Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Chemistry
Click here for the English version

Chemistry

استخراج وتنقية البوليفينول من تجميد المجفف بيري مسحوق لعلاج خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية Published: July 5, 2017 doi: 10.3791/55605
Automatic Translation
1, 2,3, 2, 2, 2,3, 2,3
1Department of Dietetics and Nutrition, University of Arkansas for Medical Sciences, 2Department of Nutrition, Food and Exercise Sciences, Florida State University, 3Center for Advancing Exercise and Nutrition Research on Aging (CAENRA), Florida State University

Summary

هذا العمل تفاصيل طريقة خطوة بخطوة لإعداد مقتطفات الغنية بالبوليفينول من مسحوق التوت المجففة. وبالإضافة إلى ذلك، فإنه يوفر وصفا دقيقا لكيفية استخدام هذه المستخلصات الغنية بوليفينول في ثقافة الخلية في وجود هرمون الببتيد أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) باستخدام خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس).

Abstract

وتشير الدراسات الوبائية إلى أن زيادة تناول الفلافونويد يرتبط بانخفاض معدل الوفيات بسبب أمراض القلب والأوعية الدموية في الولايات المتحدة (الولايات المتحدة) وأوروبا. وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها محتوى بوليفينوليكي عالي. وقد تبين أن البوليفينول تتفاعل مع العديد من الأهداف الجزيئية وممارسة العديد من الوظائف البيولوجية الإيجابية، بما في ذلك الآثار المضادة للأكسدة، المضادة للالتهابات، والقلبية. البوليفينول معزولة من بلاك بيري (بل)، التوت (رب)، التوت الأسود (برب) تقليل الإجهاد التأكسدي والشيخوخة الخلوية ردا على أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني). يوفر هذا العمل وصفا تفصيليا للبروتوكول المستخدم لإعداد مقتطفات البوليفينول من التوت المجففة التجميد. وقد أجريت الاستخلاصات من البوليفينول من مسحوق التوت المجففة باستخدام 80٪ من الإيثانول المائي وطريقة الاستخلاص بمساعدة الموجات فوق الصوتية. كما تم تنقية المستخلص الخام وتجزئته باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل،على التوالي. تم اختبار آثار كل من المستخلصات الخام والمنقى على خلايا العضلات السلسية الوعائية (فسمكس) في الثقافة.

Introduction

البوليفينول هي مركبات تحتوي على حلقة الفينول واحدة على الأقل في هيكلها وهي موجودة بوفرة في المملكة النباتية 1 . وقد استهلك البشر النباتات لآلاف السنين لأغراض طبية دون أن يكون على بينة من وجود مثل هذه المركبات 2 . العديد من الفواكه والخضروات لديها بعض المركبات بوليفينوليك المشتركة، وإن كان بكميات مختلفة، بما في ذلك الفلافونويد، ستيلبينس، والأحماض الفينولية 3 . على الرغم من أن البوليفينول غالبا ما ترتبط مع الفواكه والخضروات الملونة، وهذا ليس صحيحا تماما. على سبيل المثال، زياكسانثين و زانثين موجودة في الخضروات التي ليست ملونة للغاية، مثل البصل والثوم، والتي هي من عائلة البصل الأخضر وترتبط مع العديد من الفوائد الصحية 4 . وبصرف النظر عن كونها مرتبطة مع العديد من الفوائد الصحية 5 ، البوليفينول أيضا خدمة النباتات من خلال حمايتهم من الحشرات أد الأشعة فوق البنفسجية 2 . بوليفينول عادة ما توجد في النظام الغذائي البشري وتعتبر مضادات الأكسدة القوية، لأنها يمكن أن تكشف أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) 6 ، 7 ، 8 . لديهم أيضا المضادة للالتهابات 9 ، مضادات الميكروبات 10 ، ومكافحة ارتفاع ضغط الدم 11 ، ومضادة للسرطان 12 ، 13 خصائص.

