Summary
In dit werk wordt een stap-voor-stap methode beschreven om polyphenolrijke extracten uit gevriesdroogd bessenpoeder te bereiden. Daarnaast biedt het een grondige beschrijving van hoe deze polyphenol-rijke extracten in celkweek kunnen worden gebruikt in aanwezigheid van vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) van het peptidehormoon-angiotensine II (Ang II).
Abstract
Epidemiologische studies geven aan dat verhoogde flavonoïdale inname correleert met verminderde sterfte door hart- en vaatziekten (CVD) in de Verenigde Staten (VS) en Europa. Bessen worden in de VS veel gebruikt en hebben een hoge polyfenolische inhoud. Polyfenolen zijn aangetoond dat ze met veel moleculaire doelen interageren en veel positieve biologische functies uitoefenen, waaronder antioxidant, anti-inflammatoire en cardioprotectieve effecten. Polyfenolen geïsoleerd van blackberry (BL), framboos (RB) en zwarte frambozen (BRB) verminderen oxidatieve stress en cellulaire senescentie in reactie op angiotensine II (Ang II). Dit werk geeft een gedetailleerde omschrijving van het protocol dat wordt gebruikt om de polyfenol extracten uit vriesgedroogde bessen te bereiden. Polyfenol-extracties uit bevroren gedroogde bessenpoeder werden uitgevoerd met behulp van 80% waterige ethanol en een met behulp van ultrasoon geassisteerde extractiemethode. Het ruwe extract werd verder gezuiverd en gefractioneerd onder toepassing van chloroform en ethylacetaat,respectievelijk. De effecten van zowel ruwe als gezuiverde extracten werden getest op vasculaire gladde spiercellen (VSMC's) in cultuur.
Introduction
Polyfenolen zijn verbindingen die tenminste één fenolische ring in hun structuur bevatten en in overvloed aanwezig zijn in het plantenrijk 1 . Mense hebben voor millennia planten verbruikt voor medicinale doeleinden zonder zich bewust te zijn van het bestaan van dergelijke verbindingen 2 . Veel groenten en fruit hebben sommige gedeelde polyfenolische verbindingen, zij het met verschillende hoeveelheden, waaronder flavonoïden, stilbenen en fenolzuren 3 . Hoewel polyfenolen vaak geassocieerd worden met kleurrijke groenten en fruit, is dit niet strikt waar. Zeaxanthine en xanthine zijn bijvoorbeeld aanwezig in groenten die niet zeer kleurrijk zijn, zoals uien en knoflook, die uit de familie van scallions zijn en in verband staan met tal van voordelen voor de gezondheid 4 . Afgezien van geassocieerd met verschillende gezondheidsvoordelen 5 , dienen polyfenolen ook planten door ze te beschermen tegen insecten enD ultraviolette straling 2 . Polyfenolen komen vaak voor in het menselijke dieet en worden beschouwd als krachtige antioxidanten, omdat ze Reactieve Zuurstof Soorten (ROS) 6 , 7 , 8 kunnen afscheiden. Ze hebben ook anti-inflammatoire 9 , antimicrobiële 10 , anti-hypertensieve 11 en anti-carcinogene 12 , 13 eigenschappen.
