Summary
Bu çalışma, dondurularak kurutulmuş çilek tozundan polifenol bakımından zengin ekstraktları hazırlamak için adım adım bir yöntemi ayrıntılarıyla anlatmaktadır. Buna ek olarak, Vasküler Düz Kas Hücreleri (VSMC) kullanarak peptit hormonu anjiyotensin II'nin (Ang II) varlığında hücre kültüründe bu polifenol bakımından zengin özütlerin nasıl kullanılacağına dair kapsamlı bir açıklama sağlar.
Abstract
Epidemiyolojik çalışmalar, artan flavonoid alımının, Birleşik Devletler (ABD) ve Avrupa'da kardiyovasküler hastalıklara (KVH) bağlı mortalitenin azalmasıyla korele olduğunu göstermektedir. Çilek yaygın olarak ABD'de tüketilir ve yüksek bir polifenolik içeriğe sahiptir. Polifenollerin birçok moleküler hedef ile etkileşime girdiği ve antioksidan, anti-enflamatuar ve kardiyoprotektif etkileri de dahil olmak üzere çok sayıda pozitif biyolojik fonksiyonlar sergilediği gösterilmiştir. Böğürtlen (BL), ahududu (RB) ve siyah ahududu (BRB) izole edilen polifenoller anjiyotensin II'ye (Ang II) yanıt olarak oksidatif stres ve hücresel yaşlanmayı azaltır. Bu çalışma, dondurularak kurutulmuş meyvelerden polifenol özütleri hazırlamak için kullanılan protokolün ayrıntılı bir tarifi sağlar. Dondurularak kurutulmuş çilek tozundan polifenol ekstraksiyonları% 80 sulu etanol ve bir ultrason yardımlı ekstraksiyon yöntemi kullanılarak gerçekleştirildi. Ham öz, daha da arıtıldı ve kloroform ve etil asetat kullanılarak fraksiyonlandınldı,sırasıyla. Hem ham hem de saflaştırılmış ekstraktların etkileri kültürde Vasküler Düz Kas Hücreleri (VSMC'ler) üzerinde test edildi.
Introduction
Polifenoller yapılarında en az bir fenolik halka içeren bileşiklerdir ve bitki krallığı 1'de bol miktarda bulunurlar. İnsanlar, bu gibi bileşiklerin varlığından haberdar olmaksızın, binlerce yıldır şifalı bitkiler tüketiyorlar. Birçok meyve ve sebze, flavonoidler, stilbenler ve fenolik asitleri içeren farklı miktarlarda olsalar da, paylaşılan bazı polifenolik bileşiklere sahiptir 3 . Polifenoller çoğunlukla renkli meyve ve sebzelerle ilişkiliyse de, bu kesinlikle doğru değildir. Örneğin, soğan ve sarımsak gibi son derece renkli olmayan sebzelerde zeaksantin ve ksantin, tarçın ailesinden ve sayısız sağlık yararı 4 ile ilişkilendirilmiştir. Birkaç sağlık faydası 5 ile bağlantılı olmanın yanı sıra, polifenoller, böceklerden veD ultraviyole ışınımı 2 . Polifenoller, insan diyetinde yaygın olarak bulunurlar ve Reaktif Oksijen Türlerini (ROS) sileceği için güçlü antioksidanlar olarak kabul edilirler 6 , 7 , 8 . Ayrıca anti-inflamatuar 9 , antimikrobiyal 10 , anti-hipertansif 11 ve anti-kanserojen 12,13 özellikleri vardır.
Epidemiyolojik çalışmalar, flavonoidlerin tüketimi ile kardiyovasküler hastalık (KVH) insidansı 16 , 17 ve mortalite 14 , 15 arasında ters bir ilişki olduğunu ortaya koymaktadır. Çilek yaygın olarak ABD'de tüketilir ve flavonoidler de dahil olmak üzere polifenollerin yüksek miktarlarda bulunur. Örneğin, böğürtlen (BL) suyunun tüketimi (300 ML / gün), dislipidemik hastalarda sistolik kan basıncını önemli ölçüde düşürmüştür [ 18] . Jeong ve ark. 19 , günde 2.5 g siyah ahududu (BRB) ekstresi tüketen hipertansif erkek ve kadınların plasebo alanlara kıyasla 24 saat daha düşük ve gece kan basıncına sahip olduklarını bildirmiştir. Ahududay (RB) spontan hipertansif sıçanlarda süperoksit dismutaz (SOD) ekspresyonunu arttırırken kan basıncını düşürdü 20 . Yakın zamanda, BL, RB ve BRB'nin Vasküler Düz Kas Hücrelerinde (VSMC) 21 anjiyotensin II (Ang II) tarafından indüklenen ROS ve yaşlanma düzeylerini düşürdüğü gösterilmiştir. Ek olarak, BL ekstraktından alınan antosiyanin fraksiyonu, uyarılabilir nitrik oksit sentaz (iNOS) ekspresyonunu azalttı ve lipopolisakkarid (LPS) uyarılmış Nükleer Faktör kappa B (NF-κB) ve hücre dışı sinyal regüle kinaz (ERK) aktivitesini inhibe etti J774 hücreleriAss = "xref"> 22. BRB ekstreleri in vitro 23'te NF-κB aktivasyonunu ve siklooksijenaz 2 (COX-2) ekspresyonunu azalttı, lipid profilini geliştirdi ve yüksek yağlı bir diyetle beslenen farelerde ateroskleroz lezyon oluşumunu önledi 24 . Çilek içerisinde en bol flavonoid olarak kabul edilen antosiyaninler, Tümör Nekroz Faktörü alfa (TNF-α) üretimini azaltarak LPS ile uyarılan RAW 264.7 makrofajlanndaki iltihap tepkisini modüle eder 25 ve VSMC'lerin çoğalmasını ve göçünü azaltır 26 .