وتظهر الدراسات الوبائية وجود علاقة عكسية بين استهلاك الفلافونويد وأمراض القلب والأوعية الدموية (الأمراض القلبية الوعائية) حدوث 16 و 17 والوفيات 14 ، 15 . وتستهلك التوت على نطاق واسع في الولايات المتحدة ولديها كميات عالية من البوليفينول، بما في ذلك الفلافونويدات. على سبيل المثال، استهلاك بلاك بيري (بل) عصير (300 مل / د) لمدة ثمانية أسابيع انخفاض كبير في ضغط الدم الانقباضي في مرضى دسليبيدميك 18 . جيونغ وآخرون. 19 أن الرجال والنساء قبل ارتفاع ضغط الدم تستهلك 2.5 غرام من التوت الأسود (برب) استخراج يوميا كان أقل 24 ساعة وضغط الدم ليلا مقارنة مع أولئك الذين يتناولون الدواء الوهمي. التوت (رب) انخفاض ضغط الدم مع زيادة التعبير عن ديسموتاز الفائق (سود) في الفئران ارتفاع ضغط الدم بشكل عفوي 20 . وقد تبين مؤخرا أن بل، رب، و برب تقلل من مستويات روس و الشيخوخة الناجمة عن أنجيوتنسين الثاني (أنغ الثاني) في خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية (فسمكس) 21 . وبالإضافة إلى ذلك، فإن جزء الأنثوسيانين من مستخلص بل يقلل من التعبير عن محفز سينتاز أكسيد النيتريك (إينوس)، وحول دون نشاط العامل النووي كابا B (نف-κB) و كيناز الذي ينظم إشارة إشارة (إرك) في عديد السكاريد الشحمي (لس) J774 الخلاياأس = "كريف"> 22. استخراج برب انخفض تفعيل نف-κB والأكسدة الحلقية 2 (كوكس-2) التعبير في المختبر 23 ، وتحسين الشخصية الدهون، ومنع تشكيل تصلب الشرايين في الفئران تغذية نظام غذائي عالي الدهون 24 . الأنثوسيانين، التي تعتبر الفلافونويدات الأكثر وفرة في التوت، وتعديل الاستجابة الالتهابية في لس-راو 264.7 الضامة عن طريق خفض إنتاج الورم نخر عامل ألفا (تنف-α) 25 والحد من انتشار وهجرة فسمكس 26 .

وبما أن هناك اهتماما متزايدا بفهم دور البوليفينول في صحة الإنسان والمرض، فمن المهم لتحسين طريقة الاستخراج. ويستخدم على نطاق واسع استخراج المذيبات لهذا الغرض، لأنها فعالة من حيث التكلفة وسهولة استنساخه. في هذه الدراسة، تم استخدام استخراج المذيبات مع الإيثانول، جنبا إلى جنب مع الاستخراج بمساعدة الموجات فوق الصوتيةn، الذي تم تكييفه من كيم و لي 27 . تم إجراء تنقية وتجزئة المستخلصات الخام باستخدام الكلوروفورم وأسيتات الإيثيل للحصول على جزء المستخلص المنقى (بي) الذي تم تعديله من كيويرز وآخرون 28 . وعلاوة على ذلك، تمت مقارنة فعالية مستخلصات البوليفينول الخام مقابل المنقى من بل في الحد من الفسفرة القاعدية ل ERK1 / 2، وتم تقديم أمثلة تمثيلية للتأثير المثبط لمستخلص بوليفينول بل المنقى على أنغ-إنغوسد سيغنالينغ ديسكونتس في فسمكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. إعداد الكواشف

  1. إعداد 80٪ من الإيثانول (100 مل) عن طريق خلط 80 مل من الإيثانول المطلق (الجزيئية البيولوجيا الصف) و 20 مل من الخلايا الصفية المياه الصف العقيمة.
  2. لإعداد بوليفينول استخراج (10 ملغ / مل)، تزن 10 ملغ من سي أو بي. إضافة 1 مل من دولبيكو تعديل النسر المتوسطة (دمم) تحت غطاء محرك السيارة ثقافة الخلية. دوامة الحل. قسامة في أجزاء 200 ميكرولتر وتخزينها في -20 درجة مئوية.
  3. إعداد تحلل العازلة.
    1. إضافة 5 مل من 1 M الحل هيبيس الأسهم (درجة الحموضة 7.4؛ 50 ملم النهائي)، 1 مل من 5 M محلول الأسهم كلوريد الصوديوم (50 ملم النهائي)، 1 مل من 0.5 M إدتا حل الأسهم (5 ملم النهائي)، 2 مل من 0.5 M حل محلول ناف (10 ملم النهائي)، 286 ميكرولتر من 700 ملي نا 3 فو 4 محلول المخزون (2 ملم النهائي)، 5 مل من 200 ملي نا 4 P 2 O 7 حل المخزون (10 ملم النهائي)، و 5 مل من 20٪ تريتون-X-100 حل المخزون أعد في الماء (1٪ النهائي). إضافة الماء للوصول إلى حجم 100 مل. إبقاء في 4 درجات مئوية.
  4. إعداد ليملي عينة العازلة (4X).
    1. إضافة 31.25 مل من 2 M تريس حل المخزون (الرقم الهيدروجيني 6.8)، 100 مل من الجلسرين، 50 مل من 20٪ محلول دوديسيل الصوديوم (سدز) المحضرة في الماء، و 50 مل من β ميركابتوثانول. يضاف الماء حتى 250 مل. إبقاء في 4 درجات مئوية.
  5. لإعداد تريس مخزنة المالحة العازلة (تبس)، تزن 3 غرام من تريس (25 ملم النهائي)، 0.18 غرام من بوكل (2.5 ملم النهائي)، و 8.76 غرام من كلوريد الصوديوم (150 ملم النهائي). ضبط درجة الحموضة إلى 7.4 وإضافة الماء يصل إلى 1 L. حافظ على رت.
  6. لإعداد تبس-T، إضافة 997.5 مل من تبس و 2.5 مل من 20٪ تريتون-X-100 محلول أعد في الماء. إبقاء في رت.