Epidemiologische studies tonen een omgekeerde associatie tussen de consumptie van flavonoïden en cardiovasculaire aandoeningen (CVD) 16 , 17 en mortaliteit 14 , 15 . Bessen worden in de VS veel gebruikt en hebben grote hoeveelheden polyfenolen, waaronder flavonoïden. Bijvoorbeeld, consumptie van blackberry (BL) sap (300 ML / d) gedurende acht weken significant verminderde systolische bloeddruk bij dyslipidemische patiënten 18 . Jeong et al. 19 meldde dat prehypnotherapie mannen en vrouwen die 2,5 g zwarte frambozen (BRB) per dag consumeren, een lagere 24 uur en nachtelijke bloeddruk hadden vergeleken met die van een placebo. Frambozen (RB) daalden de bloeddruk terwijl de expressie van superoxide dismutase (SOD) bij spontane hypertensieve ratten 20 werd verhoogd. Recent is aangetoond dat BL, RB en BRB de niveaus van ROS en senescentie verminderen die geïnduceerd worden door angiotensine II (Ang II) in Vascular Smooth Muscle Cells (VSMCs) 21 . Daarnaast verminderde de anthocyanine fractie van BL extract de expressie van induceerbaar stikstofoxide synthase (iNOS) en remde de activiteit van Nuclear Factor kappa B (NF-KB) en extracellulaire signaal-gereguleerde kinase (ERK) in lipopolysaccharide (LPS) gestimuleerde J774 cellenAss = "xref"> 22. BRB-extracten verlaagden de in vitro 23 NF-KB activatie en cyclooxygenase 2 (COX-2) expressie, verbeterde het lipide profiel en verhinderde atherosclerose lesievorming bij muizen die een vet vet dieet 24 voerden. Anthocyaninen, die de meest voorkomende flavonoïden in bessen worden beschouwd, moduleren de ontstekingsreactie in LPS-gestimuleerde RAW 264.7 macrofagen door de productie van Tumor Necrosis Factor alpha (TNF-α) 25 te verminderen en de proliferatie en migratie van VSMCs 26 te verminderen .
Aangezien er belangstelling is voor het begrijpen van de rol van polyfenolen bij de gezondheid en de ziekte van de mens, is het belangrijk om de extractiemethode te optimaliseren. Oplosmiddelwinning wordt daarvoor veel gebruikt, omdat het kosteneffectief en makkelijk reproduceerbaar is. In deze studie werd een oplosmiddelxtractie gebruikt met ethanol, samen met een ultrasoon geassisteerde extractioN methode, die is aangepast uit Kim en Lee 27 . De zuivering en fractionering van ruwe extracten (CE) onder toepassing van chloroform en ethylacetaat werden uitgevoerd ter verkrijging van de gezuiverde extract (PE) fractie die werd aangepast uit Queires et al. 28 . Bovendien werden de werkzaamheid van ruwe versus gezuiverde polyfenol-extracten van BL vergeleken bij het reduceren van de basale fosforylering van ERK1 / 2, en representatieve voorbeelden van het remmende effect van gezuiverd BL-polyfenol-extract op Ang II-geïnduceerde signaleringsreducties in VSMC's werden verschaft.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Bereiding van reagentia
- Bereid 80% ethanol (100 ml) door 80 ml absolute ethanol (moleculaire biologiegraad) en 20 ml steriel water van celkweekgraad te mengen.
- Voor het bereiden van polyphenol extract (10 mg / ml) weeg 10 mg CE of PE. Voeg 1 ml gewone Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) onder een celkweekkap toe. Vortex de oplossing. Aliquot in 200 μl porties en opslaan bij -20 ° C.
- Bereid lysisbuffer op.
- Voeg 5 ml 1 M HEPES-voorraadoplossing toe (pH 7,4; 50 mM definitief), 1 ml 5 M NaCl voorraadoplossing (50 mM definitief), 1 ml 0,5 M EDTA voorraadoplossing (5 mM definitief), 2 ml 0,5 M NaF stamoplossing (10 mM definitief), 286 μL 700 mM Na 3 VO 4 stamoplossing (2 mM finale), 5 ml 200 mM Na4P207 voorraadoplossing (10 mM definitief) en 5 ml 20% Triton-X-100 voorraadoplossing bereid in water (1% definitief). Voeg water toe om een volume van 100 ml te bereiken. Houd bij 4 ° C.
- Bereid Laemmli monsterbuffer (4x) op.
- Voeg 31,25 ml 2 M Tris-voorraadoplossing (pH 6,8), 100 ml glycerol, 50 ml van een 20% natriumdodecylsulfaat (SDS) -oplossing bereid in water en 50 ml ß-mercaptoethanol. Voeg water toe tot 250 ml. Houd bij 4 ° C.
