Imagens de alta resolução e Análise de individuais Astral microtúbulos Dynamics em brotamento Yeast

Summary

Budding levedura é um modelo vantajoso para o estudo da dinâmica dos microtúbulos in vivo, devido às suas poderosas da genética e a simplicidade do seu citoesqueleto de microtúbulos. O protocolo a seguir descreve como transformar e cultura de células de levedura, adquirir imagens de microscopia confocal, e quantitativamente analisar a dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva.

Abstract

microtúbulos dinâmicos são fundamentais para muitos processos celulares, e medições precisas de dinâmica dos microtúbulos pode fornecer insights sobre como as células regulam esses processos e como genética mutações regulação impacto. A quantificação da dinâmica dos microtúbulos em modelos metazoários tem um número de desafios associados, incluindo uma densidade elevada de microtúbulos e limitações em manipulações genéticas. Em contraste, o modelo de levedura de brotamento oferece vantagens que superam esses desafios. Este protocolo descreve um método para medir a dinâmica dos microtúbulos individuais em células de levedura viva. As células que expressam a tubulina fluorescente etiquetado são aderidas às câmaras de deslizamento montados, permitindo a aquisição de imagem em tempo desfasado estável. Um guia detalhado para a alta velocidade, a aquisição de imagem de quatro dimensões também é fornecido, assim como um protocolo para quantificar as propriedades dinâmicas de microtúbulos em pilhas de imagens confocais. Este método, em combinação com levedura genética convencionais, provIdes uma abordagem que é singularmente adequado para quantitativamente avaliar os efeitos reguladores de microtúbulos ou mutações que alteram a actividade de subunidades de tubulina.

Introduction

Os microtúbulos são polímeros feitos do citoesqueleto de subunidades de proteína αβ-tubulina e são utilizados numa grande variedade de contextos celulares, incluindo o transporte intracelular, a divisão celular, a morfogénese e a motilidade. Para construir redes de microtúbulos para essas funções diversas, as células devem cuidadosamente regulam onde e quando forma microtúbulos. Esta regulação é conseguida por controlo das reacções que quer montar subunidades αβ-tubulina em microtúbulos ou polímeros microtúbulos desmontar em subunidades livres; isso é conhecido como dinâmica dos microtúbulos.

Um objectivo principal do campo de microtúbulos é elucidar os mecanismos moleculares que regulam a dinâmica dos microtúbulos, incluindo estudos das subunidades αβ-tubulina e reguladores extrínsecos que se ligam a tubulina e / ou aos microtulos. Uma abordagem experimental bem estabelecido é a reconstituir este sistema in vitro utilizando a proteína αβ-tubulina purificada, muitas vezes em COMbinação com reguladores extrínsecos purificadas. Embora esta seja uma abordagem útil, é claro que a dinâmica dos microtúbulos em sistemas reconstituídos difere fortemente da observada em células vivas. Por exemplo, os microtúbulos crescem mais rapidamente e encolher mais lenta in vivo que in vitro. Estas diferenças podem ser atribuídas à disponibilidade de reguladores extrínsecos conhecidos ^1, bem como a factores ainda indefinido em células. Portanto, é crítico para determinar as actividades dos reguladores de microtúbulos e mutantes que perturbam dinâmica num contexto celular nativo.

Embora os modelos metazoários provaram ser os sistemas vigentes para investigar a função dos microtúbulos e organização de ordem superior, várias preocupações práticas limitar severamente a utilidade destes modelos para a medição precisa da dinâmica dos microtúbulos. Primeiro, o elevado número de microtúbulos, variando de dezenas de milhares por célula, torna difícil a confiançarastrear microtúbulos individuais ao longo do tempo. Muitos estudos de responder a este desafio por imagiologia de proteínas que se localizam selectivamente para as extremidades dos microtúbulos, tais como as proteínas da família de ligao final (EB). No entanto, estas proteínas são conhecidos para localizar apenas às extremidades de crescimento de microtúbulos em metazoários ^2. Portanto, a utilidade destas proteínas é limitado para medir directamente as taxas de crescimento, ao passo que apenas indirectamente medindo outros aspectos da dinâmica, tal como a frequência de catástrofe. Em segundo lugar, apesar dos avanços na tecnologia de edição genoma, a criação de células que expressam de forma estável tubulina marcado por fluorescência ou a introdução de mutações de manipular selectivamente tubulina ou reguladores de microtúbulos permanece um desafio significativo. Além disso, a presença de diversos isotipos de tubulina em metazoários confunde o estudo de como os genes da tubulina mutações impacto individuais.