Polifenollerin insan sağlığı ve hastalığındaki rolünü anlama konusundaki artan ilgi bu yana, ekstraksiyon yöntemini optimize etmek önemlidir. Çözücü ekstraksiyonu, bu amaca uygun olarak kullanılır; zira maliyet açısından etkili ve kolayca üretilebilir. Bu çalışmada, bir solvent ekstraksiyonu etanol ile birlikte ultrasonik yardımlı ekstrakt ileN metodu, Kim ve Lee'den uyarlanmıştır 27 . Querous et al'dan uyarlanan saflaştırılmış özüt (PE) fraksiyonunu elde etmek için kloroform ve etil asetat kullanılarak ham özütlerin (CE) saflaştırılması ve fraksiyonlanması gerçekleştirildi. Bundan başka, ERKl / 2'nin bazal fosforilasyonunu düşürürken BL'den saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının etkinliği karşılaştırılmış ve saflaştırılmış BL polifenol ekstresinin VSMC'lerde Ang II ile uyarılan sinyal azalmaları üzerindeki önleyici etkisinin temsili örnekleri sağlanmıştır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Reaktiflerin Hazırlanması
- 80 mL mutlak etanol (moleküler biyoloji sınıfı) ve 20 mL hücre kültürü dereceli steril su karıştırılarak% 80 etanol (100 mL) hazırlayın.
- Polifenol özütü (10 mg / mL) hazırlamak için, 10 mg CE veya PE ağırlığındasınız. Bir hücre kültür kapağının altında 1 mL düz Dulbecco Modifiye Kartal Ortamı (DMEM) ekleyin. Çözümü vorteksleyin. 200 μL'lik kısımlar halinde alikotu ve -20 ° C'de saklayın.
- Lizis tamponunu hazırlayın.
- 5 mL 1 M HEPES stok solüsyonu (pH 7.4, son 50 mM), 1 mL 5 M NaCl stok çözeltisi (50 mM nihai), 1 mL 0.5 M EDTA stok solüsyonu (5 mM nihai), 2 mL 0.5 M NaF stok çözeltisi (son 10 mM), 286 uL 700 mM Na3VO4 stok solüsyonu (2 mM nihai), 5 mL 200 mM Na4P207 stok çözeltisi (10 mM nihai) ve 5 mL % 20 Triton-X-100 stok solüsyonu suda (% 1 final) hazırlandı. 100 mL'lik bir hacme ulaşmak için su ekleyin. 4 ° C'de tutun.
- Laemmli numune tamponunu (4x) hazırlayın.
- 31.25 mL 2 M Tris stok solüsyonu (pH 6.8), 100 mL gliserol, 50 mL% 20 Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) çözeltisi ve 50 mL β-merkaptoetanol ilave edin. 250 mL'ye kadar su ilave edin. 4 ° C'de tutun.
- Tris Tamponlu Tuz (TBS) tamponu hazırlamak için 3 g Tris (25 mM nihai), 0.18 g KCI (2.5 mM nihai) ve 8.76 g NaCl (150 mM nihai) tartın. PH'ı 7.4'e ayarlayın ve 1 L'ye kadar su ekleyin. RT'de tutun.
- TBS-T'yi hazırlamak için, 997.5 mL TBS ve su içinde hazırlanmış 2.5 mL% 20 Triton-X-100 solüsyonu ilave edin. RT'de tutun.
2. Siyahan Ekstrelerinin Hazırlanması
- Dondurularak kurutulmuş çilek tozundan ham özütün hazırlanması.
- 10 g dondurularak kurutulmuş böğürtlen tozu (veya 5 g taze toz) tartılır. Donmuş meyve kullanılırsa, i kesÇıkarmaya başlamadan önce çok küçük parçalara.
- Meyve tozu 100 mL% 80 sulu etanol ile 1 L yuvarlak tabanlı Erlenmeyer şişe içinde karıştırılır.