- Voor het bereiden van Tris-Buffered Saline (TBS) buffer weeg 3 g Tris (25 mM definitief), 0,18 g KCl (2,5 mM definitief) en 8,76 g NaCl (150 mM definitief). Pas de pH op op 7.4 en voeg water tot 1 liter toe. Houd bij kamertemperatuur.
- Om TBS-T te bereiden, voeg 997,5 ml TBS en 2,5 ml van een 20% Triton-X-100 oplossing bereid in water toe. Blijf bij RT.
2. Bereiding van Blackberry Extracts
- Bereiding van ruw extract uit gevriesdroogd bessenpoeder.
- Weeg 10 g gevriesdroogde blackberry poeder (of 5 g verspoeder). Als bevroren fruit wordt gebruikt, snijd het iNa zeer kleine stukken voordat u de extractie begint.
- Meng het fruitpoeder met 100 ml 80% waterige ethanol in een 1 liter ronde Erlenmeyer-fles.
- Soniceer het mengsel gedurende 20 minuten bij 42 kHz, 135 W met behulp van een ultrasoonbad bij 25 ° C, zonder enig tijdsinterval tussenin. Voer de sonication uit met continu stikstofspoeling in gedempt licht. Voor bevroren fruit verhoogt u de incubatietijd tot 4 uur.
- Filter het mengsel door een filterpapier # 2 met behulp van een gekoelde Buchner-trechter met vacuümzuiging.
OPMERKING: Aan het eind van deze stap verschijnen residuen van het monster op het filterpapier; Dit heet filtertaart. - Spoel de filterkoek met 50 ml 100% ethanol. Bewaar het filtraat en voeg de filterkoek toe aan een 1 liter ronde bodemkolf die 100 ml 80% waterige ethanol bevat.
- Herhaal het extractieproces voor het residu (stappen 2.1.2 - 2.1.4).
- Combineer de twee filtraten in een rondbodemkolf met nog eens 50 mlVan 80% waterige ethanol.
OPMERKING: Het uiteindelijke volume moet ongeveer 300 ml zijn. - Gebruik een roterende verdamper bij 62 ° C en 50 rpm om het oplosmiddel te verdampen. Ga door met dit proces totdat de ethanol niet meer verdampt.
OPMERKING: dit proces duurt ongeveer 45 minuten. - Breng het monster over naar een 50 ml conische buis. Verdamp de ethanol door 10 minuten stikstofgas bovenaan de buis te injecteren.
OPMERKING: Deze stap is nodig om de volledige verdamping van de ethanol te verzekeren. Het volume van het monster bij deze stap is ongeveer 20 ml. - Bevroren het monster gedurende minstens 24 uur bij -80 ° C.
OPMERKING: Deze stap is nodig om een efficiënter vriesdrogingsproces mogelijk te maken. - Bevroren het monster gedurende ongeveer 8 uur bij -50 ° C. Bewaar de monsters bij -20 ° C.
OPMERKING: De vriesdroger zorgt voor een sterk vacuüm bij -50 ° C in de kamer om de monsters te drogen, maar behoudt de meeste verbindingen, zoals polyfennols.
- Bereiding van gezuiverde polyfenol extracten uit ruwe extracten.
- Weeg de gevriesdroogde geëxtraheerde monsters.
OPMERKING: Het volume van het extract bij deze stap is ongeveer 10 ml. - Voeg twee volumes (~ 20 ml) chloroform toe aan het ruwe extract en schud de oplossing gedurende 5 minuten in een roerplaat.
- Giet het mengsel in een scheidtrechter. Laat het ruwe ekstrakt gedurende 1 uur bij RT afkanten om de gezuiverde fractie te verkrijgen.
OPMERKING: Bij deze stap vormt een tweefase-mengsel. - Gooi de onderste laag (chloroformfase) uit de scheidtrechter weg en haal de waterlaag in een schone beker.
- Voeg twee volumes ethylacetaat toe aan de waterige fractie en gebruik een magnetische roerbalk om het mengsel gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur te roeren.
- Filter het mengsel door middel van # 2 filterpapier met behulp van een gekoelde Buchner-trechter met vacuümzuiging.
- Verzamel het gefilterde monster en verplaats het naar een rondbodemkolf om ons te zijnEd met de roterende verdamper.
- Zet de roterende verdamper op 62 ° C en 50 rpm en verdamp het ethylacetaat gedurende ongeveer 30 minuten.
- Bevroren het monster gedurende ongeveer 8 uur bij -50 ° C. Breng het monster over op een 50 ml conische buis en hou het op -20 ° C.
- Weeg de gevriesdroogde geëxtraheerde monsters.
3. Behandeling van VSMC's met bessenxtracten
- VSMC's cultuur.
- Isolate VSMC's uit de thoracale aorta's van Sprague-Dawley ratten door een enzymatische spijsvertering uit te voeren, zoals eerder beschreven 29 . Cultuur de VSMCs zoals beschreven 29 .
- Bereid compleet medium voor de cultuur van VSMC's met behulp van DMEM die 1 g / L glucose bevat en aangevuld met 10% Fetal Bovine Serum (FBS), 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine en 2 mM L-glutamine. Bewaar het volledige medium bij 4 ° C.
- Incubatie van VSMC's met polyfenol extracten.
- Om de VSMC's te verdelen, verwerp de cultuRe medium en was de cellen tweemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 4 ml PBS en 2 ml trypsine EDTA 0,25% toe. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO 2 incubator.
- Verzamel de cellen, meng ze met 2 ml volledig medium in een 15 ml centrifugebuis en centrifugeer bij 1.100 × g gedurende 5 minuten. Verwijder de supernatant en resuspendeer de celpellet met 1 ml PBS. Tel de cellen met behulp van een hemocytometer.
- Zaad 50.000 VSMC's per putje in 6-putjes cultuurplaten en groei ze in compleet medium dat 10% FBS bevat totdat ze 90% samenvliegendheid bereiken (ongeveer 3 d). Bewaar de VSMC's bij 37 ° C in een bevochtigde 5% CO 2 incubator.
- Bereid het medium voor de behandeling aan met DMEM-medium dat 1 g / L glucose, 100 U / ml penicilline, 100 mg / ml streptomycine, 2 mM L-glutamine en 0,5% FBS bevat. Bewaar het behandelingsmedium bij 4 ° C.
OPMERKING: Polyfenol extracten en Ang II worden direct toegevoegd aan cellen die deze me gebruikendium. - Bereid een voorraadoplossing van 10 mg / ml Ruwe Extract (CE) of Gezuiverde Extract (PE) van Polyfenolen door 10 mg extract in 10 ml DMEM-medium op te lossen. Houd de voorraad in 200 μl aliquots bij -20 ° C.
- Incubeer de VSMCs met 2 ml behandelingsmedium dat 0,5% FBS bevat en voeg CE of PE extracten toe om een concentratie van 50 - 500 μg / ml te bereiken. Verander het medium elke 24 uur door verse polyfenol extracten toe te voegen. Behandel de cellen voor 3 d.
- Voor behandeling met Ang II of andere hormonen en groeifactoren, verhong de cellen gedurende tenminste 24 uur door incubatie van de cellen met behandelingsmedium dat 0,5% FBS bevat vóór de toevoeging van Ang II (100 nM).
OPMERKING: Incubatie met en zonder CE en PE in 0,5% FBS behandelingsmedium voordat de toevoeging van Ang II wordt aanbevolen.- Na 24 uur honger, voeg 100 nM Ang II toe. Vervang het behandelmedium met verse CE, PE of Ang II elke 24 uur voor 3 d.
- Om de VSMC's te verdelen, verwerp de cultuRe medium en was de cellen tweemaal met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Voeg 4 ml PBS en 2 ml trypsine EDTA 0,25% toe. Incubeer de cellen gedurende 5 minuten bij 37 ° C in een CO 2 incubator.
- Bereiding van celmonsters.
- Was de behandelde cellen tweemaal in koude PBS en leg ze met 200 μl lysisbuffer op ijs.
- Verzamel cellysaten met behulp van celschrapers en overdracht van de lysaten naar 1,5 ml microcentrifuge buizen. Incubeer de totale cellysaten gedurende 20 minuten op ijs en vortex elke 5 minuten.
- Soniceer de celextracten met drie uitbarstingen bij 125 W gedurende 10 s elk, met een tussenpose van 2 s. Houd de monsters op ijs gedurende de sonicatie.
- Meet de eiwitconcentratie met behulp van een eiwitassay reagens bij 595 nm.
- Bewaar de monsters bij -20 ° C voor analyse door Western blot.
- Western blot.
- Meng gelijke hoeveelheden eiwit (ongeveer 50 μg) van controle niet behandelde en polyfenol behandelde of Ang II behandelde monsters met lysis buffer om een maximaal totaal volume van 50 μl te verkrijgen. Voeg 16 μl van een 4x Laemmli monsterbuffer toe. Verhit de monsters gedurende 5 minuten bij 75 ° C.
- Scheid de samplEs in 10% SDS-PAGE gels en overdragen ze naar PDVF membranen bij 10 V gedurende 75 minuten in een semi-droog transfer systeem voor Western blot analyse met specifieke antilichamen.
- Blokkeer het membraan met 2% melk in TBS 0,05% Triton-X100 buffer (TBS-T) gedurende 20 minuten.
- Verwijder de melk door het membraan minstens drie keer te wassen met TBS (5 min elk) en incubeer met 1 uur bij RT of O / N bij 4 ° C bij primaire antilichamen.
- Was het membraan drie keer, 10 minuten elk, met TBS-T en incubeer met een HRP-gekoppeld secundair antilichaam gedurende 45 minuten.
- Was het membraan driemaal, 10 minuten elk, met TBS-T en ontwikkeld door verbeterde chemiluminescentie (ECL).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Er is eerder aangetoond dat polyphenol-extracten geïsoleerd van BL, RB en BRB de senescentie van VSMC's verminderen in reactie op Ang II 21 . Er is aangetoond dat deze gezuiverde polyfenol extracten Ang II signalering moduleren door de fosforylering van Akt, p38 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) en ERK1 / 2 te reduceren. BL voorkomt senescentie door de expressie van het NADPH-oxidase (Nox) 1 te verminderen, een enzym dat superoxideanionen produceert en sterk wordt gereguleerd door Ang II. In tegenstelling hiermee voorkomen RB en BRB senescentie door een Nox1-onafhankelijk mechanisme, omdat ze de expressie van de antioxidante enzymen SOD1, SOD2 en glutathionperoxidase 1 (GPx-1) verhogen. BL verslaagt de SOD2-expressie niet, terwijl geen van de extracten de downregulatie van catalase door Ang II 21 verzwakt. BL was gericht op het bepalen of het gebrek aan effect van BL op SOD2 en catalase expressie konWorden verklaard door een verlies van polyfenolverbindingen tijdens het zuiveringsproces of door een onvoldoende concentratie van een bepaalde polyfenolische verbinding in het extract. VSMC's werden geïncubeerd met 50-500 μg / ml CE ( Figuur 1A ) of PE ( Figuur 1B ) in medium dat 0,5% FBS gedurende drie dagen bevat. Noch CE noch PE verhoogden SOD2 of katalase niveaus bij een van de geteste concentraties. Als positieve controle werd ERK1 / 2 fosforylering gemeten, en bleek dat CE de fosforylering van deze kinase verminderde bij concentraties hoger dan 300 μg / ml. Daarentegen was PE werkzaam bij ongeveer 100 ug / ml ( Figuur 1B ). Lage fosforyleringsniveaus werden waargenomen bij concentraties van 200-500 μg / ml. Deze gegevens ondersteunen de vorige observatie, waarbij blijkt dat 200 μg / mL BL PE voldoende is om Ang II signalering 21 te verminderen. Deze resultaten suggereren dat hogere concentraties polyphenol cOmpounds in PE, vergeleken met CE, zou de hogere efficiëntie van dit extract kunnen verklaren bij het reduceren van ERK1 / 2 fosforylering. Om dit idee te testen werden de polyfenolsamenstellingen van beide extracten vergeleken. De identificatie en kwantificering van polyfenolverbindingen in CE werd uitgevoerd door HPLC, zoals eerder beschreven 21 ( Tabel 1 ). 3- O- caffeoylchinezuur en quercetin waren aanwezig op hogere niveaus in PE in vergelijking met CE, terwijl ferulzuur en rutine alleen in CE werden gevonden. Vervolgens werden VSMC's behandeld met 200 μg / ml BL PE gedurende 24 uur voor de toevoeging van 100 nM Ang II ( Figuur 1C ). Zoals eerder gemeld 21 verminderde het BL-polyfenol-extract Ang-geïnduceerde ERK1 / 2-fosforylering maar vertoonde geen effect op katalase- en SOD2-expressie.
| Analyses (ppm) | PE | CE |
| Fenolzuur | ||
| galluszuur | 243,5 | 321.9 |
| P-coumaarzuur | 32.9 | 46.5 |
| Ferulzuur | - | 236.5 |
| Chlorogene zuren | ||
| 3-0-caffeoylchinezuur | 235,3 | 170,5 |
| 4-0-caffeoylchinezuur | 13 | 76.9 |
| 5-0-caffeoylchinezuur | 14.1 | 49.9 |
| flavonoïden | ||
| flavonolen | ||
| quercetine | 95 | 24.5 |
| flavanonen | ||
| rutin | - | 37.8 |
Tabel 1: Analyse van de polyfenol samenstelling van Blackberry in Crude en Polyphenol-gezuiverde extracten. Fenolzuren en flavonoïden in Crude Extract (CE) en gezuiverd extract (PE) werden geanalyseerd met behulp van High Performance Liquid Chromatography (HPLC). De concentratie van analyten wordt uitgedrukt in ppm. De samenstelling van polyfenolen in BL PE is onlangs 21 gepubliceerd en toegevoegd aan de tabel, te vergelijken met CE.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Polyfenolen geïsoleerd uit bessen bevatten duidelijke composities. Het hier beschreven ethanol-gebaseerde extractieprotocol is toegestaan voor het identificeren van verschillende niveaus van fenolzuren en flavonoïden die aanwezig zijn in ruwe en gezuiverde polyfenol-extracten van BL ( tabel 1 ). CE was verrijkt in gallinezuur, ferulzuur, 4-0-caffeoylchinezuur en 5-0-caffeoylchinezuur. Het zuiveringsproces heeft de niveaus van gallinezuur en p-coumaarzuur niet significant veranderd. Het verhoogde echter de niveaus van 3- O- cafeylechinezuur van 170,5 - 235,3 ppm en van quercetine van 24,5 tot 95 ppm. In tegenstelling hiermee verdwenen ferulzuur en rutine tijdens de zuivering van CE.
De behandeling van VSMC's met 50 - 500 μg / ml CE en PE toonde aan dat beide extracten effectief waren bij het reduceren van de basale fosforylering van ERK1 / 2. Echter, PE vertoonde een sterkere downregulatie in de activiteit van deze kinase bij een lagere concentratie: 100 & #181; g / ml voor PE vergeleken met 400 - 500 μg / ml voor CE. Deze resultaten kunnen de hogere concentratie van 3- O- cafeylechinezuur of quercetine in PE weerspiegelen. Het gebruik van individuele fenolische verbindingen in cellen in cultuur is nodig om de specifieke verbinding (fen) die verantwoordelijk zijn voor de downreguatie van ERK1 / 2 fosforylering te identificeren.
De verminderde activiteit van signaleringskinasen, waaronder Akt, ERK1 / 2 en p38MAPK, veroorzaakt door gezuiverde polyfenolen geïsoleerd uit BL, RB en BRB 21 , alsmede van ERK1 / 2 veroorzaakt door BL CE, is hierin in overeenstemming met Eerdere rapporten. Bijvoorbeeld, polyfenol-extracten die geïsoleerd zijn van blauwbessen, verlaagden de tumorgroei van mammakankercellen, onder meer door de activiteit van Akt en ERK1 / 2 30 te verminderen . Zoals eerder vermeld zijn deze kinases ook betrokken bij de inductie van cellulaire senescentie door Ang II 21 , wat suggereert dat polyfenolen van BL, RB en BRB shoulD verminderen vasculaire veroudering en dysfunctie geassocieerd met CVD.
Zoals we eerder 21 hebben gemeld, werden de expressies van catalase en SOD2 niet gereguleerd door PE, zelfs bij concentraties tot 500 μg / ml. Aangezien CE ook ondoeltreffend was bij toenemende katalase- en SOD2-expressie, suggereren deze gegevens dat de fenolische verbindingen die tijdens het zuiveringsprotocol zijn verloren, niet betrokken zijn bij de regulering van deze antioxidante enzymen. Deze gegevens suggereren ook dat het hier getoonde zuiveringsprotocol effectief geconcentreerde fenolische verbindingen die relevant zijn voor de regulering van Ang II signalering, oxidatieve stress en cellulaire senescentie. Bijvoorbeeld, de representatieve resultaten tonen aan dat PE sterk Anglo-geïnduceerde ERK1 / 2 fosforylering in hoge mate reguleerde. De beoordeling van de fosforylering van deze kinase is relevant omdat de remming van ERK1 / 2-activiteit Ang II-geïnduceerde cellulaire senescentie 21 voorkomt.
In tErms van wijzigingen van eerdere protocollen, hierbij werd een sonicatie toegevoegd om de extractieopbrengst voor CE te verhogen. Bovendien, voor de zuivering van polyfenolen, in plaats van het gebruik van een C18-patroon, zoals beschreven door Kim en Lee 27 , is een meer traditionele methode van Queires et al . 28 werd hierbij aangenomen. Een filtratiestap, waarbij filterpapier werd gebruikt om onzuiverheden te verwijderen, werd toegevoegd aan de zuivering van de polyfenol-sectie. Wat de beperkingen betreft, dienen de sonication- en verdampingsstappen zorgvuldig te worden gecontroleerd naargelang het gebruikte instrument, aangezien de duur en temperatuur van de sonicatie en verdamping de kritieke stappen zijn in dit protocol. De bij deze methode aangebrachte wijzigingen resulteerden in de hoogste opbrengst van polyfenolen in vergelijking met eerdere methoden 27 , 28 die in ons laboratorium werden gebruikt (data niet getoond), waarschijnlijk door de toevoeging van een sonicatiestap. Als mentiIn het protocol gedeelte kan dit protocol worden gebruikt voor bevroren gedroogde poeder uit verschillende bessen, evenals voor bevroren vruchten. Deze methode is succesvol gebruikt om polyfenolen uit frambozen en zwarte frambozen 21 te verwijderen en te zuiveren, evenals van bosbessen en aardbeien (gegevens niet getoond). Zo kan deze methode ook worden gebruikt om polyfenolen uit andere soorten voedingsmiddelen, met inbegrip van groenten, te extraheren.
Ten slotte concludeert dit werk een snelle, kosteneffectieve en makkelijk reproduceerbare methode om polyphenolen van bessen te isoleren, waardoor het mogelijk is de concentraties te behouden en te concentreren die beschermd zijn tegen oxidatieve stress in VSMC's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Dit werk werd gefinancierd door de American Heart Association (14GRNT20180028) en de Florida State University Council for Research and Creativity (COFRS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M.
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