O sistema de levedura de germinação oferece várias vantagens importantes para a medição em microtubu vivole dinâmica. Levedura tem uma rede de microtúbulos simplificada que permite a visualização de microtúbulos individuais. Em levedura, os microtúbulos emanam de organizar centros conhecidos como fusos corpos pólo (SPBs), que são incorporados no envelope nuclear ^3. Os SPBs servir como suportes para pequenos complexos y-tubulina que nucleada microtúbulos ^{4, 5.} SPBs núcleos duas classes de microtúbulos, os microtúbulos do fuso e microtúbulos astrais. Projecto microtúbulos do fuso para o nucleoplasma e são importantes para a fixação de cromossomas através de microtúbulos cinetocoro e para a estabilização do fuso através de sobreposição de microtúbulos interpolares ^6. Em contraste, os microtúbulos astrais projecto para o exterior para o citosol e são relativamente raros em comparação com a densa rede de microtúbulos de fuso. Durante a mitose, as células pré-anafase têm apenas 1-2 microtúbulos astrais que emanam a partir de qualquer SPB; estes existir como imicrotúbulos ndividual e não como feixes ^7. O papel de microtúbulos astrais durante a mitose é mover o núcleo e o eixo em junção entre a mãe e bud compartimentos, conhecidos como o pescoço broto. Este movimento envolve vias bem definidas que geram força sobre microtúbulos astrais, que puxam o núcleo e para a fuso e, eventualmente, para o botão ⁸ pescoço.

Outra vantagem do sistema de levedura é a utilidade da sua genética, que podem ser utilizados para investigar os reguladores de microtúbulos e subunidades de tubulina com precisão sem paralelo. A levedura também possuir um repertório simplificado de isotipos de tubulina: um único β-tubulina gene (TUB2) e dois genes alfa-tubulina (TUB1 e tub3). As mutações podem ser facilmente introduzidos nestes genes e, assim, estudado em uma população de tubulina homogénea ^{9, 10.} Há uma série de amplamenteconstrues disponíveis para microtúbulos de rotulagem, e estes podem ser alvo para a integração cromossómica em loci para a expressão estável (ver a discussão).

O objectivo global do presente método é a imagem individuais microtúbulos em células de levedura vivendo em quatro dimensões (X, Y, Z, e t) para medições de alta resolução de dinâmica dos microtúbulos. Os métodos para a integração de construções para a expressão constitutiva de baixo nível de tubulina marcado com fluorescência em células de levedura são descritos. Antes da imagiologia, as células vivas são montados em câmaras inclinadas revestidos com a lectina Concanavalina A para estabilizar as células para imagiologia de longo prazo. Os parâmetros óptimos para a aquisição de imagem, bem como um fluxo de trabalho para a análise de dados, também são descritos.

Protocol

1. Preparar placas Leu Dropout

1. Adicionar 800 mL de água estéril, desionizada (DIH ₂ O) para um balão de 2 L. Adicionar 26,71 g de base de desistência (DOB) em pó, 0,69 g de CSM-Leu, e 20 g de ágar. Misture com uma barra de agitação magnética. Traga a 1 L com DIH ₂ O.
2. Autoclave a 121 ° C e 19 psi durante 30 min.
3. Retirar o frasco da autoclave e deixá-lo arrefecer a ~ 65 ° C com agitação suave.
4. Pour 30 mL / placa em placas de 100 mm de diâmetro. Deixe estes sentar à temperatura ambiente durante 36-48 h antes do armazenamento a 4 ° C.

2. Integrar GFP-Tub1 para a expressão constitutiva de Tubulin marcadas com GFP

1. Ferver uma concentração de estoque de 10 mg / mL de ADN de cadeia simples (ADNcs) durante 3 min.
2. Reúne-se 2 mL de ssDNA fervido com 400 ng de purificado GFP-Tub1 plasmídeo de ADN ^11.
   NOTA: Há uma variedade de plasmídeos que podem ser utilizados para a rotulagem estável, fluorescentede microtúbulos em leveduras que utilizam fluoróforos alternativas e marcadores selecionáveis. Algumas dessas alternativas são descritos na seção Discussão.
3. Adicionar a mistura de ADN a uma aliquota de 50 ul de células de levedura competentes.
   NOTA: Preparar células de levedura competentes com solução de sorbitol (SORB; LiOAc 100 mM, 10 mM Tris-HCl pH 8, EDTA 1 mM, pH 8, e sorbitol 1 M, ajustado com ácido acético diluído até pH 8). Para uma descrição detalhada de fazer células de levedura competentes, ver a referência ^12.
4. Vortex completamente.
5. Adicionar 6x o volume total de polietileno glicol (PEG) solução (LiOAc 100 mM, Tris-HCl 10 mM pH 8, EDTA 1 mM / NaOH a pH 8, e 40% PEG3350) para a mistura de células-ADN.
6. Vortex completamente.
7. Incuba-se durante pelo menos 1 h a 30 ° C com agitação suave.
8. Adicionar dimetilsulfóxido (DMSO) a 10% do volume total e vortex.
9. Incubar a 42 ° C durante 15 min.
10. Centrifugar a 2.500 xg durante 5 min.
2 O.
11. células da placa sobre uma placa -Leu abandono.
    NOTA: A construo GFP-Tub1 contém um marcador auxotrófico leucina, enquanto que outras construes podem utilizar um marcador alternativo. O meio de abandono deve ser específico para o marcador auxotrico da construo.
12. Permitir que as células transformadas crescer durante 3-5 dias a 30 ° C.
13. Re-sequência de colónias de transformação individuais sobre uma placa -Leu abandono fresco por transferência de colónias utilizando um palito esterilizado. Incubar a placa durante a noite a 30 ° C.
14. Rastrear visualmente cada transformante para um sinal de GFP por suspensão de aproximadamente 1 mL de células a partir de uma única colónia da placa no passo 2 em 2,14 mL de água sobre uma lâmina limpa. Cubra as células em suspensão com uma lamela e observa por microscopia de fluorescência.
    1. Excitar os transformantes com 488 nm de luz e procure a presença de um sinal de GFP.
       

