Summary
Denne artikel beskriver en forbedring af konventionel spændingsklemmefluorometri (VCF), hvor fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) anvendes i stedet for maleimidfarvestoffer til sondring af strukturelle omlejringer i ionkanaler. Fremgangsmåden indbefatter Xenopus oocyt DNA-injektion, RNA / fUAA-coinjection og samtidige strøm- og fluorescensmålinger.
Abstract
Spændings-clamp Fluorometry (VCF) har været den valgte teknik til at undersøge strukturen og funktionen af elektrogeniske membranproteiner, hvor realtidsmålinger af fluorescens og strømme samtidig rapporterer om lokale omlejringer og global funktion henholdsvis 1 . Mens højopløsningsstrukturteknikker, såsom kryo-elektronmikroskopi eller røntgenkrystallografi, tilvejebringer statiske billeder af proteiner af interesse, giver VCF dynamiske strukturelle data, der tillader os at forbinde strukturelle omlejringer (fluorescens) til dynamiske funktionelle data (elektrofysiologi). Indtil for nylig har den thiolreaktive kemi, der blev anvendt til lokalitetsstyret fluorescerende mærkning af proteinerne, begrænset omfanget af tilgangen, fordi alle tilgængelige cysteiner, herunder endogene, vil blive mærket. Det var således påkrævet at konstruere proteiner fri for endogene cysteiner. Mærkning var også begrænset til steder, der var tilgængelige fra det ekstracellulæreside. Dette ændrede sig ved anvendelse af fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA) til specifikt at inkorporere en lille fluorescerende probe som reaktion på stopkodonundertrykkelse ved anvendelse af et ortogonalt tRNA og tRNA syntetasepar 2 . VCF-forbedringen kræver kun en to-trins injektionsprocedure af DNA-injektion (tRNA / syntetasepar) efterfulgt af RNA / fUAA-co-injektion. Nu er mærkning af både intracellulære og begravede steder mulig, og brugen af VCF er blevet udvidet betydeligt. VCF-teknikken bliver derved attraktiv til at studere en bred vifte af proteiner og - vigtigere - muliggør undersøgelse af mange cytosoliske reguleringsmekanismer.
Introduction
Over 200 unaturlige aminosyrer med forskellige kemiske og fysiske egenskaber er blevet genetisk inkorporeret i proteiner i E. coli , gær og pattedyrsceller 3 . Den unaturlige aminosyre inkorporeres som reaktion på et specifikt stopkodon via et ortogonalt konstrueret tRNA / syntetasepar. Den genetiske tilgang til modifikation af proteiner har givet værdifulde indsigter i proteinstruktur og funktion. Her præsenterer vi en protokol for anvendelse af spændings-clamp fluorometri (VCF) i kombination med en fluorescerende UAA.
I VCF giver den samtidige observation af funktionelle data og strukturelle omlejringer lokaliseret omkring den fluorescerende sonde (~ 5 Å) os mulighed for at opnå dynamisk information med millisekund opløsning 1 . De fluorescerende prober ændrer deres slukningstilstand ved lokaliseret bevægelse af proteinet. En bevægelse på kun 1-2 Å er tilstrækkelig til at føre til signifikante ændringer i fluorescensenIntensitet 4 . Efter identifikation af stedet af interesse i målproteinet, er stedet muteret ved punktmutation. Klassisk havde resten været muteret til en cystein, medens nu introduceres et ravstopkodon (TAG) til genetisk fUAA-inkorporering. Proteinet transkriberes derefter in vitro .
Mens andre ekspressionssystemer ( f.eks. Pattedyrsceller) kan anvendes 5 , 6 , 7 , foretrækkes Xenopus- oocytter for strukturfunktionsstudier på grund af deres større størrelse, hvilket fører til lettere manipulation og højere fluorescensintensitet (mere fluoroforer) Støjforhold. Desuden har Xenopus oocytter lav baggrund fra endogene proteiner 2 , 8 og den mørke pigmentering på dyrepolskærme mod baggrundsfluorescens fra tHan cytosol. Xenopus- oocytterne fjernes kirurgisk, og DNA kodende for det ortogonale tRNA / tRNA-syntetasepar, der er specifikt for fUAA, injiceres i kernen af oocytterne. Efter en 6-24 h inkubationstid co-injiceres protein RNA med fUAA i cytosolet i oocytterne efterfulgt af en 2-3 dages inkubationsperiode. For at forhindre skade på fUAA (fotoblegning) skal procedurerne herunder Anap udføres under rødt lys for at undgå fluoroforekspitering.
Oocytter studeres på en åbent oocyt spændingsklemmeopsætning, som er monteret på et opretstående fluorescensmikroskop, og elektriske strøm- og fluorescensændringer registreres samtidigt 9 , 10 . Alternativt kan toelektrodspændingsklemme 1 eller patch-clampkonfigurationer 11 anvendes. Fluorescens er ophidset af passende bølgelængder med lav RMS støj og Emission registreret ved anvendelse af en fotodiode forbundet til en forstærker med høj amplifikation.