2. إعداد بلاكري مقتطفات

  1. إعداد مستخرج الخام من مسحوق التوت المجففة.
    1. تزن 10 غرام من مسحوق التوت المجفف التجميد (أو 5 غرام من مسحوق طازج). إذا تم استخدام الفاكهة المجمدة، وقطع عليه طنتو قطع صغيرة جدا قبل البدء في استخراج.
    2. مزيج مسحوق الفواكه مع 100 مل من 80٪ من الإيثانول المائي في 1 لتر جولة القاع إرلنماير قارورة.
    3. يصوتن الخليط لمدة 20 دقيقة في 42 كيلوهرتز، 135 W باستخدام حمام بالموجات فوق الصوتية في 25 درجة مئوية، دون أي فاصل زمني بينهما. أداء سونيكاتيون مع تطهير النيتروجين المستمر في ضوء مهزوما. للفاكهة المجمدة، وزيادة الوقت الحضانة إلى 4 ساعات.
    4. تصفية الخليط من خلال ورقة فلتر # 2 باستخدام قمع بوخنر المبردة مع شفط فراغ.
      ملاحظة: في نهاية هذه الخطوة، تظهر بقايا العينة على ورق الترشيح؛ وهذا ما يسمى كعكة التصفية.
    5. شطف كعكة مرشح مع 50 مل من الإيثانول بنسبة 100٪. حفظ الترشيح وإضافة كعكة مرشح إلى 1 L جولة القاع قارورة تحتوي على 100 مل من 80٪ من الإيثانول المائي.
    6. كرر عملية استخراج لبقايا (الخطوات 2.1.2 - 2.1.4).
    7. الجمع بين اثنين من الفلترات في قارورة جولة القاع مع 50 مل إضافيةمن 80٪ من الإيثانول المائي.
      ملاحظة: يجب أن يكون حجم النهائي حوالي 300 مل.
    8. استخدام المبخر الدوار في 62 درجة مئوية و 50 دورة في الدقيقة لتبخير المذيبات. مواصلة هذه العملية حتى الإيثانول لا تتبخر بعد الآن.
      ملاحظة: تستغرق هذه العملية حوالي 45 دقيقة.
    9. نقل العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل. تتبخر الإيثانول عن طريق حقن غاز النيتروجين في الجزء العلوي من أنبوب لمدة 10 دقيقة.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة لضمان التبخر الكامل للإيثانول. حجم العينة في هذه الخطوة حوالي 20 مل.
    10. تجميد العينة في -80 درجة مئوية لمدة 24 ساعة على الأقل.
      ملاحظة: هناك حاجة إلى هذه الخطوة للسماح لعملية تجميد التجفيف أكثر كفاءة.
    11. تجميد الجافة العينة في -50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات تقريبا. تخزين العينات في -20 درجة مئوية.
      ملاحظة: مجفف تجميد يخلق فراغ قوية في -50 درجة مئوية داخل الغرفة لتجفيف العينات ولكن يحافظ على معظم المركبات، مثل بوليفNOLS.
  2. إعداد مقتطفات البوليفينول المنقى من المستخلصات الخام.
    1. وزن العينات المجففة تجميد المجففة.
      ملاحظة: حجم استخراج في هذه الخطوة حوالي 10 مل.
    2. إضافة مجلدين (~ 20 مل) من الكلوروفورم إلى استخراج الخام ويهز الحل لمدة 5 دقائق في لوحة ضجة.
    3. صب الخليط في قمع فصل. السماح استخراج الخام صب لمدة 1 ساعة في رت للحصول على جزء المنقى.
      ملاحظة: في هذه الخطوة، سوف تشكل خليط مرحلتين.
    4. تجاهل الطبقة السفلى (مرحلة الكلوروفورم) من قمع فصل وجمع الطبقة المائية في دورق نظيفة.
    5. إضافة مجلدين من خلات الإيثيل إلى جزء مائي واستخدام شريط ضجة مغناطيسي لتحريك الخليط لمدة 5 دقائق في رت.
    6. تصفية الخليط من خلال ورقة فلتر # 2 باستخدام قمع بوخنر المبردة مع شفط فراغ.
    7. جمع العينة التي تمت تصفيتها ونقلها إلى قارورة جولة القاع ليكون لناإد مع المبخر الدوار.
    8. تعيين المبخر الدوار إلى 62 درجة مئوية و 50 دورة في الدقيقة وتبخر خلات الإيثيل لمدة 30 دقيقة.
    9. تجميد الجافة العينة في -50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات تقريبا. نقل العينة إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتخزينه في -20 درجة مئوية.