3. Crescer Cultura de levedura Líquido

1. Inocular ~ 1 mL de células de levedura a partir de uma colónia individual sobre uma placa em 3 mL de meio completo sintético. Permitir que as células a crescer durante a noite a 30 ° C com agitação a 250 rpm.
2. Dilui-se a cultura saturada de no dia seguinte a uma OD ₆₀₀ de <0,1 no meio. Voltar a cultura diluída para o C agitador 30 ° durante 3-4 horas ou até que a OD ₆₀₀ é entre 0,4 e 0,8, quando as células estão prontas para ser carregado para dentro das câmaras para imagiologia.

4. Preparar Fluxo Câmara Slides

1. Cortaruma folha de película de parafina em uma peça 4 na largura e 7 em comprimento.
2. Coloque uma lâmina de microscópio padrão longitudinalmente na largura de 4 polegadas de filme de parafina e envolver a película em torno da corrediça 3-4 vezes de modo a que a lâmina está coberta na película que é de 3-4 camadas de espessura. Pressionar as camadas em conjunto para garantir que há uma vedação razoável; isto irá tornar mais fácil de cortar. Evite pressionar demasiado duro ou fazendo com que o filme para rugas.
3. Cortar o filme de parafina ao longo das bordas exteriores da lâmina utilizando um aparelho de barbear caixa cortador limpo. Use outra lâmina para fornecer uma vara para o corte.
4. Descasque o excesso de película fora do slide trabalho e descarte. Os restantes pilhas de películas irá cobrir uma face da corrediça e irá ser utilizado para fazer as paredes entre as câmaras de imagem.
5. Usando a segunda corrediça como uma régua, cortar as camadas de filme empilhadas ao longo do eixo da corrediça em aproximadamente dez tiras, cada 2-4 mm de largura.
6. Corte as camadas de película de parafina empilhadas perpendicularmenteos cortes feitos no passo 4.5, ao longo do eixo menor da corrediça, para criar tiras de 2-4 mm de largura, 23-24 mm de comprimento, e 3-4 camadas espessas.
7. Descascar as tiras cortadas usando uma lâmina com um ângulo de 45 °. Usando fórceps, distribuir uniformemente as tiras de película recortada numa lâmina de microscópio limpa para criar os números pretendidos de câmaras. Até 3 câmaras (feitas com 4 tiras de película de parafina) pode ser criado sobre uma corrediça.
8. Colocar uma única lamela em cima das tiras de filme e movê-lo para a posição com uma pinça.
9. Colocar a lâmina preparada, lamela para cima, sobre uma placa de aquecimento configurado a ~ 95 ° C (isto é, aproximadamente, a configuração de baixa-média na maioria das placas de cozedura). Aquece-se a corrediça até que as tiras de película são translúcidas (aproximadamente 3 minutos) e em seguida selar a lâmina e lamela em conjunto, pressionando cuidadosamente sobre a lamela com a pinça.
   NOTA: É importante apenas para imprensa sobre as regiões da lamela que estão diretamente acima das tiras de filme de parafina, como coçar as regiões acima do cHambers pode diminuir a qualidade da imagem. Tome cuidado para não superaquecer o slide; vaporizado revestimento vontade filme no interior da câmara com uma película hidrófoba que impede as células de aderir.
10. Use uma pinça para remover o slide da placa (o slide vai estar quente) e configurá-lo de lado para esfriar com o lado da lamela virada para cima; como o slide esfria, o filme vai voltar a uma coloração branca, opaca.
    NOTA: Neste ponto, as lâminas estão prontas para serem carregadas com culas de levedura em cultura. lâminas extras podem ser feitas a este ponto e armazenados em um local limpo e seco por um período indefinido de tempo.