Der er flere fordele ved at anvende fluorescerende unaturlige aminosyrer (fUAA'er) i spændingsklemmefluorometri. Den ene er adgang til den cytosoliske side af membranproteinerne; Mange reguleringsprocesser er placeret her ( f.eks. Ca 2+ - eller nukleotidbindingssteder, hurtig og lukket tilstand inaktivering af spændingsgatede ionkanaler, poreåbning, modulkobling). Alle disse processer er nu tilgængelige for fluorescerende mærkning.
En anden fordel er probens lille størrelse, der fører til mindre forstyrrelse af proteinet. Hidtil er to ortogonale tRNA / tRNA syntetasepar til fUAA'er blevet konstrueret 12 , 13 , hvor 3- (6-acetylnaphthalen-2-ylamino) -2-aminopropansyre (Anap) er den eneste fUAA, der er blevet anvendt i Xenopus- oocytter 2 ,"Xref"> 8. Anap er en miljømæssig følsom fluorofor med en molekylvægt på 272,3 g / mol og er kun lidt større end tryptophan 12 ( figur 1A, 1B ). På grund af sin lille størrelse er det sandsynligvis, at færre steriske virkninger introduceres af fluoroforen sammenlignet med konventionelle fluoroforer, der er fæstnet via en linker (typisk mere end 500 g / mol). Desuden ligger fluoroforen i tilfælde af Anap tættere på proteinhvirvelen end de, der er forbundet med cystein, og følgelig undersøger Anap flere lokaliserede omlejringer. Endelig er fjernelse af endogene cysteiner i konventionel VCF for at sikre stedsspecifik mærkning ikke længere et krav i UAA-VCF, og derfor (i) efterlader proteinerne i (næsten) deres oprindelige tilstand og (ii) tillader VCF at blive anvendt At studere et bredere udvalg af proteiner, hvor funktionen kan ændres ved cysteinsubstitution.
Figur 1 : Anap- og fluorescensspektra. ( A ) Kemisk struktur af Anap. ( B ) Normaliseret absorptionsspektrum og emissionsspektre for 1 nM Anap, der demonstrerer følsomheden af Anap fluorescens til opløsningsmiddelhydrofobiciteten. Emissionsspektre blev opnået ved spænding ved 350 nm. Klik her for at se en større version af denne figur.
En ulempe ved at anvende fluorescerende UAA'er er, at en heterogen population af proteiner kan resultere i stopkodon-gennemlæsning, translationel reinitiation, C-terminale trunkerede proteiner eller crosstalk med endogen aminacylering, hvis mængden af aminoacylerede tRNA'er er knappe. Sådant lækageekspres bør altid kontrolleres i fravær af fUAA og tRNA / tRNA syntetaseparet. Vi behandlede spørgsmålet om transLational reinitiation og hvordan man omgå det for N-terminale indsættelsessteder tidligere 14 . Når fUAA-, tRNA- og tRNA-syntetasen er til stede i mættede mængder, forbliver der imidlertid kun en lav sandsynlighed for lækageudtryk.
Den centrale proceduremæssige forskel mellem fUAA-VCF og konventionel VCF er injektion og håndtering af oocytterne; Injektionen af DNA kodende for tRNA og tRNA syntetase (pAnap) efterfølges af introduktionen af Anap, som enten co-injiceres med protein mRNA eller alternativt tilsættes til inkubationsopløsningen som en acetoxymethyl (AM) ester.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Frog manipulationer blev udført i overensstemmelse med de canadiske retningslinjer og er blevet godkendt af etiske udvalg (CDEA, protokol nr. 15-042) af University of Montréal.
1. mRNA-præparation for fUAA-inkorporering
- Vælg et område af interesse for proteinet, hvor konformationelle ændringer forventes at forekomme. Vælg en aminosyre i denne region for at være substitueret for fUAA.