3. علاج فسمكس مع مقتطفات التوت

  1. ثقافة فسمكس.
    1. عزل فسمكس من أورتاس الصدري من الفئران سبراغ داولي من خلال أداء الهضم الأنزيمي، كما هو موضح سابقا 29 . ثقافة فسمكس كما هو موضح 29 .
    2. إعداد وسيطة كاملة لثقافة فسمكس باستخدام دمم تحتوي على 1 غرام / لتر الجلوكوز وتستكمل مع 10٪ مصل جنين البقري (فبس)، 100 / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين، و 2 ملي الجلوتامين. تخزين المتوسطة كاملة في 4 درجات مئوية.
  2. حضانة فسمكس مع مقتطفات البوليفينول.
    1. لتقسيم فسمكس، تجاهل كولتوإعادة المتوسطة وغسل الخلايا مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس). إضافة 4 مل من برنامج تلفزيوني و 2 مل من التربسين إدتا 0.25٪. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حاضنة كو 2 .
      1. جمع الخلايا، ومزجها مع 2 مل من المتوسطة كاملة في أنبوب الطرد المركزي 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 1،100 × ز لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف و ريسوسبيند بيليه الخلية مع 1 مل من برنامج تلفزيوني. عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات.
      2. البذور 50،000 فسمكس لكل بئر في لوحات ثقافة 6 جيدا وتنمو في وسط كامل يحتوي على 10٪ فبس حتى تصل إلى 90٪ كونفلنسي (حوالي 3 د). الحفاظ على فسمكس عند 37 درجة مئوية في مرطب 5٪ كو 2 حاضنة.
    2. إعداد وسيلة للعلاج باستخدام دمم المتوسطة التي تحتوي على 1 غ / L الجلوكوز، 100 / مل البنسلين، 100 ملغ / مل الستربتومايسين، 2 ملي L- الجلوتامين، و 0.5٪ فبس. تخزين وسط العلاج في 4 درجات مئوية.
      ملاحظة: يتم إضافة مقتطفات البوليفينول و أنغ الثاني مباشرة إلى الخلايا باستخدام هذا ليdium.
    3. إعداد محلول المخزون من 10 ملغ / مل استخراج الخام (سي) أو مستخلص منقح (بي) من البوليفينول عن طريق إذابة 10 ملغ من استخراج في 1 مل من وسط دمم المتوسطة. الحفاظ على المخزون في 200 قسامة ميكرولتر في -20 درجة مئوية.
    4. احتضان فسمكس مع 2 مل من العلاج المتوسطة تحتوي على 0.5٪ فبس وإضافة إما سي أو بي مقتطفات لتحقيق تركيز 50 - 500 ميكروغرام / مل. تغيير المتوسطة كل 24 ساعة عن طريق إضافة مقتطفات بوليفينول جديدة. علاج الخلايا لمدة 3 د.
    5. للعلاج مع أنغ الثاني أو غيرها من الهرمونات وعوامل النمو، تجويع الخلايا لمدة لا تقل عن 24 ساعة عن طريق احتضان الخلايا مع العلاج المتوسطة التي تحتوي على 0.5٪ فبس قبل إضافة أنغ الثاني (100 نانومتر).
      ملاحظة: الحضانة مع وبدون سي و بي في 0.5٪ فبس المتوسطة العلاج قبل إضافة أنغ الثاني يوصى.
      1. بعد 24 ساعة من المجاعة، إضافة 100 نانومتر أنغ الثاني. استبدال وسط العلاج مع الطازجة سي، بي، أو أنغ الثاني كل 24 ساعة لمدة 3 د.
  3. إعداد عينات الخلايا.
    1. غسل الخلايا المعالجة مرتين في برنامج تلفزيوني الباردة ويز لهم مع 200 ميكرولتر من العازلة تحلل على الجليد.
    2. جمع ليسيتس الخلية باستخدام كاشطات الخلايا ونقل ليزيتس إلى 1.5 مل أنابيب ميكروسنتريفوج. احتضان ليسيتس خلية الكلي لمدة 20 دقيقة على الجليد والدوامة كل 5 دقائق.
    3. يصوتن مقتطفات الخلية مع ثلاث رشقات نارية في 125 W لمدة 10 ثانية لكل منهما، مع 2 ثانية وقفة بينهما. إبقاء العينات على الجليد في جميع أنحاء سونيكاتيون.
    4. قياس تركيز البروتين باستخدام كاشف فحص البروتين في 595 نانومتر.
    5. تخزين العينات في -20 درجة مئوية لتحليل من قبل لطخة غربية.
  4. لطخة غربية.
    1. مزيج كميات متساوية من البروتين (حوالي 50 ميكروغرام) من السيطرة غير المعالجة والبوليفينول المعالجة أو أنغ العينات المعالجة الثاني مع العازلة تحلل للحصول على الحد الأقصى لحجم الكلي من 50 ميكرولتر. إضافة 16 ميكرولتر من العازلة عينة ليملي 4x. تسخين العينات لمدة 5 دقائق في 75 درجة مئوية.
    2. افصل العينةإس في 10٪ المواد الهلامية سدز-بادج ونقلها إلى أغشية بدفف في 10 V لمدة 75 دقيقة في نظام نقل شبه الجافة لتحليل وصمة عار الغربية مع الأجسام المضادة المحددة.
    3. منع الغشاء مع الحليب 2٪ في تبس 0.05٪ تريتون-X100 العازلة (تبس-T) لمدة 20 دقيقة.
    4. إزالة الحليب عن طريق غسل الغشاء ثلاث مرات على الأقل مع تبس (5 دقائق لكل منهما) واحتضان مع الأجسام المضادة الأولية لمدة 1 ساعة في رت أو O / N عند 4 درجات مئوية.
    5. غسل الغشاء ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل منهما، مع تبس-T واحتضان مع الأجسام المضادة الثانوية المرتبطة هرب لمدة 45 دقيقة.
    6. غسل الغشاء ثلاث مرات، 10 دقيقة لكل منهما، مع تبس-T وتطوير من خلال التوهج المعزز (إكل).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