5. As células fúngicas Carregando em slides câmara de fluxo Preparado

1. Descongelar uma congelado, 200 ul ali quota de Concanavalina A (2 mg / mL em estéril DIH ₂ O).
2. Adicionou-se aproximadamente 100 ul de descongelado Concanavalina à cada uma das câmaras da lâmina preparada pipetando para uma das extremidades abertas. Adicionar o suficiente Concanavalina A para encher a câmara. Para este step, a Concanavalina A irá ser puxada através da câmara através da acção capilar.
3. Pendurar a corrediça, lamela para baixo, entre dois suportes de tubos de microcentruga ou canetas durante 5 min para permitir que a Concanavalina à aderir à lamela (isto é, a câmara).
4. Devolver o slide para uma posição lamela-up. Lavou-se a câmara com 2x o volume da câmara (determinado no passo 5.2, acima; cerca de 200 uL) de meio completo sintético para remover a Concanavalina A.
   1. Fluir o meio através da câmara, usando o canto de uma toalha de papel ou um papel de filtro dobrado ao meio para extrair fluido para fora de uma extremidade da câmara enquanto, simultaneamente, pipetando fluido fresco para o outro. Em alternativa, usar um aspirador a vácuo para desenhar cuidadosamente o líquido para fora de uma extremidade, enquanto pipetando fluido fresco para o outro.
5. As células de carga por fluindo 2x o volume da câmara (cerca de 200 mL) de suspensão de células (do passo 3.4), utilizando o meto fluxo dirigidod descrito no passo 5.4.1.
   NOTA: O objectivo é a imagem de uma camada única de células na lamela. Portanto, é importante carregar uma concentração de células pequenas o suficiente para que eles não se acumulam em cima de um outro, mas grandes o suficiente para que as células suficientes estão presentes no campo para recolher a quantidade máxima de dados por aquisição de imagem. A concentração óptima de células no interior da câmara pode variar e deve ser determinada empiricamente. Para aumentar a concentração de células na câmara de fluxo, suavemente sedimentar a cultura celular a 1000 xg durante 2 min e remover algum do sobrenadante. Para diminuir a concentração de células, adicionar meio completo sintético fresca para a suspensão de células. A concentração de células pode ser avaliada após a etapa 5.7 (abaixo) através do controlo da câmara sobre um microscópio de contraste de fase. Neste ponto, as células adicionais podem ser adicionados à câmara de fluxo em mais suspensão de células. No entanto, reduzir a densidade de células neste ponto não é viável e é melhor alcançadaatravés do carregamento de uma nova câmara com uma suspensão diluída de células.
6. Pendurar a corrediça lamela para baixo, tal como descrito na etapa 5.3, durante 10 min para permitir que as células a aderir à lamela.
7. Expulsar as células não aderidas por fluindo através 4x o volume da câmara (cerca de 400 uL) de meio completo sintético. Isto irá eliminar as células que flutuam livremente na câmara, que podem contaminar a aquisição da imagem.
8. Secar cuidadosamente cada extremidade da câmara, com um canto limpo de uma toalha de papel, trazendo o menisco para a extremidade da lamela.
9. Selar cada extremidade da câmara com água morna (75 ° C) vedante (por exemplo, valap; partes iguais vaselina, cera de lã e cera de parafina).
   NOTA: Neste ponto, o slide está pronto para a imagem. As câmaras podem ser visualizados para um máximo de 9 h, dependendo da densidade de células em cada câmara. As células produzirá dióxido de carbono (CO ₂₎ ao longo do tempo, que vai gradualmente criar bolhas que deslocam as células.

1. Traga o slide para um microscópio invertido equipado com uma NA 100X CFI Plano de Apo objetivo 1,45, um estágio piezoelétrico, um scanner confocal disco giratório, um laser de iluminação, e uma câmera EMCCD. Manter a temperatura da fase a temperatura ambiente (25 ° C) durante a aquisição.
   NOTA: A abertura numérica elevada permite uma maior resolução da imagem, e a fase piezoeltrico permite alta velocidade de aquisição z-pilha. Os requisitos mínimos do microscópio são o objetivo 100X, o laser de iluminação, ea câmera EMCCD.
2. Traga as células em foco. Certifique-se de que o campo aquisição tem pelo menos 5-6 células agrupadas por pesquisar o slide para as células agrupadas.
   NOTA: Embora não seja necessário para a imagem mais de uma célula de cada vez, de imagem várias células no mesmo campo melhora a eficiência de aquisição de dados, sem prejudicar a qualidade dos dados. No entanto, é fundamental que océlulas estão no mesmo plano focal e não empilhadas no topo uma da outra.
3. Programar uma aquisição multi-dimensional para coletar múltipla z-series ao longo do tempo.
   1. Ajustar as configurações dentro das definições de aquisição activas para o seguinte: total de profundidade Z = 6? M, para abranger toda a célula de levedura; Z-passo tamanho = 300 nm, para maximizar a recolha de luz, sem sobreamostragem; duração tempo total = 10 min; intervalos de tempo = Z-série a cada 4 s; e tempo de exposição = 90 ms para cada plano z.
      NOTA: O tempo de exposição ideal irá variar dependendo da câmera, a fonte de luz de excitação, e outros fatores. Em geral, o tempo de exposição óptimo será o tempo mínimo necessário para conseguir uma proporção de 3: 1 de sinal de microtúbulos astrais marcado com GFP para sinalizar a partir do citoplasma com base em valores de pixel medidos pelo EMCCD.
4. Comece a aquisição, clicando em 'Run'. Permitir que seja executado para a duração de 10 min completo. Salve os dados como uma imagemsérie (.Tiff ou .nd2).
5. Selecione um novo campo para a imagem dentro da câmara e repita os passos 6,2-6,4.
   NOTA: Uma única câmara deverá produzir entre 15 e 20 campos de células, dependendo da densidade celular no interior da câmara. Densidades celulares mais elevadas proporcionam uma redução de campos totais, como o CO ₂ na câmara irá acumular-se mais rápido.