BEMÆRK: Valg af position er baseret på de strukturelle omlægninger, der forventes. Hvis der findes en højopløsningsstruktur og en hypotese af de forventede bevægelser, skal anabenen placeres sådan, at det kemiske miljø vil ændre sig; Dette kan enten være en ændring i den dielektriske konstant (hydrofob versus hydrofil miljø) eller, mere sandsynligt, slukning af en anden aminosyre. De bedste quenchers er tryptofaner. Anap bør være i kontakt med quencheren i en tilstand (overlapning af van-der-Waals radii) og fri for det iden anden. Hvis der ikke findes strukturer eller modeller med høj opløsning, skal man scanne regionen af interesse. I begge tilfælde er det tilrådeligt at vælge flere nærliggende steder for at øge sandsynligheden for at opnå ekspressions- og fluorescenssignal. For at minimere steriske virkninger under proteinmætning og / eller funktion kan man vælge at erstatte store og aromatiske aminosyrer (Phe, Trp, Tyr). Forfatterne har imidlertid oplevet, at scanning af en region af interesse for fUAA-indsættelse uanset den substituerede aminosyre, er mere produktiv. - Indsæt en ravstopkodon (TAG) på det valgte sted ved anvendelse af stedrettet mutagenese 15 . Sørg for, at proteinet af interesse ikke slutter på et gule stopkodon (TAG). Hvis det er tilfældet, mutere til en anden (oker eller opal stop codon). Forstærker, isolerer og sekvenserer DNA'et. Hent protein mRNA med in vitro transkription 16 og opbevar mRNA ved 20 ° C eller 80 ° C. </ Ol>
- Kirurgisk opnår trin V- eller VI-oocytter fra Xenopus laevis- frøer og defolliculate med collagenase som tidligere beskrevet 17 .
- Bedøve frøer med en passende bedøvelse ifølge den godkendte dyreprotokol (her: 3-aminobenzoesyreethylester). Når de undlader at reagere på en blid klemme til en tåspids (tab af tilbagetrækningsreflex), så er de passende bedøvet til operation.
- Fjern straks frøerne fra bedøvelsesopløsningen og skyll huden grundigt med frisk vand. Denne skylning forhindrer dyret i at falde ind i dybere niveauer af anæstesi ved at fjerne uabsorberet kemikalie fra hudoverfladen.
- Fjern ovale knuder fra den ene side kirurgisk og åbner omhyggeligt nøglerne ved hjælp af to tang. Inkuber og omrør oocyterne i "standard oocytopløsning" (SOS) indeholdende 1% (w / v) kollagenase i 20-30 minutterAt defolliculate. Vask tre gange med SOS-opløsning.
- Vælg store og sunde oocytter individuelt og inkubér dem i Barths opløsning suppleret med antibiotika (100 U / ml penicilin, 100 μg / ml streptomycin, 10 mg / 100 ml kanamycin) og 5% hesteserum ved 18 ° C i mindst 4 timer før injektion .
BEMÆRK: Efter 2 - 4 operationer med en 4 måneders forsinkelse imellem er Xenopus laevis euthaniseret ved langvarig (> 1 time) inkubation med 3-aminobenzoesyreethylester.
- For nuklear injektion af DNA, lav en lang og tynd injektionsspids for at kunne nå kernen og undgå at skade oocyten. Fyld injektionsspidsen med olie og monter den på nanoinjektorenheden.
- Installer nano-injektoren under et stereomikroskop og brug tang for at bryde enden af spidsen. Skub olien ud, indtil der ikke er luftbobler fanget inde i spidsens ende.
- Anbring 1 μl 0,1 μg /# 181; L pAnap i nukleasefrit vand indeholdende NaOH (1% 1N NaOH) på et stykke parafilm under et stereoskop og udfyld injektionsspidsen med DNA'et.
- Overfør 40 oocytter til en maskeret indsprøjtningsskål, der indeholder Barths opløsning suppleret med antibiotika.
BEMÆRK: For at lave den maskerede indsprøjtningsskål skal du skære et stykke 800 μm nylonnet af passende størrelse for at fylde en polystyren-petriskål. Tilsæt chloroform til midten, og læg derefter masken på toppen. Hold masken fladt, indtil plastet sætter. - Da oocytkernen er placeret i dyrets (mørke) pol, skal du indsprøjte spidsen i dyrepolen og indgyde sådan, at spidsen når tæt på midten af dyrets halvkugle (eller 2-3 gange dybden i forhold til RNA-injektion ). Injicer 9,2 nL pAnap ind i kernen af hver oocyt. Den tynde spids og lille indsprøjtningsvolumen kan resultere i uregelmæssig injektion eller blokeret spids. Kontroller lejlighedsvis, om injektionen virker ved at injicere i luften.
BEMÆRK: Om DNA'et bliver ordentligt injiceret i kernen er usikkert. Forvent derfor at 10-40% af oocytterne ikke udtrykker tRNA / syntetaseparret. Se diskussion for yderligere uddybning. - Inkuber oocytterne i 2 ml Barths opløsning suppleret med antibiotika og 5% hesteserum (HS) ved 18 ° C i 6-24 timer for at tillade robust ekspression af Anap-specifikke tRNA'er og tRNA-syntetaser.
BEMÆRK: DNA inkubationstid kan vare flere dage før RNA injektion, men det øger ikke ekspressionen. - Forbered nanoinjektoren til RNA-injektion (samme som trin 2.2, men injektionsspidsen behøver ikke at være så tynd som til injektion af DNA). Arbejd kun under rødt lys fra dette punkt for at forhindre photobleaching af Anap.
