고해상도 이미징 및 개인 별이 미세 소관 역학의 분석 신진 효모에서
Summary
효모 신진 인해 강력한 유전학과 미세 소관 세포 골격의 단순함에 생체 내 미세 소관 역학 연구를위한 유리한 모델입니다. 다음 프로토콜 변환 및 문화 효모 세포, 공 초점 현미경 이미지를 수집하고, 정량적으로 효모 살아있는 세포에서 미세 소관 역학을 분석하는 방법에 대해 설명합니다.
Abstract
동적 미세 소관은 많은 세포 과정의 기초이며, 미세 소관 역학의 정확한 측정은 세포가 이러한 과정을 조절하는 방법에 대한 방법과 유전자 돌연변이에 미치는 영향 규정 통찰력을 제공 할 수 있습니다. 후생 동물 모델에서 미세 소관 역학의 정량화는 유전자 조작에 높은 미세 소관 밀도 및 제한 사항을 포함하여 관련 문제의 번호가 있습니다. 반면, 신진 효모 모델은 이러한 문제를 극복 이점을 제공한다. 이 프로토콜은 효모 살아있는 세포에서 단일 미세 소관의 역학을 측정하는 방법을 설명합니다. 형광 태그 튜 불린을 발현하는 세포는 안정한 저속 화상 획득을 가능하게 조립 슬라이드 챔버에 부착되어있다. 고속 대한 상세한 가이드의 4 차원 이미지 획득은 공 초점 화상 스택 동적 미세 소관의 속성을 정량화하는 프로토콜뿐만 아니라, 제공된다. 이 방법은, 종래의 효모 유전자와 결합 잠정량적 튜 불린 소단위의 활성을 변경하는 레귤레이터 미세 소관 또는 돌연변이의 영향을 평가하기위한 유일하게 적합한 접근법을 IDES.
Introduction
미세 소관은 αβ-tubulin의 단백질 서브 유니트로 이루어지는 골격 중합체이며, 세포 내 운반, 세포 분열, 형태 형성 및 세포 운동성 포함 콘텍스트의 다양한 사용된다. 언제 어디서 미세 소관 양식이 다양한 역할에 대한 미세 소관 네트워크를 구축하기 위해 세포는 신중하게 조절해야합니다. 이 규정은 무료 하부 단위로 미세 소관 폴리머 또는 분해 미세 소관에 αβ-tubulin의 서브 유닛을 조립하거나하는 반응을 제어하여 수행됩니다; 이것은 미세 소관 역학로 알려져 있습니다.
미세 소관 분야의 주요 목표는 튜 불린 및 / 또는 미세 소관에 결합하는 αβ-tubulin의 서브 유닛 및 외부 규제 기관의 연구를 포함하여 미세 소관 역학을 조절하는 분자 메커니즘을 규명하는 것입니다. 잘 확립 된 실험 방법은 COM 종종 정제 αβ-tubulin의 단백질을 사용하여 시험 관내에서 이러한 시스템을 재구성하는정제 된 외부 레귤레이터 환 경의. 이 유용한 방법이지만, 재구성 된 시스템의 미세 소관의 역 동성이 살아있는 세포에서 관찰 된 것과 크게 다른 것은 분명하다. 예를 들어, 미세 소관은 빠르게 성장하고 체외에 비해 생체 내에서 느리게 수축. 이러한 차이는 세포의 알려진 외부 조절기 (1)의 유용성뿐만 아니라, 아직까지 정의되지 않은 요인에 기인 할 수있다. 따라서 미세 소관 규제 및 네이티브 셀룰러 맥락에서 역 동성을 방해 돌연변이의 활동을 결정하는 것이 중요합니다.
후생 동물 모델은 미세 소관 기능과 고차원 조직을 조사하는 일반적인 시스템적일 수 있지만, 몇 가지 실제적인 문제는 심각하게 미세 소관 역학의 정확한 측정을 위해이 모델의 유틸리티를 제한 할 수 있습니다. 첫째, 셀 당 수천 수십 이르기까지 미세 소관의 높은 수는, 자신에 어렵게 만든다시간이 지남에 따라 개별 미세 소관을 추적 할 수 있습니다. 많은 연구는 선택적 같은 최종 결합 (EB) 계열의 단백질과 같은 미세 소관 단부에 지역화 단백질을 묘화함으로써이 문제를 다룬다. 그러나, 이러한 단백질은 후생 동물 2 미세 소관 성장의 끝을 지역화하는 것으로 알려져있다. 따라서, 이들 단백질의 효용은 간접적 재앙 주파수와 역학의 다른 측면을, 직접 측정하면서, 성장 속도를 측정하기 위해 제한된다. 둘째, 게놈 편집 기술의 발전에도 불구하고 안정적으로 형광 표지 튜 불린 또는 선택적으로 튜 불린 또는 미세 소관 규제를 조작하는 돌연변이를 도입을 발현하는 세포를 만드는 것이 중요한 과제로 남아. 또한, 후생 동물의 많은 튜 불린 아이소 타입의 존재는 돌연변이가 개별 튜 불린 유전자에 미치는 영향을 연구를 혼동.