- Karışımı 25 dakika süreyle 42 kHz'de 135 W, ultrasonik bir banyo kullanarak herhangi bir zaman aralığı olmadan 20 dakika süreyle sonike hale getirin. Sonikasyonu, azotlu ışıkta sürekli nitrojen tasfiye ederek gerçekleştirin. Dondurulmuş meyveler için kuluçka süresini 4 saate çıkarın.
- Karışımı # 2 filtre kağıdından geçirerek vakumlu emmeli soğutulmuş Buchner hunisini kullanarak filtre edin.
NOT: Bu adımın sonunda, numunenin artıkları filtre kağıdında görünür; Buna filtre kek denir. - Filtre pastasını 50 mL% 100 etanol ile durulayın. Süzüntüsünü saklayın ve filtre keki 100 mL% 80 sulu etanol içeren 1 L'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye ekleyin.
- Artık madde için ekstraksiyon işlemini tekrarlayın (aşamalar 2.1.2 - 2.1.4 adımları).
- İki süzüntüyü, ilave 50 mL'lik yuvarlak tabanlı bir şişeye% 80 sulu etanol.
NOT: Nihai hacim yaklaşık 300 mL olmalıdır. - Solventi buharlaştırmak için 62 ° C'de ve 50 rpm'de bir döner buharlaştırıcı kullanın. Etanol artık buharlaşıncaya kadar bu işleme devam edin.
NOT: Bu işlem yaklaşık 45 dakika sürmektedir. - Numuneyi 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın. Tüpün üst kısmına nitrojen gazı enjekte ederek etanolü 10 dakika boyunca buharlaştırın.
NOT: Bu basamak, etanolün tamamen buharlaşmasını sağlamak için gereklidir. Bu aşamadaki numunenin hacmi yaklaşık 20 mL'dir. - Numuneyi -80 ° C'de en az 24 saat boyunca dondurun.
NOT: Bu adım daha verimli bir dondurarak kurutma işlemine izin vermek için gereklidir. - -80 ° C'de yaklaşık 8 saat boyunca örneği dondurarak kurutun. Örnekleri -20 ° C'de saklayın.
NOT: Dondurma kurutucu numuneleri kurutmak için haznenin içinde -50 ° C'de güçlü bir vakum oluşturur ancak polip gibi bileşimlerin çoğunu korurfenoller.
- Ham özütlerden saf polifenol ekstraktlarının hazırlanması.
- Dondurularak kurutulmuş özütlenen örnekleri tartın.
NOT: Bu adımda özütün hacmi yaklaşık 10 mL'dir. - Ham özlüğe iki hacim (~ 20 mL) kloroform ilave edin ve çözeltiyi bir karıştırma plakasında 5 dakika çalkalayın.
- Karışımı ayırma hunisine döktürün. Ham et ekstrakte edilerek saflaştırılmış fraksiyon elde edilir.
NOT: Bu aşamada iki fazlı bir karışım oluşur. - Alt tabakayı (kloroform fazı) ayırma hunisinden atın ve sulu tabakayı temiz bir behere toplamayın.
- Sulu fraksiyona iki hacim etil asetat ilave edin ve karışımı oda sıcaklığında 5 dakika karıştırmak için manyetik bir karıştırma çubuğu kullanın.
- Karışımı, # 2 filtre kağıdından vakum emmeli soğutulmuş Buchner hunisini kullanarak filtre edin.
- Filtrelenen numuneyi toplayın ve biz olabilmek için yuvarlak tabanlı bir şişeye aktarın.Döner buharlaştırıcı ile
- Döner buharlaştırıcıyı 62 ° C ve 50 rpm'ye ayarlayın ve etil asetatı yaklaşık 30 dakika buharlaştırın.
- -80 ° C'de yaklaşık 8 saat boyunca örneği dondurarak kurutun. Numuneyi 50 mL'lik bir konik tüpe aktarın ve -20 ° C'de saklayın.
- Dondurularak kurutulmuş özütlenen örnekleri tartın.
3. Berilyum özleri ile VSMC'lerin tedavisi
- VSMC kültürü.
- Daha önce tarif edildiği gibi, bir enzimatik sindirim gerçekleştirerek VSMC'leri Sprague-Dawley sıçanlarının torasik aortlarından izole edin 29 . VSMC'leri tarif edildiği gibi kültürleyin 29 .
- 1 g / L glikoz içeren ve% 10 Fetal Sığır Serumu (FBS), 100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin ve 2 mM L-glutamin ile takviye edilmiş DMEM kullanarak VSMC'lerin kültürü için komple ortam hazırlayın. Ortamı 4 ° C'de saklayın.
- VSMC'lerin polifenol ekstraktlarıyla inkübe edilmesi.
- VSMC'leri bölmek için, kültürü atınOrta ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez hücreleri yıkayın. 4 mL PBS ve 2 mL tripsin EDTA% 0.25 ekleyin. 37 dakika CO 5 inkübatörde 5 dakika boyunca hücreleri inkübe edin.