- Bland 1 μl 1 mM Anap med 1 μL 1-2 μg / μL mRNA direkte på et stykke parafilm og fyld injektionsspidsen med den blandede opløsning. Impale lige under membranen i vegetalen(Lyse) pol og indsprøjt 46 nL i hver pAnap-injiceret oocyt.
BEMÆRK: Den krævede mRNA-koncentration afhænger af proteinet af interesse. - Inkuber de oocytter beskyttet mod lys i en kasse eller indpakket i aluminiumsfolie, i Barths opløsningstilskudte antibiotika og 5% hesteserum ved 18 ° C i 2-3 dage. Udveksle med frisk Barths opløsning hver dag og fjern døde oocytter for at undgå forurening.
- Installer spærringsudstyret med åbent oocyt-spændingsudstyr som tidligere beskrevet 18 .
- Monter elektrofysiologi-optagelsessystemet på et opretstående fluorescensmikroskop ved at installere optagekammeret på en skyder, som gør det muligt at flytte det mellem standard stereoskopet for at placere oocyt og mikroskop for at udføre fluorescensmålingerne ( figur 2c ).
BEMÆRK: Kammerets geometri til cut-open-oocytter er ikke egnet til at anvende det normale traNsmitted lys til belysning under manipulation. Derfor bruges en "gooseneck" halogenlampe med rødt filter til at belyse sidelæns fra toppen. Mikroskopets kondensator kan fjernes, hvilket gør plads til at sænke scenen for elektrofysiologikammeret. - Tilslut et fotodiode detekteringssystem til fluorescensmikroskopets C-mount udgangsport ( figur 2a ). Tilslut fotokorrektion til en anden indgangskanal i den digitale signalprocessor (DSP, analog / digital - digital / analog konverter).
- Brug en 100 W, 12 V halogen lampe som lyskilde til fluorescens excitation.
BEMÆRK: Alternativt kan Hg-brændere anvendes, men skal reduceres i intensitet for at forhindre for hurtig fotobling under optagelser. LED-belysning anbefales kun, hvis de respektive lysdioder viser signifikant intensitet i excitationsområdet ( f.eks. ~ 350 nm for Anap). De fleste hvide lysdioder når ikke langt ind i UV-spektret. - InsEr en elektrisk styret lukker mellem excitations lyskilde og mikroskop og forbinder sin kontrol (typisk TTL-puls) til en digital udgang fra DSP'en. Tid TTL-pulsen i optagelsessoftwaren (se producentens dokumentation), således at lukkeren åbner ~ 100 ms før begyndelsen af optagelsen. På denne måde påvirker enhver vibration under åbningsprocessen ikke optagelsen. Tiden afhænger af lukkerens hastighed og vibration. Afslut pulsen 5ms før slutningen af optagelsen som vist i figur 4 . På den måde registreres værdien for den samlede fluorescens også.
- Indsæt en passende filterkube (excitationsfilter, dichroisk spejl og emissionsfilter) i filterkubetårnet. Til Anap, brug Ex: 377/50 nm bandpass, dichroisk 409 nm longpass og Em: 470/40 nm bandpass.
- Følg forberedelse trin for cut-open oocyte spænding-klemme som tidligere beskrevet og visualiseret 18 (agar bro forberedelse, montering af oocyten, saponin permeabilization). Men arbejde under rødt lys til enhver tid for at undgå blegning af fluoroforen forud for optagelser. Sørg for at dyrestangen vender opad, når du placerer oocyten. Pigmenteringen under dyrepolmembranen beskytter mod autofluorescens stammende fra cytosolen og reducerer derfor baggrundsfluorescens.
- Skub kammeret over til mikroskopet og fokus med et 4X objektiv.
- Impalere oocyten med den spændingsfølsomme V1-elektrode (3 M KCl), skift til 40X vanddypning (NA 0,8 - 0,9). Fokus på dyrestangen, der vender opad.
- Sluk det røde lys. Vælg den rigtige filterkube ved at dreje filterkubetårnet og den optiske udgangsport er forbundet til fotodioden. Tænd for halogenEn lampe med højeste intensitet og kortvarigt slukke lukkeren åben i 2-5 s for at læse baggrundsfluorescensintensiteten stammer fra oocyten. Med den beskrevne opsætning bør værdien være omkring 50-200 pA for Anap.
- Tænd klampen, vri bad / vagtkontakten til aktiv og juster membranpotentialet (V1 - V2) til kommandopotentialet ved at dreje knappen på I hovedstage.
- Vælg holdpotentiale, trinprotokol, nummer og længde af pulser etc. i optagelsessoftwaren. Optag spændingsafhængige strømme og Anap fluorescensintensiteter.