Análise 7. Imagem

1. Abra o arquivo de imagem em ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) como um hyperstack usando o bio-formatos importador plugin.
   1. Abrir ImageJ e arrastar a pilha de imagem adquiridos a partir da secção 6 directamente sobre o painel de controlo. O importador bio-formatos será iniciado automaticamente. Selecione "Ok" para carregar a pilha de imagem como um hyperstack.
      NOTA: Os "Bio-formatos opções de importação" prompt será aberto e garantir que sob o "Stack Visualizando" seção, "Ver pilha com:" é definido como "hyperstack"; e "Pilha Ordem:" é definido como "XYCZT."
2. Recolher cada Z-série, até um máximo de intensidade, de projecção 2-dimensional utilizando a função Z-projecto.
   1. Selecione o menu "Imagem", o submenu "pilha", e o recurso "-projeto Z". Selecione "projeção máxima" na lista drop-down e clique em "Ok".
3. Aplicar um filtro mediana para a pilha de imagem para reduzir o ruído speckling selecionando o menu "Processo", o "Filtros" submenu, eo recurso de "mediano". Digite 2,0 pixels na caixa de raio e clique em "Ok".
4. Identificar células pré-anafase no campo.
   NOTA: Estes são caracterizados por botões de tamanho médio e um curto fuso mitótico, 1-1,5? M de comprimento (Figura 1; A seta aponta para um curto fuso mitótico). Células nesta fase são ideais para a análise dinâmica dos microtúbulos, porque eles normalmente exibem apenas uma femicrotúbulos astrais w que emanam dos pólos do fuso ^7. microtúbulos astrais pode ser identificado como filamentos lineares que apresentam uma intensidade de sinal de GFP uniforme a partir da extremidade menos, no SPB, para a extremidade mais, no citoplasma.
5. Começando no primeiro ponto temporal da série de imagens, utilizar a ferramenta de linha segmentada para desenhar uma linha ao longo de uma única microtúbulos astrais, a partir da extremidade menos, localizado na junção entre a microtúbulos astrais e os microtúbulos do fuso mais intensamente marcadas, para a extremidade mais , que é no citoplasma (ver as linhas vermelhas na Figura 1). Clique duas vezes sobre o fim do microtúbulos para completar a linha segmentada.
6. Grave a medição na tabela de resultados usando o recurso de "medida", premindo o botão "M" no teclado.
   NOTA: As características adicionais, tais como intensidade de cinza, podem ser gravados, definindo as medições no menu "Analisar" e "Definir Medidas" submenu.
7. Avançar para o próximo ponto no tempo clicando na seta da direita na barra Z-deslizante ou pressionando a tecla "./>" no teclado. Repita os passos 7.5 e 7.6 para todos os pontos no tempo na sequência de imagens.
8. Copiar os dados da tabela de resultados e colá-los em uma planilha. Salve os dados, selecionando "Salvar como".
   NOTA: Estas medições irão incluir vários valores, mas os valores mais importantes são a fatia, o qual indica o instante de tempo em série, e o comprimento, o que indica o comprimento da linha (isto é, a microtúbulos astrais). Colunas contendo outras medições (por exemplo, a área, significa valor de pixel, ângulo, etc.) pode ser mantido ou eliminado.
9. Criar uma nova coluna na planilha clicando com o botão direito e usando a função "Inserir". Introduza o tempo (s) de cada ponto no tempo.
10. Criar uma trama de dispersão XY de comprimento de microtúbulos (um) como uma função do tempo (s) usando o "Linha InserirGráfico" característica; seleccionar as medições de comprimento como 'Y' e o tempo de coluna como 'X'
    1. Identificar regiões de polimerização, despolimerização, e pausa, procurando alterações positivas e negativas em comprimento ao longo do tempo do gráfico de dispersão a partir do passo 7.10.
       NOTA: os eventos de polimerização de microtúbulos por aumentar o comprimento de pelo menos 0,5 m entre um mínimo de 3 pontos de tempo e ajustar uma regressão linear com um R ² ≥ 0,9 e um valor-R> 0 (Figura 1B e D, pontos verdes). Eventos de despolimerização de microtúbulos diminuir o seu comprimento por, pelo menos, 0,5 fim através de um mínimo de 3 pontos de tempo e ajustar uma regressão linear com um R ² ≥ 0,9 e um valor de R <0 (Figura 1B e D, pontos cor de rosa). eventos de pausa são separados de polimerização e despolimerização. As pausas são definidas como variações líquidas de comprimento microtúbulos menos do que 0,5 micron entre um mínimo de 3 pontos temporais;encaixar uma regressão linear com um valor de R entre -0,4 e 0,4; e tem uma inclinação que não é estatisticamente diferente de zero, tal como determinado por um teste de F.
    2. Usando o gráfico de dispersão como um guia, identificar as seções do momento em que a mudança de comprimento é positivo e destacá-los em uma cor verde. Destaque regiões do momento em que a mudança de comprimento é negativo em uma cor-de-rosa.
    3. Calcular a regressão linear de cada secção em destaque e gravar o -valor R- e ^R2 para cada secção nas colunas proximal para as regiões. Classificar cada região colorida como seja um evento de polimerização ou um evento de despolimerização.
11. Calcular as taxas de polimerização dividindo a alteração líquida no comprimento pela mudança no tempo para cada evento de crescimento. Grave estes resultados na coluna adjacente aos valores de regressão linear a partir do passo 7.10.3.
12. Calcular as taxas de despolimerização dividindo a mudança líquida de comprimento pela mudança no tempo para cada shrinking evento. Grave estes resultados na coluna adjacente para os valores da taxa de polimerização a partir do passo 7.11.
13. Calcular a frequência de catástrofe através da divisão do número de transições de polimerização-despolimerização-a pelo tempo total de todos os eventos de crescimento ^13. Grave estes resultados na coluna adjacente para os valores da taxa de despolimerização do passo 7.12.
14. Calcular a frequência de resgate pela divisão do número de transições despolimerização-a-polimerização pelo tempo total de todos os eventos de contração ^13. Grave estes resultados na coluna adjacente aos valores de frequência a partir do passo catástrofe 7,13.
15. Calcular o dynamicity dividindo a soma do valor absoluto de todas as alterações de comprimento pela duração total da aquisição de imagem, calculada no passo 7.10.1, e multiplicando por 27,0833 para obter subunidades de tubulina ¹⁴ por segundo. Grave estes resultados na coluna adjacente à val frequência salvamentoues do passo 7,14 e salvar a tabela de resultados.
    NOTA: É possível automatizar o processo de análise descrito nos passos 7,10-7,15 usando um programa feito por encomenda (. Estrem, et al, manuscrito submetido). O programa foi concebido para identificar os períodos de polimerização e despolimerização nas medições de comprimento, seguindo os parâmetros descritos acima.

Representative Results

Medição dinâmica dos microtúbulos em células de levedura viva fornece uma ferramenta atraente para avaliar a forma como as mutações em genes que codificam para reguladores de microtúbulos tubulina ou subunidades de polimerização impacto e taxas de despolimerização, bem como a frequência de transição entre estes estados. A Figura 1 apresenta uma série de tempo da dinâmica dos microtúbulos astrais em uma célula de tipo selvagem e um mutante de células com uma mutação no β-tubulina (tub2- 430Δ). Os microtúbulos são marcadas com GFP α-tubulina para visualizar comprimento dos microtúbulos. As setas vermelhas rastrear o comprimento do microtúbulos astrais em cada imagem (Figura 1A e 1 C). Comprimentos de microtúbulos foram medidos em cada ponto de tempo durante 8 min, e estes comprimentos compilados estão representados nas parcelas de vida (Figura 1B e 1 D). Estes dados foram utilizados para determinar a taxa de polimerização, a taxa de despolimerização, durati polimerizaçãoem, duração despolimerização, frequência de resgate, frequência catástrofe, e dinamicidade.

Figura 1. Imagiologia Lapso de tempo de microtúbulos e Medições de microtúbulos astrais Dynamics marcado com GFP. (A e C) Os primeiros cinco imagens sequenciais de imagiologia por intervalo de tempo para o tipo selvagem e tub2 -430Δ células mutantes. Os microtúbulos são marcadas com GFP-Tub1 e fotografada em pré-anafase do ciclo celular. Cada imagem é uma projecção de intensidade máxima a partir de uma série Z confocal. Barras de escala: 1? M. Marcas de tempo mostra o tempo total a cada aquisição de quadro. As setas vermelhas siga ao longo do comprimento total de uma microtúbulos astrais, com as pontas de setas indicando as extremidades mais. (B e D) parcelas vida microtúbulos exibir os comprimentos de microtúbulos astrais individuais ao longo do tempo. O ponto verdes representar polimerização e os pontos cor de rosa denotar despolimerização. As setas apontam para eventos catastróficos. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

A Figura 1 demonstra dinâmica dos microtúbulos alterados entre uma estirpe de tipo selvagem e uma estirpe mutante a que falta os 27 aminoácidos de β-tubulina no C-terminal, uma mutante que foi mostrado anteriormente para ter microtúbulos mais estáveis ^15. Como apresentado nos gráficos da vida dos microtúbulos, a microtúbulos no mutante tub2 -430Δ é mais longo e exibe menos catástrofes do que o de tipo selvagem de microtúbulos (setas Figura 1B e D; Tabela 1). Além disso, as velocidades de polimerização e despolimerização, determinada a partir das encostas do ascendente e descendente Leng microtúbulosths, são diminuídos no mutante em comparação com a de tipo selvagem (Figura 1B e 1D; Tabela 1). Finalmente, a microtúbulos na célula mutante tub2 -430Δ gasta mais tempo em estados de polimerização e despolimerização e diminuiu dynamicity em comparação com a de tipo selvagem (Tabela 1).

Tensão	Dynamicity (subunidades / s)	Taxa de polimerização (? M / min)	% Tempo em Polimerização	Taxa Depolym (? M / min)	% Tempo em Depoly- merization	% Tempo em Pausa	Frequência de salvamento (eventos / min)	Frequência de catástrofe (eventos / min)
De tipo selvagem, n = 1	54	1,8 ± 0,5	48	3,0 ± 0,3	29	3	1.8	1,4
tub2-430Δ n = 1	40	1,4 ± 0,1	41	1,5 ± 0,2	32	0	0,8	0,7
As abreviaturas são como se segue:? M, mícron; min, minutos; s, segundo; N, microtúbulos único analisados ​​a partir de trama vida de microtúbulos (Fig1B, D). Os valores são ± erro padrão da média da média.

Tabela 1: Medições de microtúbulos Dynamics para células na Figura 1. Os valores são a média ± erro padrão da média a partir de medições dos microtúbulos individuais mostrados na Figura 1.