신진 효모 시스템은 생체 microtubu에서 측정하기위한 몇 가지 중요한 이점을 제공르 역학. 효모는 개별 미세 소관의 시각화를 허용 간략화 미세 소관의 네트워크를 가지고있다. 효모에서 미세 소관은 핵 봉투 3에 포함 된 스핀들 극 기관 (SPB는)으로 알려진 센터를 조직에서 발산. SPB는 미세 소관은 4, 5 핵 γ-tubulin의 작은 착물에 대한 지지체로 작용한다. SPB는 미세 소관은, 스핀들 미세 소관과 별 미세 소관의 두 개의 클래스를 핵. 핵질로 스핀들 미세 소관 프로젝트 및 동원체의 미 세관을 통해 염색체에 부착 및 극간 소관 6 겹치는 스핀들 비아를 안정화시키는 것이 중요하다. 대조적으로, 미세 소관 별의 바깥 세포질 내로 돌출하고는 스핀들 미세 소관의 밀집 네트워크 비교적 드문 비교된다. 유사 분열하는 동안, 사전 anaphase (핵분열 말기) 세포는 SPB 중 하나에서 나오는 1-2 별 미세 소관이있다; 이 내가로 존재오히려 7 번들로보다 미세 소관 ndividual. 유사 분열 동안 별 미세 소관의 역할은 꽃 봉오리 목으로 알려진 어머니와 새싹 구획 사이의 접합에 핵 스핀들을 이동하는 것입니다. 이 운동으로 결국 꽃 봉오리 목 8로 핵 스핀들을 당겨 별 미세 소관에 힘을 생성하는 잘 정의 된 경로를 포함한다.
효모 시스템의 또 다른 장점은 비할 데없는 정밀 미세 소관 규제 및 튜 불린 서브 유닛을 조사하는 데 사용할 수있는 자사의 유전학의 유틸리티입니다. 단일 β-tubulin의 유전자 (TUB2)와 두 개의 α-tubulin의 유전자 (TUB1 및 TUB3) 효모는 또한 튜 불린 동형의 간략화 레퍼토리를 갖는다. 돌연변이 용이 유전자로 도입시켜 균질 튜 불린 인구 (9) (10)에 조사 될 수있다. 널리 여러 가지가 있습니다가능한 라벨 미세 소관에 대한 구조, 이들은 안정적인 표현 염색체 유전자좌에서 통합의 대상이 될 수있다 (토론 참조).
이 방법의 전반적인 목적은 미소 관 역학 고분해능 측정을위한 네 개의 차원 (X, Y, Z, 및 T) 효모 살아있는 세포에서 단일 이미지 소관이다. 효모 세포의 형광 표지 된 튜 불린의 구성 적, 낮은 수준의 발현 구성체의 통합을위한 방법들이 설명된다. 촬상 전에, 살아있는 세포는 장기 이미징 세포를 안정화 렉틴 콘 카나 발린 A의 코팅 된 슬라이드 챔버에 장착된다. 화상 취득을위한 최적의 파라미터뿐만 아니라, 데이터 분석을위한 플로도 기재되어있다.
Protocol
Representative Results
Discussion
신진 효모 모델은 시간이 지남에 이미지 하나의 미세 소관의 능력과 효모 유전학의 도구를 사용하여 tubulin의와 미세 소관 규제를 조작 할 수있는 기능을 포함하여, 생체 내 환경에서 미세 소관 역학의 고해상도 측정을 수집하기위한 주요 이점을 제공한다.
콘 카나 발린 A-코팅 챔버 용융 아가 패드를 포함하여 전술 한 장치들상에서 다수의 이점을 제공한다. 챔버와 슬?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 다양한 FP-TUB1 플라스미드를 공유 케리 블룸 (노스 캐롤라이나 대학), 켱 리 (NCI), 스티븐 마르쿠스 (콜로라도 주립 대학), 그리고 엘마 쉬에벨 (Universität 하이델베르크를) 감사합니다. 우리는 슬라이드 챔버의 제조 방법에서 우리를 훈련에 대한 멜리사 가드너 (미네소타 대학)에 감사하고 있습니다. 이 작품은 국립 보건원 (NIH) (JKM에) R01GM112893-01A1과 (CE에) T32GM008730을 부여에 의해 지원되었다.
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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