- For at overvåge to steder i samme protein samtidigt mutere en ekstracellulær og tilgængelig aminosyre i cystein og fjern andre cysteiner for at sikre specifik mærkning med thiolkemi.
- Udfør trin 2.1-2.5.
- Inden VCF-optagelser inkuberes oocytter i 5 μM TMR-maleimid i mærkningsløsning i 15 minutter (eller andet farvestofMed ikke-overlappende spektre sammenlignet med Anap).
- Vask oocytterne med mærkningsløsning tre gange for at fjerne overskydende farvestof.
- Udfør trin 4.1-4.6.
- Indsæt en passende filterkube for TMR (excitationsfilter, dichroisk spejl og emissionsfilter) i filterkubetårnet. Skift til TMR filterkuben ved at dreje filtertårnet.
- Læs baggrundsfluorescensen for TMR som beskrevet for Anap i trin 4.4.
BEMÆRK: Mærkning med thiolkemi resulterer i høj baggrundsfluorescens på grund af uspecifik mærkning i membranen. Derfor kan TMR-baggrundsfluorescensen mætte forstærkeren (> 2000 pA). I så fald må du ikke reducere lysintensiteten, men blot subtrahere baggrundsfluorescensen ved at tilføje en forskydningsstrøm til fotodioden. I kommercielt tilgængelige systemer bruger "sample-and-hold" -funktionen på detektorsystemet. Bemærk baggrundsfluorescensværdien (ved anvendelse af et 10X neutralt densitetsfilter) i et laboratorium jOurnal, da denne værdi ikke registreres (mætning). - Optag spændingsafhængige strømme og TMR fluorescensintensiteter samtidigt som i trin 4.6.
2. Oocytforberedelse og injektion
Figur 2 : Illustration af DNA- og RNA-injektion i Xenopus- oocytter til Anap-inkorporering.
For det første injiceres pAnap i kernen af Xenopus oocyten ( 1 ). Efter 6-24 timer samles anap og kanal RNA i vegetabilsk pol ( 2 ). Anap vil være ortogonalt aminoacyleret med tRNA'et, der bærer et ravstop-anti-kodon, ved aminoacyl-tRNA-syntetasen, der er kodet af pAnap. På denne måde genkendes de aminoacylerede anap-tRNA'er af ribosomet ved det indsatte amberstopkodon i channeL RNA, hvilket resulterer i undertrykning af stopkodonen og indsættelse af Anap. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. VCF Setup
Figur 3 < / Strong> : VCF opsætning. ( A ) Set fra siden af VCF-opsætningen, der viser lysbanen inde i mikroskopet. Filterkuben indeholder et excitationsfilter, dichroisk spejl og et emissionsfilter. ( B ) Udvalgte oocytkammerdimensioner er 3,4 cm for øvre kammerradius (1), 5,5 cm til bundkammerlængde (2), 1,4 cm for bundkammerbredde (3) og 1,7 cm for midterkammerbredde (4). ( C ) Set forfra på VCF-opsætningen. Den første okulære til venstre er til montering af oocyten i det spærrede spændingskammer og for permeabilisering. Derefter glider kammeret under mikroskopet ved den anden okulære til højre. Her indsættes V1-elektroden i oocyten ved hjælp af 4X-objektivet, og fluorescens registreres ved brug af 40X-objektivet med vanddypning. Klik her for at se en større version af denne figur.
5. To-farve VCF
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Figur 4 viser et eksempel på VCF-optagelser opnået fra en oocyt-udtrykkende Shaker-kanaler med hurtig inaktivering fjernet (IR), L382stop-W434F i nærvær af pAnap og Anap. W434F mutationen blokerer de ioniske kaliumstrømme, som gør det muligt at måle de forbigående gating charge forskydninger (gating strømme). De samtidige optagelser af gatingstrømme (øvre spor) og Anap fluorescensintensitetsændringer (lavere spor) ved depolarisering demonstrerer den vellykkede inkorporering af Anap i position L382. Her ligger Anap på bunden af hver af de fire S4 transmembrane helixer, der bevæger sig under aktivering (L382) og rapporterer således om intracellulære lokale omlejringer. En fluorescensændring kan skyldes opløsningsmiddelrelaksation (miljøpolaritetsændringer) og / eller quenching med andre aminosyrer 4 . Begge mekanismer er et resultat af relative proteinomlægninger. Figur 5 viser Anap og TMR fluorescenssignaler ved anvendelse af trinprotokoller opnået fra samme oocyt. Ved at tilføje A359C mutationen i L382stop-W434F baggrunden og mærkning med TMR-maleimid er det muligt med den beskrevne teknik at sonde real-time bevægelser i forskellige regioner i samme protein. I dette tilfælde analyserer TMR bevægelsen af den øvre S4-spiral (A359C), mens Anap udsender bevægelsen af bunden af S4 (L382). Fra tidspunktet for fluorescensændringen kan man hente dynamisk information af overgangen overvåget af fluorescensen ved at analysere kinetikken ( fig. 5A, 5B ). Desuden opnås fluorescensspændingsforholdet (FV) ved at udforme den steady-state fluorescensintensitet mod spænding ( figur 5C ). FV afspejler ligevægten mellem beboelser af overvågede tilstande, som i tilfælde af ionkanaler kunne følge vOltage sensor bevægelse eller åbning af den centrale pore. Ved at bruge fUAA'er er det nu muligt at få FV fra indersiden af kanalen. Figur 5C viser, at den øverste del af S4 (TMR) har den samme spændingsafhængighed som den nederste del af S4 (Anap).