Discussion

O modelo de levedura de germinação oferece grandes vantagens para a recolha de medições de alta resolução de dinâmica dos microtúbulos num cenário in vivo, incluindo a capacidade de imagem microtúbulos individuais ao longo do tempo e a capacidade de manipular tubulinas e reguladores de microtúbulos, utilizando as ferramentas de genética de leveduras.

As câmaras de Concanavalina A-revestimento proporciona um número de vantagens sobre os dispositivos anteriormente descritos, incluindo pastilhas de agar fundido. Slides com câmaras podem ser pré-fabricados e armazenados a longo prazo ou pode ser usado imediatamente. Além disso, as câmaras de Concanavalina A-revestidos são capazes de cultura de células de levedura para> 6 h, no mesmo meio em que as células foram inicialmente cultivadas. É importante notar que o número de células no interior da câmara vai ditar quanto tempo a câmara pode ser trabalhada. As câmaras revestidos assegurar que apenas uma única camada de células de levedura adere à lamela. Finalmente, a criação de várias câmaras permitevárias estirpes de leveduras diferentes para ser trabalhada na mesma lâmina.

Existem grandes desafios à imagem dinâmica dos microtúbulos em brotamento leveduras, incluindo níveis relativamente baixos de sinal e a natureza altamente dinâmica do processo. microscópios widefield são adequados para a captura de imagens em ponto no tempo único de microtúbulos rotulados. No entanto, microscopia widefield provoca mais rápido fotodegradação devido aos tempos de exposição mais longos e o bombardeio da amostra com luz fora de foco. Da mesma forma, de varredura a laser microscopia confocal são inadequadas devido ao rápido fotodegradação. Spinning disco microscopia confocal é especialmente adequado para geração de imagens dinâmica dos microtúbulos em brotamento levedura. O sistema de microscópio confocal disco giratório usado aqui foi projetado com esses requisitos em mente.

O sistema de microscópio deve ser projetado para alta velocidade e alta sensibilidade. Embora uma variedade de sistemas de microscopia pode ser adequado, vários componentes são essenciais. A 100Xé necessário objectivo com uma elevada abertura numérica (1.45NA) para resolver os microtúbulos individuais e alterações de comprimento da ordem de 100 nm. Um scanner de fiação disco confocal é necessário para minimizar a fotodegradação e a toxicidade, por bloqueio de luz para fora de foco, e para maximizar a resolução e sensibilidade, através da recolha de luz só em foco. A câmera EMCCD deve ser rápido e sensível para coletar o suficiente sinal de GFP-Tub1 durante cada 90 ms da aquisição de lapso de tempo. Atualmente, as câmeras EMCCD são a melhor escolha para esta aplicação. câmaras de corrente do sensor CMOS falta a sensibilidade de EMCCDs high-end; no entanto, esta tecnologia está melhorando significativamente e em breve poderá ser adequado. Finalmente, uma fase piezoeléctrico é necessária para o movimento rápido e preciso em Z, o qual pode ser o passo limitante da velocidade na aquisição de imagem de quatro dimensões.

O sistema de microscópio específico descrito no presente protocolo podem representar um obstáculo se equipamento semelhante não está prontamente disponível. alterações cum ser feitas para acomodar sistemas de imagem diferentes, mas estas modificações podem vir à custa da resolução temporal e / ou espacial. Um motor etapa impulsionado-eixo pode ser utilizado em lugar da fase piezoeléctrico. No entanto, estes motores são mais lentos, menos preciso, e propensas à deriva. Pós-aquisição plug-ins-de estabilização de imagem podem ser usadas para minimizar o desvio nas dimensões XY associados com estas fases accionados por motor. Além disso, pode ser utilizado câmeras alternadas com as velocidades mais lentas de leitura. Para acomodar uma taxa de aquisição mais lento, Z-série pode ser recolhido com menos frequência (isto é, mais tempo de entre Z-série). No entanto, aumentar o tempo entre Z-series arrisca a perder transições que podem ocorrer entre momentos. Em alternativa, a distância entre Z-planos pode ser aumentado como um meio de diminuir o número de imagens recolhidas por Z-série. No entanto, aumentar este espaçamento arrisca perder informação de imagem entre planos, o que irá prejudicar a capacidade do experimentador accuridentificar diatamente extremidades dos microtúbulos. Claramente, as alterações podem ser feitas para acomodar sistemas de imagem alternativas, mas essas alterações deve ser pesado contra a perda potencial de informação da imagem.

Uma outra limitação do presente protocolo é a perda de informação espacial quando tridimensionais pilhas de imagens são convertidas em projecções imagem bidimensional. Um microtúbulos astrais indivíduo em uma célula de levedura pré-anafase é tipicamente entre 0,5 e 2,0 m de comprimento e projectos através do espaço tridimensional do citoplasma. É, portanto, crucial para a aquisição de imagens a partir de uma série de posições de Z-a recolher toda a informação espacial de um indivíduo de microtúbulos. Em uma aquisição de lapso de tempo, este pode produzir um conjunto de dados complexos, com 20 Z-fatias em cada um dos intervalos de tempo 150, para um total de 3.000 imagens. Para enfrentar esse desafio e para simplificar a análise de imagem, a informação espacial dos Z-stacks é comprimido durante a análise. Embora este benefsua análise, ele vem com o custo de informação espacial do Z-dimensão. Quanta informação é perdida quando o Z-dimensão é comprimido? Para estimar esta perda, experiências foram realizadas para medir a distância entre SPBs em células pré-anafase, que são relativamente fáceis de medir pois Spc110-marcado com GFP SPBs apresentam focos esférica com rácios elevados de sinal-para-ruído. Embora o eixo de deslocamento podem apresentar diferente em Z de microtúbulos astrais, a duração média é similar (~ 1,5 uM) e, portanto, fornece uma indicação útil. comprimentos do eixo são, em média, 15% mais tempo, quando medido em pilhas de imagens completas tridimensionais do que quando os mesmos eixos são medidos em projecções bidimensionais (JM, resultados não publicados). Assim, a vantagem dos dados simplificados referidos e as medições devem ser ponderados em função do custo de informação Z descartado.

A comunidade de biologia celular de levedura desenvolveu um conjunto de ferramentas versáteis para networ microtúbulos imagingks. Isto inclui uma variedade de proteínas fluorescentes fundidos a a-tubulina / Tub1 e marcadas com vários marcadores auxotróf icos. Estas construções incluem LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) ^11, o qual integra no LEU2 locus cromossómico, e várias fusões com GFP e outros fluororos, que se integram no locus URA3, incluindo URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) ^16, URA3 :: PCP-TUB1 (pAFS125-PCP), e URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) ^17. Além disso, um conjunto de fusões Tub1 para diversas proteínas fluorescentes foi criado recentemente que a integração alvo quer ao locus cromossómico URA3 ou a um local adjacente ao locus TUB1 nativo ^18. Esta vasta paleta de fluororos e marcadores é muito útil para experiências de co-localização com proteínas diferencialmente marcadas. A fusão GFP-Tub1 continua a ser a melhor ferramenta para a imagem time-lapse de microtudinâmica bule devido ao seu brilho e fotoestabilidade. A fusão GFP-Tub1 criado por Song & Lee (pSK1050) ¹¹ contém uma fusão de GFP para o terminal amino de α-tubulina / Tub1 e integra-se no locus LEU2 para resgatar leucina auxotrofia. Assim, a proteína de fusão é expressa ectopicamente além α-tubulina nativa e compreende cerca de 20% do α-tubulina total na cula ^9. Importante, a fusão GFP-Tub1 não resgatar a função de α-tubulina / Tub1 (JM, resultados não publicados) nativos. Isto também é verdade de outra fusão TUB1 constrói ^18.

Com as ferramentas disponíveis para visualizar os microtúbulos e as suas proteínas de ligação, de brotamento de levedura é um sistema ideal para estudar mutações em tubulinas e outros reguladores de microtúbulos. Adicionalmente, o número limitado de genes de tubulina permite o estudo directo de uma piscina homogénea de tubulina mutante. Em adição às mutações emgenes da tubulina, de brotamento de levedura tem um número de proteínas associadas ao microtúbulo (MAP) que são homólogos aos homólogos metazoários. Estes mapas podem ser estudadas directamente, e os efeitos que as mutações têm em filamentos de microtúbulos individuais também podem ser examinadas. O protocolo detalhado aqui permite a investigação de ambos os processos intrínsecos e extrínsecos que influenciam a dinâmica dos microtúbulos.

Em resumo, os microtúbulos deve ser dinâmico para funcionar corretamente durante muitos processos celulares. É necessário compreender os factores intrínsecos a tubulina e as proteínas extrínsecos associados que regulam a dinâmica dos microtúbulos. Budding levedura é um sistema ideal para estudar o efeito desses factores por quantificar directamente a dinâmica de um único dos microtúbulos. O protocolo detalhado acima descreve como integrar estavelmente uma proteína de fusão fluorescente no genoma da levedura e como adquirir e analisar imagem confocal pilhas de quantificar dinâmica dos microtúbulos in vivo

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
DOB (dropout bases)	Sunrise science	1650
CSM-Leu	Sunrise science	1005
Agar	Ameresco	N833
100 mm polystyrene plates	Fisher Scientific	FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O	Sigma-Aldrich	D7656	resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media	Sunrise science	1459-100
Concanavalin A	Sigma-Aldrich	L7647	resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides	Fisher Scientific	12-544-1
Microscope Coverslips	Fisher Scientific	12-541-B
Parafilm	Fisher Scientific	13-374-12	paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin)			melt at 75 ºC before use
forceps	Fisher Scientific	16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350	Sigma-Aldrich	202444
Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope	Nikon Instruments	MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective	Nikon Instruments	MRD01905
Piezo electric stage	Physik Instrumente	P-736
Spinning disk scanner	Yokogawa	CSU10
Laser combiner module	Agilent Technologies	MCL400B
EMCCD camera	Andor Technology	iXon Ultra 897
Name	Company	Catalog Number	Comments
Software
NIS Elements software	Nikon Instruments	MQS31100
Microsoft Excel software	Microsoft
MATLAB software	MathWorks, Inc
ImageJ64	NIH		Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in	Open Microscopy Environment
Name	Company	Catalog Number	Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1		pSK1050	reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)