड डॉ। पीटर स्कुल्ज़ (स्क्रिप्स रिसर्च इंस्टीट्यूट) से एक तरह का उपहार था। यह काम कैनेडियन इंस्टिट्यूट फॉर हेल्थ रिसर्च ग्रांट्स एमओपी-1026 9 9 और एमओपी-1368 9 4 (आरबी) और कैनेडियन फाउंडेशन फॉर इनोवेशन ग्रांट 950-225005 द्वारा वित्त पोषित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Barth's solution
NaCl  Sigma-Aldrich S7653 90 mM
KCl Fisher Scientific BP366-500 3 mM
MgSO4 Sigma-Aldrich M-9397 0.82 mM
CaCl2 Sigma-Aldrich C-7902 0.41 mM
Ca(NO3)2 Sigma-Aldrich C-1396 0.33 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5 mM
NaOH hydrate BDH BDH7225-4 pH 7.6
Penicilin Invitrogen 15140122 100 U/mL
Streptomycin Invitrogen 15140122 100 µg/mL
Kanamycin Invitrogen 15160054 10 mg/100mL
Horse Serum (HS) Invitrogen 16050122 5%
SOS Standard Oocyte Solution
NaCl  Sigma-Aldrich 746398 102 mM
KCl Sigma-Aldrich 746436 3 mM
MgCl2 Sigma-Aldrich M9272 1 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 5 mM
External recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Internal recording solution
N-methyl-D-glucamine (NMDG) Alfa Aesar L14282 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) Fisher Scientific E478-500 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
Labeling solution
KOH Fisher Scientific P250-1 115 mM
HEPES Sigma-Aldrich H4034 10 mM
Calcium hydroxide Sigma-Aldrich 239232 2 mM
MES hydrate Sigma-Aldrich 258105 pH 7.2
TMR stock solution
Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) Molcular Probes by Life Technologies T6027 5 mM in DMSO
Anap stock solution
Anap ABZENA (TCRS) Custom synthesis TCRS-170 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N
Name Company Catalog Number Comments
Material/Equipment
pAnap Addgene 48696
High Performance Oocyte Clamp Dagan Corporation CA-1B
Gpatch Acquisition software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Analysis software Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles
Recording Chamber Custom machined
Photo diode detection system Dagan Corporation PhotoMax-200/PIN
Electrical shutter driver UNIBLITZ VCM-D1

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References

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जैव रसायन अंक 123 फ्लोरोसेंट अप्राकृतिक अमीनो एसिड वोल्टेज क्लैंप फ्लोरोमेट्री कटऑप्ट ओओसीइट वोल्टेज क्लैंप एनाप एम्बर स्टॉप कॉडॉन दमन डीएनए माइक्रोइन्ग्नाइजेशन,
वोल्टेज क्लैंप फ्लोराइट्री में<em&gt; Xenopus</em&gt; फ्लोरोसेंट अस्वास्थ्यकर एमिनो एसिड का प्रयोग करने वाले ओक्साइट्स
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Kalstrup, T., Blunck, R. Voltage-clamp Fluorometry in Xenopus Oocytes Using Fluorescent Unnatural Amino Acids. J. Vis. Exp. (123), e55598, doi:10.3791/55598 (2017).

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