Signal-støjforholdet er hovedsageligt afhængigt af den relative fluorescensændring (dF / F) og den totale fluorescens. DF / F definerer signalstørrelsen, medens støjen bestemmes af den totale fluorescens på grund af lysets kvante karakter (Poisson-støj). DF / F vil afhænge af tilstanden af quenching i de forskellige tilstande af proteinet og besættelsen af staterne ( fx den åbne sandsynlighed). Den totale fluorescens omfatter fluorescensen fra specifik mærkning og fra uspecifik baggrundsmærkning. Den totale specifikke fluorescens er defineret af antallet af udtrykte proteiner og kvanteudbyttet af fluoroforet. Den store overflade af XeNopus oocytter er fordelagtige, fordi det øger antallet af bidragende proteiner.
Anapets kvantumudbytte, dvs. antallet af fotoner udgivet per excitationscyklus eller "lysstyrken" af fluoroforen, er lavere, hvilket fører til lavere total fluorescensintensitet og derved lavere signal-støjforhold. På samme tid fører Anap-mærkning til lav baggrundsfluorescens således, at signal-til-baggrundsforholdet (dF / F) er højere for Anap ( Figur 5A, 5B ).
Et vigtigt kontrolforsøg er at kontrollere udtryk i mangel af Anap for at vurdere effekten af lækageudtryk. Det har tidligere vist sig, at isolerede spændingssensor domæner (iVSDs, 1-382), der mangler S4-S5 linkeren, og porerne er funktionelt udtrykt 19 . Derfor, i mangel af Anap, udtrykker L382stop-W434F kanaler som iVSDs som vist i figur 6 . Udtryk af fuld længde kanaler med Anap har ringe eller ingen iVSD strømme, mens trunkerede kanaler udviser stærke iVSD strømme i mangel af Anap. Tilstedeværelsen af sådanne C-terminale trunkerede proteiner afhænger af positionen af det indsatte stopkodon og bør altid tages i betragtning ved arbejde med unaturlige aminosyrer. Kontrolforsøg uden Anap tillader verifikation, om en heterolog population er til stede i forsøg med Anap.
Figur 4 : Samtidige gatingstrømme og fluorescensændringer fra en cytosolisk proteinoverflade opnået med VCF. Gatingstrømme opnået med en P / 4-subtraktionsprotokol og samtidig optagelse af fluorescens ved depolarisering. Anap er inkorporeret i Shaker i position L382, hvilket giver anledning til voSpændingsafhængige fluorescensintensiteter fra den intracellulære ende af S4-helixen. Den maksimale fluorescensintensitet betegnes "F", og fluorescensændringen betegnes "dF". Stjernen i slutningen af fluorescensændringen markerer lukkningen af den elektriske lukker (åbningen af lukkeren, før pulsen ikke vises). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5 : Tofarvet VCF med Anap og TMR. ( A ) Anap og ( B ) TMR fluorescensændringer opnået fra en Shaker A359C-L382Anap-W434F ekspression af oocyt mærket med TMR-maleimid. ( C ) Fluorescensændringer fra A og B er plottet imod membranpotentialet (FV). Data viser gennemsnit7; SD med n = 5 oocytter. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6 : C-terminale trunkerede shakerkanaler udtrykkes i mangel af anap. Isolerede spændingsfølerdomæner (iVSD, 1-382) udtrykkes med zH4IR-L382stop-W434F i fravær af Anap, hvilket resulterer i iVSD-strømmer ved hyperpolariserede potentialer 19 . I nærværelse af Anap konkurrerer Shaker-ekspression i fuld længde med iVSD-ekspression, og som følge heraf er mængden af iVSD mindre. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In vivo aminoacyleringen af tRNA'er, som kontinuerligt transkriberes sammen med tRNA-syntetasen, gør det muligt at opnå høje ekspressionsniveauer for fluorescensmålinger. Til effektiv fUAA-inkorporering er det kritisk, at pAnap injiceres korrekt i kernen. På grund af usikkerheden om den nøjagtige placering af kernen forventes 10-40% af DNA-injektionerne at mislykkes, hvilket resulterer i ikke-ekspression (eller lækageudtrykkende) oocytter. Derfor er det vigtigt at kontrollere udtryk i mangel af Anap og pAnap for at identificere aktuelle fænotyper og størrelser i tilfælde af lækager. På den måde er det muligt at skelne oocytter med korrekte DNA-injektioner (høj ekspression, Anap dF, fuld længde nuværende fænotype) fra dem med mislykkede DNA-injektioner (ingen eller lav ekspression, ingen Anap dF, trunkeret nuværende fænotype hvis nogen). I tilfælde af pludselige manglende udtryk med Anap, lav en ny Anap-alikvot, da Anap ikke er stabil for længere periOds i vandig opløsning (op til 1 år).