وقد ثبت سابقا أن مقتطفات البوليفينول معزولة من بل، رب، و برب خفضت شيخوخة فسمكس ردا على أنغ الثاني 21 . وقد تبين أن هذه المستخلصات البوليفينول المنقى تعديل أنغ الثاني يشير عن طريق الحد من الفسفرة من أكت، P38 ميتوجين المنشط كيناس البروتين (مابك)، و ERK1 / 2. بل يمنع الشيخوخة عن طريق الحد من التعبير عن أوكسيديز نادف (نوكس) 1، وهو انزيم التي تنتج الأنيونات سوبركسيد و أوبريغولاتد بقوة من قبل أنغ الثاني. في المقابل، رب و برب منع الشيخوخة من قبل آلية مستقلة NX1، لأنها تزيد من التعبير عن الانزيمات المضادة للأكسدة SOD1، SOD2، والجيلوتاثيون بيروكسيداز 1 (غس-1). فشل بل لزيادة التعبير SOD2، في حين أن أيا من مقتطفات يخفف دونريغولاتيون من الكاتالاز التي كتبها أنغ الثاني 21 . وركزت بل على تحديد ما إذا كان عدم وجود تأثير بل على SOD2 والتعبير الكاتالاز يمكنيمكن تفسيرها بفقدان مركبات البوليفينول أثناء عملية التنقية أو عن طريق تركيز غير كاف من مركب بوليفينوليك معين في المستخلص. تم احتضان فسمكس مع 50-500 ميكروغرام / مل سي ( الشكل 1A ) أو بي ( الشكل 1B ) في المتوسطة التي تحتوي على 0.5٪ فبس لمدة ثلاثة أيام. لا سي ولا بي زيادة مستويات SOD2 أو الكاتالاز في أي من تركيزات اختبارها. كسيطرة إيجابية، تم قياس ERFC1 / 2 الفسفرة، ووجد أن سي خفض فسفرة هذا الكيناز بتركيزات أعلى من 300 ميكروغرام / مل. في المقابل، كان بي فعالة في حوالي 100 ميكروغرام / مل ( الشكل 1B ). لوحظ انخفاض مستويات الفسفرة عند تركيزات من 200-500 ميكروغرام / مل. تدعم هذه البيانات الملاحظة السابقة التي تبين أن 200 بيكروجرام / مل بل بي كافية للحد من الإشارة الثانية إي 21 . وتشير هذه النتائج إلى أن تركيزات أعلى من البوليفينول جأومبوندز في بي، مقارنة مع سي، يمكن أن يفسر كفاءة أعلى من هذا استخراج في الحد ERK1 / 2 الفسفرة. لاختبار هذه الفكرة، تمت مقارنة تركيبات البوليفينول من كلا المستخلصات. تم تحديد وتحديد الكميات من مركبات البوليفينول في سي من قبل هبلك، كما هو موضح سابقا 21 ( الجدول 1 ). 3- كان حمض O- كافيويلكينيك و كيرسيتين موجودين في مستويات أعلى في بي مقارنة مع سي، في حين وجد حمض الفيروليك وروتين فقط في سي. بعد ذلك، تم علاج فسمكس مع 200 ميكروغرام / مل بل بي لمدة 24 ساعة قبل إضافة 100 نانومتر أنغ الثاني ( الشكل 1C ). كما ذكرت سابقا 21 ، بل استخراج البوليفينول خفض انج الثاني الناجم ERK1 / 2 فسفوريلاتيون ولكن أظهرت أي تأثير على الكاتالاز و SOD2 التعبير.