- Hücreleri toplayın, 15 mL'lik bir santrifüj tüpünde 2 mL komple ortam ile karıştırın ve 1100 x g'de 5 dakika santrifüjleyin. Süpernatantı atın ve hücre pelletini 1 mL PBS ile tekrar süspanse edin. Hemocytometer kullanarak hücreleri sayın.
- 6 oyuklu kültür plakalarında kuyu başına 50,000 VSMCs tohumlayın ve% 90 konfluansa (yaklaşık 3 gün) erişene kadar onları% 10 FBS içeren komple ortamda büyütün. VSMC'leri nemlendirilmiş% 5 CO2 inkübatöründe 37 ° C'de muhafaza edin.
- 1 g / L glikoz, 100 U / mL penisilin, 100 mg / mL streptomisin, 2 mM L-glutamin ve% 0.5 FBS içeren DMEM ortamı kullanarak işleme orta hazırlayın. İşlem ortamını 4 ° C'de saklayın.
NOT: Polifenol ekstraktları ve Ang II, bu mestadyumu. - 10 mg ekstraktın 1 mL düz DMEM ortamına özülmesi ile polifenollerin 10 mg / mL'lik Ham Eriteki (CE) veya Saflaştırılmış Özüt (PE) stok çözeltisini hazırlayın. Stok -20 ° C'de 200 mcL alikotları halinde tutun.
- VSMC'leri% 0.5 FBS içeren 2 mL işlem ortamıyla kuluçkalayın ve 50-500 μg / mL konsantrasyon elde etmek için CE veya PE özütleri ekleyin. Ortamı her 24 saatte bir taze polifenol ekstraktları ekleyerek değiştirin. Hücreleri 3 gün boyunca tedavi edin.
- Ang II veya diğer hormonlar ve büyüme faktörleri ile tedavi için, Ang II'nin (100 nM) ilavesinden önce% 0.5 FBS içeren işleme ortamı ile hücreleri inkübe etmek suretiyle hücreleri en az 24 saat aç bırakın.
NOT: Ang II ilavesi öncesi% 0.5 FBS muamele ortamında CE ve PE içeren veya içermeyen inkübasyon önerilir.- Açlıktan 24 saat sonra 100 nM Ang II ekleyin. Tedavi ortamını 3 saat boyunca her 24 saatte bir taze CE, PE veya Ang II ile değiştirin.
- VSMC'leri bölmek için, kültürü atınOrta ve fosfat tamponlu salin (PBS) ile iki kez hücreleri yıkayın. 4 mL PBS ve 2 mL tripsin EDTA% 0.25 ekleyin. 37 dakika CO 5 inkübatörde 5 dakika boyunca hücreleri inkübe edin.
- Hücre örneklerinin hazırlanması.
- İşlenmiş hücreleri iki kez soğuk PBS içerisinde yıkayın ve buz üzerinde 200 μL liziz tamponu ile çözündürünüz.
- Hücre sıyırıcıları kullanarak hücre lizatları toplayın ve lizatları 1.5 mL'lik mikrosantrifüj tüplerine aktarın. Toplam hücre lizatlarını buz üzerinde 20 dakika inkübe edin ve her 5 dakikada bir girdaplayın.
- Hücre özütlerini, her biri 10 saniye süreyle 125 W'da üç patlamayla sonlandırın ve arasında 2 sn duraklama yapın. Sonication boyunca örnekleri buzda tutun.
- 595 nm'de bir protein assay reagent kullanarak protein konsantrasyonunu ölçün.
- Western leke analizi için örnekleri -20 ° C'de saklayın.
- Western leke.
- Kontrol edilmeyen ve polifenol ile muamele edilmiş veya Ang II ile muamele edilmiş örneklerin lizis tamponu ile eşit miktarda protein (yaklaşık 50 ug) karıştırın ve maksimum toplam hacim 50 μL'dir. 16 uL 4x Laemmli numune tamponu ekleyin. Numuneleri 75 ° C'de 5 dakika ısıtın.
- Örneklemi ayır% 10 SDS-PAGE jelleri içerisinde süspansiyon haline getirin ve spesifik antikorlarla Western leke analizi için yarım kuru bir transfer sistemi içinde 75 dakika boyunca 10 V'de PDVF membranlara aktarın.
- Membranı TBS% 0.05 Triton-X100 tamponu (TBS-T) içinde% 2 süt ile 20 dakika bloke edin.
- Memeyi TBS (her biri 5 dakika) ile en az üç kez yıkayarak sütü çıkarın ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında veya 0 ° C'de birincil antikorlarla inkübe edin (4 ° C).
- Membranı TBS-T ile üç kez, her 10 dakikada yıkayın ve 45 dakika boyunca bir HRP-bağlantılı sekonder antikorla inkübe edin.