Anvendelsen af fUAA'er med VCF er begrænset ved valget af fluoroforer, da hver ny fUAA kræver et ortogonalt tRNA / tRNA syntetasepar, som skal konstrueres. Hidtil eksisterer kun Anap som en funktionel fUAA for at rapportere om proteindynamik i oocytter. Høje ekspressionsniveauer er nødvendige for at detektere Anap fluorescensændringer, og vi estimerer en minimal proteintæthed på 2 - 4000 μm - 2 afhængigt af områdets følsomhed. For eksempel kan anap fluorescensændringer ses ved kun 0,2 mS ioniske strømninger for V234Anap (2,4 x 10 9 kanaler pr. Klemmet område i spærre), mens 5 nC gatingstrømme (1 x 10 6 kanaler kanaler pr. Klemme Område i spærre med spærre) er påkrævet til A391Anap-W434F. Som Shaker er en tetramer har den fire Anap molekyler pr. Kanal. Følgelig kræver dimerer eller monomere proteiner sandsynligvis højere ekspressionsniveauer. furtheRage, blegekinetik af Anap, der afhænger af det kemiske miljø samt lysintensiteten, bør verificeres for at sikre, at tilstrækkelig intensitet forbliver for hele protokollen. Vi fandt ud af, at kinetikken i 1 sekunders rækkevidde stadig kan optages med en typisk spændingstastprotokol. Blegningen kan minimeres ved at reducere lysintensiteten (langsome processer kan filtreres mere) eller tilsætte triplet-state quenchers såsom Trolox (kendt fra single molecule fluorescence undersøgelser). Hvis LED excitation anvendes, kan man også opsætte en protokol til at "prøve" fluorescensintensiteten hver 100 ms i 5-10 ms, hvilket effektivt reducerer excitationstiden 10-20X.
Spændingsklemmefluorometri har været en kraftfuld teknik til at studere strukturfunktionsforholdet mellem membranproteiner, og det er blevet kombineret med en række fluorescensteknikker, herunder mærket ligander 11 , lanthanidbaserede og Förster Resonance EnergY Overførsel (LRET / FRET) 20 , 21 og overgangsmetal FRET 22 . Men begrænsninger på mærkningsteknikkerne hindrede den udbredt anvendelse. Genetisk kodede fluorescerende proteiner, mens de er uvurderlige i mange andre applikationer, er for store til at tilbyde et generelt alternativ. De har med succes været anvendt i C-terminus 23 og ligandbindende domæne af BK Ca- kanaler 24 , men kan ikke indføres i "hotspots" af proteinet. Indførelsen af fluorescerende unaturlige aminosyrer i feltet åbnede teknikken på to måder 2 : (i) mange flere proteiner kan studeres, da ikke længere endogene cysteiner skal fjernes; (Ii) cytosoliske og begravede steder kan mærkes, hvilket gør det muligt at undersøge et bredere udvalg af reguleringsmekanismer.
Fremtidig teknik af ortogonalt tRNA / syntetAse par for nye fUAA'er ville øge anvendeligheden af VCF endnu mere. Derudover kunne multiple inkorporeringer af forskellige fUAA'er gøres mulige ved anvendelse af en firebaseret eller fembaseret kodonstrategi 25 , 26 . På grund af den høje effektivitet, hvormed Xenopus oocytter er i stand til at inkorporere UAA'er og den udbredte anvendelse af VCF, forventer vi fUAA-VCF at blive en nøgleteknik inden for proteinstruktur og funktion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
PAnap var en venlig gave fra Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Dette arbejde blev finansieret af de canadiske institutter for sundhedsforskningstilskud MOP-102689 og MOP-136894 (til RB) og Canadian Foundation for Innovation Grant 950-225005.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90 mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3 mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82 mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41 mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100 U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100 µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10 mg/100mL |
| Horse Serum (HS) | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10 mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2 mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5 mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1 mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1 N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 |
References
- Mannuzzu, L. M., Moronne, M. M., Isacoff, E. Y. Direct physical measure of conformational rearrangement underlying potassium channel gating. Science. 271 (5246), 213-216 (1996).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Dynamics of internal pore opening in K(V) channels probed by a fluorescent unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (20), 8272-8277 (2013).