شكل 1
> الشكل 1: البوليفينول بلاك بيري تقليل باسال وانغ الثاني الناجم ERK1 / 2 الفسفرة في فسمكس. تم تحضين فسمكس مثقف في 10٪ فبس في حوالي 90٪ كونفلنسي مع 50 - 500 ميكروغرام / مل مستخلص الخام (سي) (A)، مستخلص منقح (بي) ( ب )، أو 200 ميكروغرام / مل بي ( C ) في 0.5 ٪ فبس دمم المتوسطة لمدة 3 د. C ) بعد 24 ساعة من الحضانة مع بل بي، تم إضافة أنغ الثاني (100 نانومتر) وحضنت الخلايا لمدة 3 د. تم تغيير الوسط، مع المستخلصات الطازجة و أنغ الثاني، كل يوم. ثم تم غسل الخلايا و ليسد، وتم فصل المستخلصات الخلوية الكلية في 10٪ هلام بادج-سدز. تم اختبار البقع الغربية مع الأجسام المضادة الأرنب ضد ERFC1 / فوسفهوريلاتد ERK1 / 2 (ثر 202 / تير 204)، ERK1 / 2، الكاتالاز، و SOD2 والماوس الأجسام المضادة ضد β أكتين. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

إن-بادج = "1" فو: كيب-ويث-next.within-بادج = "ألويس">
التحاليل (جزء في المليون) PE CE
الأحماض الفينولية
حمض الغال 243.5 321.9
p- حمض الكوماريك 32.9 46.5
حمض الفيرليك - 236.5
أحماض الكلوروجينيك
3-O-كافوييلكينيك حمض 235.3 170.5
4-O-كافوييلكينيك حمض 13 76.9
5-O-كافوييلكينيك حمض 14.1 49.9
مركبات الفلافونويد
مركبات الفلافونول
كيرسيتين 95 24.5
Flavanones
روتين - 37.8

الجدول 1: تحليل تكوين البوليفينول من بلاك بيري في المستخلصات الخام وتنقية البوليفينول. تم تحليل الأحماض الفينولية والفلافونويد في استخراج الخام (سي) والمستخلص المنقى (بي) باستخدام عالية الأداء اللوني السائل (هبلك). يتم التعبير عن تركيز التحاليل كما جزء في المليون. تم نشر تكوين البوليفينول في بي بي مؤخرا 21 وإضافة إلى الجدول ليتم مقارنتها مع سي.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

يحتوي البوليفينول المعزول من التوت على تركيبات متميزة. بروتوكول الاستخلاص القائم على الإيثانول وصف هنا يسمح لتحديد مستويات مختلفة من الأحماض الفينولية والفلافونويد الموجودة في مستخلصات البوليفينول الخام وتنقيته من بل ( الجدول 1 ). تم إثراء سي في حمض الغاليك، حمض الفيروليك، 4-O- كافوييلكينيك حمض، و 5 O- كافوييلكينيك حمض. عملية تنقية لم يغير كثيرا من مستويات حمض الغاليك و p- حمض الكوماريك. ومع ذلك، فقد زادت مستويات 3- O- كافويويلكينيك حمض من 170.5 - 235.3 جزء في المليون، والكورسيتين من 24.5 - 95 جزء في المليون. في المقابل، فقدت حمض الفيروليك وروتين أثناء تنقية سي.