- Membranı TBS-T ile üç kez, her birinde 10 dakika yıkayın ve gelişmiş kimyasal ışıkla (ECL) geliştirin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Daha önce BL, RB ve BRB'den izole edilen polifenol ekstraklarının Ang II 21'e yanıt olarak VSMC'lerin yaşlanmasını azalttığı gösterilmiştir. Bu saflaştırılmış polifenol ekstraktlarının Akt, p38 Mitojen-Aktive Edilmiş Protein Kinazı (MAPK) ve ERK1 / 2'nin fosforilasyonunu azaltarak Ang II sinyallemesini modüle ettiği gösterilmiştir. BL, süperoksit anyonları üreten ve Ang II tarafından kuvvetle yukarı doğru düzenlenen bir enzim olan NADPH oksidaz (Nox) 1'in ekspresyonunu azaltarak yaşlanmayı önler. Tersine, RB ve BRB antioksidan enzimler SOD1, SOD2 ve glutatyon peroksidaz 1'in (GPx-1) ekspresyonunu arttırdığı için Nox1 bağımsız bir mekanizma tarafından yaşlanmayı önler. BL, SOD2 ekspresyonunu arttırmak için başarısız olurken, özütlerin hiçbiri, Ang II 21'in katalazın downregülasyonunu zayıflatmaz. BL, SOD2 üzerindeki BL eksikliğinin ve katalaz ekspresyonunun eksikliği olup olmadığının belirlenmesine odaklanmıştırSaflaştırma işlemi sırasında bir polifenol bileşikleri kaybı veya özde bir polifenolik bileşiğin yetersiz konsantrasyonu ile açıklanabilir. VSMC'ler% 0.5 FBS içeren ortamda 50-500 ug / mL CE ( Şekil 1A ) veya PE ( Şekil 1B ) ile üç gün inkübe edildi. Test edilen konsantrasyonların hiçbirinde CE ya da PE SOD2'yi ya da katalaz seviyelerini yükseltmedi. Pozitif bir kontrol olarak ERK1 / 2 fosforilasyonu ölçülmüştür ve CE'nin bu kinazın fosforilasyonunu 300 ug / mL'den yüksek konsantrasyonlarda azalttığı bulunmuştur. Buna karşılık, PE yaklaşık 100 ug / mL'de etkili olmuştur ( Şekil 1B ). 200-500 ug / mL konsantrasyonlarında düşük fosforilasyon seviyeleri gözlenmiştir. Bu veriler 200 μg / mL BL PE'nin Ang II sinyalizasyonunu azaltmaya yeterli olduğunu gösteren önceki gözlemi desteklemektedir 21 . Bu sonuçlar, yüksek polifenol konsantrasyonlarınınPE'de, CE'ye kıyasla, bu ekstraktın ERK1 / 2 fosforilasyonunu azaltmada yüksek verimliliğini açıklayabileceği düşünülmektedir. Bu fikri test etmek için her iki ekstraktın polifenol kompozisyonları karşılaştırılmıştır. CE'de polifenol bileşiklerinin tanımlanması ve nicelenmesi, daha önce tarif edildiği gibi 21 ( Tablo 1 ) ile HPLC ile gerçekleştirildi. 3- O- kafeinokinik asit ve kersetin PE'de PE'ye kıyasla daha yüksek seviyelerde bulunurken, ferulik asit ve rutin sadece CE'de bulundu. Daha sonra, VSMC'ler 100 nM Ang II ilavesinden 24 saat önce 200 ug / mL BL PE ile muamele edildi ( Şekil 1C ). Daha önce bildirildiği gibi 21 , BL polifenol ekstresi Ang II ile indüklenen ERK1 / 2 fosforilasyonunu azalttı, ancak katalaz ve SOD2 ekspresyonu üzerinde herhangi bir etki göstermedi.
| Analitikler (ppm) | PE | CE |
| Fenolik asitler | ||
| gallik asit | 243.5 | 321,9 |
| P-kumarik asit | 32.9 | 46.5 |
| Ferulik asit | - | 236,5 |
| Klorojenik asitler | ||
| 3-0-kafeoilkinik asit | 235,3 | 170.5 |
| 4-0-kafeoilkinik asit | 13 | 76.9 |
| 5-O-kafeoilkinik asit | 14.1 | 49.9 |
| FLAVONOİDLER | ||
| flavonoller | ||
| quercetin | 95 | 24.5 |
| flavanonlar | ||
| rutin | - | 37.8 |
Tablo 1: Ham ve Polifenol ile Arındırılmış Ekstraktlardaki Böğürtlenin Polifenol Bileşiminin Analizi. Ham Ekstrakt (CE) ve Saflaştırılmış Özüt (PE) içerisindeki fenolik asitler ve flavonoidler, Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi (HPLC) kullanılarak analiz edildi. Analitlerin konsantrasyonu ppm olarak ifade edilmiştir. BL PE'deki polifenollerin kompozisyonu kısa bir süre önce yayınlanmış ve CE ile karşılaştırılarak tabloya eklenmiştir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Çileklerden izole edilen polifenoller farklı bileşimler içerir. Burada açıklanan etanol bazlı ekstraksiyon protokolü, BL'nin ham ve saflaştırılmış polifenol özütlerinde mevcut olan farklı seviyelerde fenolik asitlerin ve flavonoidlerin tanımlanmasına izin verdi ( Tablo 1 ). CE, gallik asit, ferulik asit, 4-0-kafeoilkinik asit ve 5-0-kafeoilkinik asitte zenginleştirildi. Saflaştırma işlemi galik asit ve p-kumar asit seviyelerini önemli ölçüde değiştirmedi. Bununla birlikte, 3- O- kafeinokinik asit seviyelerini 170.5-235.3 ppm'den ve kuersetin düzeyini 24.5-95 ppm'den yükseltti. Aksine, ferulik asit ve rutin, CE saflaştırılması sırasında kaybedilmiştir.