- Xiao, H., Schultz, P. G. At the Interface of Chemical and Biological Synthesis: An Expanded Genetic Code. Cold Spring Harb Perspect Biol. 8 (9), (2016).
- Blunck, R. Chapter 9. Handbook of Ion Channels. , CRC Press. 113-133 (2015).
- Chatterjee, A., Guo, J., Lee, H. S., Schultz, P. G. A genetically encoded fluorescent probe in mammalian cells. J Am Chem Soc. 135 (34), 12540-12543 (2013).
- DeBerg, H. A., Brzovic, P. S., Flynn, G. E., Zagotta, W. N., Stoll, S. Structure and Energetics of Allosteric Regulation of HCN2 Ion Channels by Cyclic Nucleotides. J Biol Chem. 291 (1), 371-381 (2016).
- Shen, B., et al. Genetically encoding unnatural amino acids in neural stem cells and optically reporting voltage-sensitive domain changes in differentiated neurons. Stem Cells. 29 (8), 1231-1240 (2011).
- Aman, T. K., Gordon, S. E., Zagotta, W. N. Regulation of CNGA1 Channel Gating by Interactions with the Membrane. J Biol Chem. 291 (19), 9939-9947 (2016).
- Haddad, G. A., Blunck, R. Mode shift of the voltage sensors in Shaker K+ channels is caused by energetic coupling to the pore domain. J Gen Physiol. 137 (5), 455-472 (2011).
- Batulan, Z., Haddad, G. A., Blunck, R. An intersubunit interaction between S4-S5 linker and S6 is responsible for the slow off-gating component in Shaker K+ channels. J Biol Chem. 285 (18), 14005-14019 (2010).
- Kusch, J., et al. How subunits cooperate in cAMP-induced activation of homotetrameric HCN2 channels. Nat Chem Biol. 8 (2), 162-169 (2012).
- Lee, H. S., Guo, J., Lemke, E. A., Dimla, R. D., Schultz, P. G. Genetic incorporation of a small, environmentally sensitive, fluorescent probe into proteins in Saccharomyces cerevisiae. J Am Chem Soc. 131 (36), 12921-12923 (2009).
- Summerer, D., et al. A genetically encoded fluorescent amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (26), 9785-9789 (2006).
- Kalstrup, T., Blunck, R. Reinitiation at non-canonical start codons leads to leak expression when incorporating unnatural amino acids. Sci Rep. 5, 11866 (2015).
- Liu, H., Naismith, J. H. An efficient one-step site-directed deletion, insertion, single and multiple-site plasmid mutagenesis protocol. BMC Biotechnol. 8, 91 (2008).
- Beckert, B., Masquida, B. Synthesis of RNA by in vitro transcription. Methods Mol Biol. 703, 29-41 (2011).
- Goldin, A. L. Maintenance of Xenopus laevis and oocyte injection. Methods Enzymol. 207, 266-279 (1992).
- Rudokas, M. W., Varga, Z., Schubert, A. R., Asaro, A. B., Silva, J. R. The Xenopus oocyte cut-open vaseline gap voltage-clamp technique with fluorometry. J Vis Exp. (85), (2014).
- Zhao, J., Blunck, R. The isolated voltage sensing domain of the Shaker potassium channel forms a voltage-gated cation channel. Elife. 5, (2016).
- Posson, D. J., Ge, P., Miller, C., Bezanilla, F., Selvin, P. R. Small vertical movement of a K+ channel voltage sensor measured with luminescence energy transfer. Nature. 436 (7052), 848-851 (2005).
- Chanda, B., Asamoah, O. K., Blunck, R., Roux, B., Bezanilla, F. Gating charge displacement in voltage-gated ion channels involves limited transmembrane movement. Nature. 436 (7052), 852-856 (2005).
- Taraska, J. W., Puljung, M. C., Zagotta, W. N. Short-distance probes for protein backbone structure based on energy transfer between bimane and transition metal ions. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16227-16232 (2009).
- Baker, B. J., et al. Genetically encoded fluorescent sensors of membrane potential. Brain Cell Biol. 36 (1-4), 53-67 (2008).
- Miranda, P., et al. State-dependent FRET reports calcium- and voltage-dependent gating-ring motions in BK channels. Proc Natl Acad Sci U S A. , (2013).
- Sisido, M., Ninomiya, K., Ohtsuki, T., Hohsaka, T. Four-base codon/anticodon strategy and non-enzymatic aminoacylation for protein engineering with non-natural amino acids. Methods. 36 (3), 270-278 (2005).
- Hohsaka, T., Ashizuka, Y., Murakami, H., Sisido, M. Five-base codons for incorporation of nonnatural amino acids into proteins. Nucleic Acids Res. 29 (17), 3646-3651 (2001).