وأظهرت معاملة فسمكس مع 50 - 500 ميكروغرام / مل سي و بي أن كلا المستخلصات كانت فعالة في الحد من الفسفرة القاعدية من ERK1 / 2. ومع ذلك، أظهر بي أقوى دونريغولاتيون في نشاط هذا كيناز في تركيز أقل: 100 &181؛ ز / مل ل بي مقارنة مع 400 - 500 ميكروغرام / مل ل سي. هذه النتائج قد تعكس تركيز أعلى من 3- O -caffeoylquinic حمض أو كيرسيتين وجدت في بي. وهناك حاجة إلى استخدام المركبات الفينولية الفردية في الخلايا في الثقافة لتحديد المركب (ق) محددة المسؤولة عن خفض مستوى ERCO1 / 2 الفسفرة.

إن النشاط المنخفض من كيناز التشوير، بما في ذلك أكت، ERK1 / 2، و p38MAPK، الناجم عن البوليفينول المنقى معزولة من بل، رب، و برب 21 ، وكذلك ERK1 / 2 الناجم عن بل سي، هو موضح هنا، التقارير السابقة. على سبيل المثال، انخفضت مقتطفات البوليفينول معزولة من توت نمو الورم من الخلايا السرطانية الثديية، وذلك جزئيا عن طريق الحد من نشاط أكت و ERK1 / 2 30 . كما ذكر من قبل، وتشارك هذه كينازس أيضا في تحريض الشيخوخة الخلوية التي كتبها أنغ الثاني 21 ، مما يشير إلى أن البوليفينول من بل، رب، و برب شولد تقليل الشيخوخة الوعائية والخلل المرتبطة الأمراض القلبية الوعائية.

كما ذكرنا سابقا 21 ، كانت كاتالاز و SOD2 التعبير لا أوبريغولاتد بي، حتى في تركيزات تصل إلى 500 ميكروغرام / مل. منذ سي كان أيضا غير فعالة في زيادة الكاتالاز والتعبير SOD2، تشير هذه البيانات إلى أن المركبات الفينولية المفقودة خلال بروتوكول تنقية لا تشارك في تنظيم هذه الانزيمات المضادة للأكسدة. وتشير هذه البيانات أيضا إلى أن بروتوكول تنقية هو موضح هنا مركزة بشكل فعال المركبات الفينولية ذات الصلة بتنظيم الإشارة الثانية إي، والإجهاد التأكسدي، والشيخوخة الخلوية. على سبيل المثال، تظهر النتائج ممثل أن بي بقوة دونرغولاتد أنغ الثاني الناجم ERK1 / 2 الفسفرة. تقييم فسفرة هذا كيناز هو ذات الصلة لأن تثبيط ERK1 / 2 النشاط منع أنغ الثاني الناجم عن الشيخوخة الخلوية 21 .

في tإرمز من التعديلات على البروتوكولات السابقة، تم إضافة سونيكاتيون هنا لزيادة العائد استخراج ل سي. بالإضافة إلى ذلك، لتنقية البوليفينول، بدلا من استخدام C18 خرطوشة، كما هو موضح من قبل كيم و لي 27 ، طريقة أكثر تقليدية من كويريس وآخرون . 28 اعتمد هنا. وأضيفت خطوة الترشيح، وذلك باستخدام ورقة الترشيح لإزالة الشوائب، لتنقية قسم البوليفينول. من حيث القيود، يجب أن يراقب سونيكاتيون وخطوات التبخر بعناية وفقا لنوع من الأدوات المستخدمة، منذ مدة ودرجة الحرارة من سونيكيشن والتبخر، هي الخطوات الحاسمة في هذا البروتوكول. أدت التعديلات المضافة إلى هذه الطريقة إلى أعلى عائد من البوليفينول بالمقارنة مع الأساليب السابقة 27 ، 28 المستخدمة في مختبرنا (لا تظهر البيانات)، على الأرجح بسبب إضافة خطوة سونيكاتيون. كما منتيأوند في قسم البروتوكول، ويمكن استخدام هذا البروتوكول لتجميد المجفف مسحوق من التوت المختلفة، فضلا عن الفواكه المجمدة. وقد استخدمت هذه الطريقة بنجاح لاستخراج وتنقية البوليفينول من التوت والتوت الأسود 21 ، وكذلك من التوت والفراولة (لا تظهر البيانات). وهكذا، يمكن أن تستخدم هذه الطريقة أيضا لاستخراج البوليفينول من أنواع أخرى من الأطعمة، بما في ذلك الخضروات.