50-500 μg / mL CE ve PE ile VSMC'lerin tedavisi, her iki özütün de ERK1 / 2'nin bazal fosforilasyonunu azaltmada etkili olduğunu gösterdi. Bununla birlikte, PE, bu kinazın daha düşük konsantrasyonda aktivitesinde daha güçlü bir downregülasyon gösterdi: 100 & #181; PE için g / mL, CE için 400-500 μg / mL. Bu sonuçlar PE'de bulunan yüksek oranda 3- O- kafeinokinik asit veya quercetin yansıtmaktadır. Kültürdeki hücrelerdeki tek tek fenolik bileşiklerin kullanılması, ERK1 / 2 fosforilasyonunun indirgenmesinden sorumlu spesifik bileşik (ler) i tanımlamak için gereklidir.
Burada gösterilen, BL CE'den kaynaklanan ERK1 / 2'nin yanı sıra BL, RB ve BRB 21'den izole edilen saflaştırılmış polifenollerin neden olduğu Akt, ERK1 / 2 ve p38MAPK dahil olmak üzere sinyal kinazlarının azaltılmış aktivitesi, Önceki raporlar. Örneğin, yabanmersinden izole edilen polifenol ekstraktları kısmen Akt ve ERK1 / 2 30 aktivitesini azaltarak meme kanseri hücrelerinin tümör büyümesini azalttı. Daha önce de belirtildiği gibi, bu kinazlar, Ang II 21 tarafından hücresel yaşlanmanın indüklenmesinde yer alır ve BL, RB ve BRB'nin polifenollerininVasküler yaşlanmayı ve CVD ile ilişkili disfonksiyonu azaltır.
Daha önce bildirdiğimiz gibi 21 , katalaz ve SOD2 ekspresyonu, 500 μg / mL kadar yüksek konsantrasyonlarda bile PE tarafından upregüle edilmedi. Katalaz ve SOD2 ekspresyonunu arttırmada CE de etkisiz olduğu için bu veriler, saflaştırma protokolü sırasında kaybedilen fenolik bileşiklerin, bu antioksidan enzimlerin düzenlenmesinde rol oynamadığını göstermektedir. Bu veriler ayrıca, burada gösterilen saflaştırma protokolünün, Ang II sinyali, oksidatif stres ve hücresel yaşlanmanın düzenlenmesiyle ilgili fenolik bileşikleri etkili bir şekilde konsantre ettiğini ileri sürmektedir. Örneğin, Temsilci Sonuçlar, PE'nin Ang II ile uyarılan ERK1 / 2 fosforilasyonunu güçlü bir şekilde indirgediğini göstermektedir. Bu kinazın fosforilasyonunun değerlendirmesi, ERK1 / 2 aktivitesinin inhibisyonu Ang II'nin indüklediği hücre yaşlanmasını önlediği için önemlidir21.
TÖnceki protokollere yapılan değişiklikler dolayısıyla, CE için ekstraksiyon verimini artırmak için burada bir sonikasyon eklendi. Ek olarak, Kim ve Lee 27 tarafından açıklandığı gibi bir C18 Kartuşu kullanmak yerine, polifenollerin saflaştırılması için, Queires ve diğerleri tarafından daha geleneksel bir yöntem kullanılmaktadır. 28 burada kabul edildi. Polifenol bölümünün saflaştırılmasına, saf olmayan maddelerin uzaklaştırılması için filtre kağıdı kullanılan bir filtreleme aşaması eklenmiştir. Sınırlamalar açısından, sonikasyon ve buharlaşma adımları, kullanılan aletin türüne göre dikkatlice izlenmelidir, çünkü sonikasyon ve buharlaşma sıcaklığı ve sıcaklık bu protokolün kritik adımlarıdır. Bu metoda ilave edilen modifikasyonlar, büyük olasılıkla bir sonikasyon adımı eklenmesinden dolayı laboratuvarımızda kullanılan 27 , 28 önceki yöntemlere (veri gösterilmemiştir) kıyasla en yüksek polifenol verimine neden oldu. Menti olarakProtokol bölümünde yer alan bu protokol, çeşitli meyvelerin yanı sıra dondurulmuş meyvelerin dondurularak kurutulmuş tozları için de kullanılabilir. Bu yöntem, ahududu ve siyah ahududus 21'in yanı sıra yaban mersini ve çilekten polifenollerin ekstrakte edilmesi ve saflaştırılması için başarıyla kullanılmıştır (veriler gösterilmemiştir). Bu nedenle, bu yöntem, sebzeler de dahil olmak üzere diğer gıdalardan polifenollerin çıkarılması için de kullanılabilir.
Sonuç olarak, bu çalışma, meyvelerden polifenolleri izole etmek için hızlı, düşük maliyetli ve kolaylıkla üretilebilen bir yöntemin ayrıntılarını vermektedir; bu yöntem, VSMC'lerde oksidatif strese karşı koruyucu olan bileşiklerin tutulmasına ve konsantrasyonuna olanak tanır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak bir şeyi yok.
Acknowledgments
Bu çalışma Amerikan Kalp Derneği (14GRNT20180028) ve Florida Eyalet Araştırma ve Yaratıcılık Konseyi (COFRS) tarafından finanse edildi.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Angiotensin II | Sigma-Aldrich, Inc. | A9525-10MG | Treatment of VSMCs |
| β-actin | Sigma-Aldrich, Inc. | A2228 | Primary antibody (1:5000) |
| Blackberry fruit | Mercer Foods | Freeze-dried blackberry powder | |
| Catalase | Calbiochem | 219010 | Primary antibody (1:1000) |
| Chloroform | Biotech Grd, Inc. | 97064-678 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM ) | Mediatech, Inc. | 10-014-CV | Culture of VSMCs |
| Ethanol (absolute molecular biology grade) | Sigma-Aldrich, Inc. | E7023-500ML | Preparation of polyphenol extracts |
| Ethylacetate | Sigma-Aldrich, Inc. | 439169 | Preparation of purified polyphenol extracts |
| ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9102S | Primary antibody (1:500) |
| EDTA, 500 mM, pH 8.0 | Teknova, Inc. | E0306 | Lysis buffer |
| Freeze-Dryer | Labconco | VirTis Benchtop K | Preparation of polyphenol extracts |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1400-500 | Cell culture |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | Lysis buffer |
| NaCl | EMD Millipore, Inc. | 7760 | Lysis buffer |
| NaF | J.T.Baker, Inc. | 3688-01 | Lysis buffer |
| Na3VO4 | Sigma-Aldrich, Inc. | 450243 | Lysis buffer |
| Na4P2O7 , decahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | S-9515 | Lysis buffer |
| phospho ERK1/2 | Cell Signaling Technology, Inc. | 9101S | Primary antibody (1:1000) |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich, Inc. | P8340-5ml | Lysis buffer |
| Protein assay dye reagent | Bio-Rad Laboratories, Inc. | 500-0006 | Protein concentration Measurement |
| PVDF transfer membrane | Thermo Scientific, Inc. | 88518 | Western blots |
| Rotatory Evaporator | Buchi Labortechnik | Rotavapor R3000 |
Preparation of polyphenol extracts |
| Sterile water | Mediatech, Inc. | 25-055-CV | Preparation of polyphenol extracts |
| Sonicator | QSonica, LLC | Q125 | Preparation of cell extracts |
| SOD2 | Enzo Life Sciences, Inc. | ADI-SOD-110-F | Primary antibody (1:1000) |
| Triton-X-100 | Sigma-Aldrich, Inc. | X100 | Western blots |
| Whatman #2 filter paper | GE Healthcare, Inc. | 28317-241 | Preparation of polyphenol extracts |
References
- Morton, L. W., Abu-Amsha Caccetta, R., Puddey, I. B., Croft, K. D. Chemistry and biological effects of dietary phenolic compounds: relevance to cardiovascular disease. Clin Exp Pharmacol Physiol. 27 (3), 152-159 (2000).
- Sekirov, I., Russell, S. L., Antunes, L. C., Finlay, B. B. Gut microbiota in health and disease. Physiol Rev. 90 (3), 859-904 (2010).
- Manach, C., Scalbert, A., Morand, C., Remesy, C., Jimenez, L. Polyphenols: food sources and bioavailability. Am J Clin Nutr. 79 (5), 727-747 (2004).
- Griffiths, G., Trueman, L., Crowther, T., Thomas, B., Smith, B. Onions--a global benefit to health. Phytother Res. 16 (7), 603-615 (2002).
- Mazzoni, L., et al. The genetic aspects of berries: from field to health. J Sci Food Agric. 96 (2), 365-371 (2016).
- Wang, S. Y., Jiao, H. Scavenging capacity of berry crops on superoxide radicals, hydrogen peroxide, hydroxyl radicals, and singlet oxygen. J Agric Food Chem. 48 (11), 5677-5684 (2000).
- Choi, M. H., Shim, S. M., Kim, G. H. Protective effect of black raspberry seed containing anthocyanins against oxidative damage to DNA, protein, and lipid. J Food Sci Technol. 53 (2), 1214-1221 (2016).
- Forbes-Hernandez, T. Y., et al. The Healthy Effects of Strawberry Polyphenols: Which Strategy behind Antioxidant Capacity? Crit Rev Food Sci Nutr. 56, Suppl 1. S46-S59 (2016).
- Figueira, M. E., et al. Protective effects of a blueberry extract in acute inflammation and collagen-induced arthritis in the rat. Biomed Pharmacother. 83, 1191-1202 (2016).
- Daglia, M. Polyphenols as antimicrobial agents. Curr Opin Biotechnol. 23 (2), 174-181 (2012).
- Hügel, H. M., Jackson, N., May, B., Zhang, A. L., Xue, C. C. Polyphenol protection and treatment of hypertension. Phytomedicine. 23 (2), 220-231 (2016).
- Niedzwiecki, A., Roomi, M. W., Kalinovsky, T., Rath, M. Anticancer Efficacy of Polyphenols and Their Combinations. Nutrients. 8 (9), E552 (2016).
- Kresty, L. A., Mallery, S. R., Stoner, G. D. Black raspberries in cancer clinical trials: Past, present and future. J Berry Res. 6 (2), 251-261 (2016).
- Hertog, M. G., et al. Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study. Arch Intern Med. 155 (4), 381-386 (1995).
- Peterson, J. J., Dwyer, J. T., Jacques, P. F., McCullough, M. L. Associations between flavonoids and cardiovascular disease incidence or mortality in European and US populations. Nutr Rev. 70 (9), 491-508 (2012).
- Cassidy, A., et al. High anthocyanin intake is associated with a reduced risk of myocardial infarction in young and middle-aged women. Circulation. 127 (2), 188-196 (2013).
- Jacques, P. F., Cassidy, A., Rogers, G., Peterson, J. J., Dwyer, J. T. Dietary flavonoid intakes and CVD incidence in the Framingham Offspring Cohort. Br J Nutr. 114 (9), 1496-1503 (2015).
- Aghababaee, S. K., et al. Effects of blackberry (Morus nigra L.) consumption on serum concentration of lipoproteins, apo A-I, apo B, and high-sensitivity-C-reactive protein and blood pressure in dyslipidemic patients. J Res Med Sci. 20 (7), 684-691 (2015).
- Jeong, H. S., et al. Effects of Rubus occidentalis extract on blood pressure in patients with prehypertension: Randomized, double-blinded, placebo-controlled clinical trial. Nutrition. 32 (4), 461-467 (2016).
- Jia, H., et al. The antihypertensive effect of ethyl acetate extract from red raspberry fruit in hypertensive rats. Pharmacogn Mag. 7 (25), 19-24 (2011).
- Feresin, R. G., et al. Blackberry, raspberry and black raspberry polyphenol extracts attenuate angiotensin II-induced senescence in vascular smooth muscle cells. Food Funct. 7 (10), 4175-4187 (2016).
- Pergola, C., Rossi, A., Dugo, P., Cuzzocrea, S., Sautebin, L. Inhibition of nitric oxide biosynthesis by anthocyanin fraction of blackberry extract. Nitric Oxide. 15 (1), 30-39 (2006).
- Lu, H., Li, J., Zhang, D., Stoner, G. D., Huang, C. Molecular mechanisms involved in chemoprevention of black raspberry extracts: from transcription factors to their target genes. Nutr Cancer. 54 (1), 69-78 (2006).
- Kim, S., et al. Aqueous extract of unripe Rubus coreanus fruit attenuates atherosclerosis by improving blood lipid profile and inhibiting NF-κB activation via phase II gene expression. J Ethnopharmacol. 146 (2), 515-524 (2013).
- Wang, J., Mazza, G. Effects of anthocyanins and other phenolic compounds on the production of tumor necrosis factor alpha in LPS/IFN-gamma-activated RAW 264.7 macrophages. J Agric Food Chem. 50 (15), 4183-4189 (2002).
- Pascual-Teresa, S., Moreno, D. A., Garcia-Viguera, C. Flavanols and anthocyanins in cardiovascular health: a review of current evidence. Int J Mol Sci. 11 (4), 1679-1703 (2010).
- Kim, D. O., Lee, C. Y. Extraction and Isolation of Polyphenolics. Curr Protoc Food Analyt Chem. 1, John Wiley & Sons. New York. 2.1-2.12 (2002).
- Queires, L. C., et al. Polyphenols purified from the Brazilian aroeira plant (Schinus terebinthifolius, Raddi) induce apoptotic and autophagic cell death of DU145 cells. Anticancer Res. 26 (1A), 379-387 (2006).
- Griendling, K. K., Taubman, M. B., Akers, M., Mendlowitz, M., Alexander, R. W. Characterization of phosphatidylinositol-specific phospholipase C from cultured vascular smooth muscle cells. J Biol Chem. 266 (23), 15498-15504 (1991).
- Vuong, T., et al. Role of a polyphenol-enriched preparation on chemoprevention of mammary carcinoma through cancer stem cells and inflammatory pathways modulation. J Transl Med. 14, (2016).