في الختام، هذا العمل تفاصيل طريقة سريعة وفعالة من حيث التكلفة، وسهولة الاستنساخ لعزل البوليفينول من التوت، والذي يسمح للاحتفاظ وتركيز المركبات التي هي وقائية ضد الإجهاد التأكسدي في فسمكس.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

Acknowledgments

تم تمويل هذا العمل من قبل جمعية القلب الأمريكية (14GRNT20180028) ومجلس ولاية ولاية فلوريدا للبحوث والإبداع (كوفرس).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Angiotensin II Sigma-Aldrich, Inc. A9525-10MG Treatment of VSMCs
β-actin Sigma-Aldrich, Inc. A2228 Primary antibody (1:5000)
Blackberry fruit Mercer Foods Freeze-dried blackberry powder
Catalase  Calbiochem 219010 Primary antibody (1:1000)
Chloroform Biotech Grd, Inc. 97064-678 Preparation of purified polyphenol extracts
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) Mediatech, Inc. 10-014-CV Culture of VSMCs
Ethanol (absolute molecular biology grade) Sigma-Aldrich, Inc. E7023-500ML Preparation of polyphenol extracts 
Ethylacetate Sigma-Aldrich, Inc. 439169 Preparation of purified polyphenol extracts
ERK1/2 Cell Signaling Technology, Inc. 9102S Primary antibody (1:500)
EDTA, 500 mM, pH 8.0 Teknova, Inc. E0306 Lysis buffer
Freeze-Dryer Labconco VirTis Benchtop K Preparation of polyphenol extracts
Fetal Bovine Serum (FBS) Seradigm 1400-500 Cell culture
HEPES Sigma-Aldrich, Inc. H3375 Lysis buffer 
NaCl EMD Millipore, Inc. 7760 Lysis buffer
NaF J.T.Baker, Inc. 3688-01  Lysis buffer
Na3VO4 Sigma-Aldrich, Inc. 450243 Lysis buffer
Na4P2O7 , decahydrate Sigma-Aldrich, Inc. S-9515 Lysis buffer
phospho ERK1/2  Cell Signaling Technology, Inc. 9101S Primary antibody (1:1000)
Protease inhibitor cocktail Sigma-Aldrich, Inc. P8340-5ml Lysis buffer
Protein assay dye reagent Bio-Rad Laboratories, Inc. 500-0006 Protein concentration Measurement
PVDF transfer membrane Thermo Scientific, Inc. 88518 Western blots
Rotatory Evaporator Buchi Labortechnik Rotavapor
R3000		 Preparation of polyphenol extracts
Sterile water Mediatech, Inc. 25-055-CV Preparation of polyphenol extracts
Sonicator QSonica, LLC Q125 Preparation of cell extracts
SOD2 Enzo Life Sciences, Inc. ADI-SOD-110-F Primary antibody (1:1000)
Triton-X-100 Sigma-Aldrich, Inc. X100 Western blots
Whatman #2 filter paper GE Healthcare, Inc. 28317-241 Preparation of polyphenol extracts

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
  2. Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
  3. Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
  4. Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
  5. Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
  6. Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
  7. Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
  8. Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
  9. Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
  10. Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
  11. Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
  12. Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
  13. Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
  14. Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
  15. Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
  16. Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
  17. Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
  18. Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
  19. Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
  20. Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
  21. Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
  22. Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
  23. Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
  24. Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
  25. Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
  26. Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
  27. Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
  28. Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
  29. Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
  30. Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).

Tags

الكيمياء، العدد 125، البوليفينول، بلاك بيري، الأوعية الدموية خلايا العضلات الملساء، أنجيوتنسين الثاني، إشارة الخلية، شيخوخة
استخراج وتنقية البوليفينول من تجميد المجفف بيري مسحوق لعلاج خلايا العضلات السلس الأوعية الدموية<em&gt; في المختبر</em
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Feresin, R. G., Pourafshar, S.,… More

Feresin, R. G., Pourafshar, S., Huang, J., Zhao, Y., Arjmandi, B. H., Salazar, G. Extraction and Purification of Polyphenols from Freeze-dried Berry Powder for the Treatment of Vascular Smooth Muscle Cells In Vitro. J. Vis. Exp. (125), e55605, doi:10.3791/55605 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter