Summary
Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.
Abstract
microtubuli dinamiche sono fondamentali in molti processi cellulari, e misurazioni accurate della dinamica dei microtubuli possono fornire informazioni su come le cellule regolano questi processi e come mutazioni genetiche regolazione impatto. La quantificazione della dinamica dei microtubuli in modelli metazoi ha un certo numero di problemi connessi, compresi una densità microtubuli elevato e limitazioni manipolazioni genetiche. Al contrario, il modello di lievito in erba offre vantaggi che superano queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la dinamica dei singoli microtubuli in cellule di lievito viventi. Cellule che esprimono tubulina fluorescente contrassegnati sono rispettate camere di scorrimento assemblate, consentendo l'acquisizione di immagini time-lapse stabile. Una guida dettagliata per l'alta velocità, è prevista anche l'acquisizione di immagini a quattro dimensioni, così come un protocollo per quantificare le proprietà dei microtubuli dinamiche in pile di immagine confocale. Questo metodo, combinato con la genetica del lievito convenzionali, providi un approccio che è particolarmente adatto per valutare quantitativamente gli effetti regolatori microtubuli o mutazioni che alterano l'attività di subunità di tubulina.
Introduction
I microtubuli sono polimeri del citoscheletro fatti di subunità proteiche αβ-tubulina e sono utilizzati in un'ampia varietà di contesti cellulari, compreso il trasporto intracellulare, la divisione cellulare, morfogenesi, e la motilità. Per costruire reti microtubuli per questi ruoli diversi, le cellule devono regolamentare con attenzione dove e quando modulo di microtubuli. Questa regolazione viene eseguita per mezzo di reazioni che o assemblare subunità αβ-tubulina in microtubuli polimeri o microtubuli smontare in subunità liberi; questo è noto come dinamica dei microtubuli.
Uno degli obiettivi principali del campo microtubulo è quello di chiarire i meccanismi molecolari che regolano dinamica dei microtubuli, compresi quelli di subunità αβ-tubulina e regolatori estrinseci che si legano alla tubulina e / o ai microtubuli. Un approccio sperimentale consolidata a ricostituire questo sistema in vitro utilizzando proteine αβ-tubulina purificata, spesso in comcombinazione con regolatori estrinseci purificati. Anche se questo è un approccio utile, è chiaro che la dinamica dei microtubuli in sistemi ricostituito, differisce notevolmente da quella osservata nelle cellule viventi. Ad esempio, microtubuli crescono più rapidamente e si restringono più lento in vivo che in vitro. Queste differenze possono essere attribuite alla disponibilità di noti regolatori estrinseci 1, nonché a fattori ancora-non definiti nelle cellule. Pertanto, è fondamentale per determinare le attività dei regolatori microtubuli e mutanti che interrompono la dinamica in un contesto cellulare nativo.
Sebbene i modelli metazoi hanno dimostrato di essere i sistemi prevalenti per studiare la funzione dei microtubuli e l'organizzazione di ordine superiore, diversi problemi pratici limitano fortemente l'utilità di questi modelli per la misura precisa della dinamica dei microtubuli. In primo luogo, l'elevato numero di microtubuli, che vanno da decine di migliaia per cella, rende difficile la fiduciamonitorare i singoli microtubuli nel corso del tempo. Molti studi affrontare questa sfida di imaging proteine che localizzano selettivamente estremità microtubuli, come le proteine della famiglia di fine-binding (EB). Tuttavia, queste proteine sono noti per localizzare solo alle estremità di crescita microtubuli in metazoi 2. Pertanto, l'utilità di queste proteine è limitato a misurare direttamente tassi di crescita, mentre solo misurando indirettamente altri aspetti della dinamica, come la frequenza di catastrofe. In secondo luogo, nonostante i progressi nella tecnologia di editing genoma, la creazione di cellule che esprimono stabilmente tubulina fluorescente o l'introduzione di mutazioni di manipolare selettivamente tubulina o microtubuli regolatori rimane una sfida significativa. Inoltre, la presenza di molti isotipi di tubulina in metazoi confonde lo studio di come le mutazioni impatto singoli geni di tubulina.
Il sistema lievito erba fornisce diversi vantaggi importanti per la misurazione in vivo microtubudinamiche LE. Lievito ha una rete microtubuli semplificata che permette la visualizzazione dei singoli microtubuli. Nel lievito, microtubuli provengono dall'organizzazione centri noti come corpi polari mandrino (DSF), che sono incorporati nella membrana nucleare 3. I SPB servono come supporti per piccoli complessi y-tubulina che nucleata microtubuli 4, 5. SPB nucleazione due classi di microtubuli, microtubuli del fuso e microtubuli astrali. Microtubuli del fuso progetto in nucleoplasma e sono importanti per applicazione cromosomi via microtubuli cinetocoro e per stabilizzare il mandrino mediante sovrapposizione microtubuli interpolari 6. Al contrario, progetto microtubuli astrali verso l'esterno nel citosol e sono relativamente rari rispetto alla fitta rete di microtubuli del fuso. Durante la mitosi, cellule pre-anafase hanno solo 1-2 microtubuli astrali provenienti da entrambi SPB; questi esistono come imicrotubuli lcune piuttosto che come fasci 7. Il ruolo dei microtubuli astrali durante la mitosi è quello di spostare il nucleo e il mandrino nella giunzione tra la madre e germoglio compartimenti, noto come il collo bocciolo. Questo movimento comporta percorsi ben definiti che generano vigore microtubuli astrali, tirando il nucleo e il mandrino verso e infine nel collo germoglio 8.
Un altro vantaggio del sistema lievito è l'utilità della sua genetica, che possono essere utilizzati per studiare i regolatori microtubuli e subunità di tubulina con precisione senza precedenti. Lievito possiedono anche un repertorio semplificata di isotipi di tubulina: un unico β-tubulina gene (TUB2) e due geni alfa-tubulina (tub1 e TUB3). Le mutazioni possono essere facilmente introdotti in questi geni e quindi studiati in una popolazione omogenea tubulina 9, 10. Ci sono una serie di ampiamentecostrutti disponibili per microtubuli di etichettatura, e questi possono essere oggetto di integrazione a cromosomica loci per l'espressione stabile (vedi la discussione).
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immagini singole microtubuli in cellule di lievito residente a quattro dimensioni (X, Y, Z, e T) di misura ad alta risoluzione della dinamica dei microtubuli. Metodi per integrare costrutti per la costitutiva, basso livello di espressione di tubulina fluorescente in cellule di lievito sono descritti. Prima di imaging, cellule viventi sono montati in camere di scorrimento rivestite con lectina concanavalina A per stabilizzare le cellule per l'imaging a lungo termine. I parametri ottimali per l'acquisizione delle immagini, nonché un flusso di lavoro per l'analisi dei dati, sono anche descritti.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Preparazione Piastre -Leu Dropout
- Aggiungere 800 mL di acqua sterile deionizzata (DIH 2 O) in un pallone da 2 L. Aggiungere 26.71 g della base dropout (DOB) in polvere, 0,69 g di CSM-Leu, e 20 g di agar. Mescolare con un bastoncino magnetico. Portare a 1 L con DIH 2 O.
- Autoclave a 121 ° C e 19 psi per 30 min.
- Rimuovere la beuta dall'autoclave e lasciarla raffreddare a ~ 65 ° C con delicata agitazione.
- Versare 30 ml / piastra in piastre 100 mm di diametro. Siano questi riposare a temperatura ambiente per 36-48 ore prima della conservazione a 4 ° C.
2. L'integrazione GFP-tub1 per l'espressione costitutiva di GFP-tubulina marcato
- Bollire una concentrazione magazzino di 10 mg / mL di DNA a singolo filamento (ssDNA) per 3 min.
- Combinare 2 ml di bollito ssDNA con 400 ng di purificato GFP-tub1 plasmide DNA 11.
NOTA: Ci sono una varietà di plasmidi che possono essere utilizzati per l'etichettatura stabile, fluorescentedi microtubuli nel lievito che utilizzano fluorofori alternativi e marcatori selezionabili. Alcune di queste alternative sono descritte nella sezione di discussione. - Aggiungere la miscela di DNA ad un'aliquota di 50 ml di cellule di lievito competenti.
NOTA: Preparare cellule di lievito competenti con soluzione di sorbitolo (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, e 1 M sorbitolo, regolato con acido acetico diluito fino a pH 8). Per una descrizione dettagliata di rendere le cellule di lievito competenti, vedi riferimento 12. - Vortex accuratamente.
- Aggiungere 6x il volume totale di soluzione di polietilene glicole (PEG) (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, e il 40% PEG3350) alla miscela DNA-cellula.
- Vortex accuratamente.
- Incubare per almeno 1 ora a 30 ° C con agitazione.
- Aggiungere dimetil solfossido (DMSO) al 10% del volume totale e vortice.
- Incubare a 42 ° C per 15 min.
- Centrifugare a 2.500 g per 5 min.
- cellule piastra su un piatto -Leu ricaduta.
NOTA: Il costrutto GFP-tub1 contiene un marcatore auxotrophic leucina, mentre altri costrutti potrebbe utilizzare un indicatore alternativo. Il mezzo di abbandono deve essere specifico per il marcatore auxotrophic del costrutto. - Lasciare le cellule trasformate di crescere per 3-5 giorni a 30 ° C.
- Re-striscia colonie di trasformazione singola su un piatto -Leu dropout fresco di trasferimento di colonie utilizzando uno stuzzicadenti autoclavato. Incubare la piastra per una notte a 30 ° C.
- Visivamente screening ogni trasformante per un segnale GFP sospendendo circa 1 ml di cellule da una singola colonia dalla piastra a passaggio 2.14 in 2 ml di acqua su un vetrino pulito. Coprire le cellule sospese con un coprioggetto ed osservare tramite microscopia a fluorescenza.
- Eccitare i trasformanti con 488 nm luce e cercare la presenza di un segnale di GFP.
- Eccitare i trasformanti con 488 nm luce e cercare la presenza di un segnale di GFP.
3. Crescere Cultura lievito liquido
- Inoculare ~ 1 ml di cellule di lievito da una singola colonia su un piatto in 3 mL di terreno completo sintetico. Permettono alle cellule di crescere durante la notte a 30 ° C con agitazione a 250 rpm.
- Diluire la cultura satura il giorno seguente per un OD 600 di <0,1 nel mezzo. Restituire coltura diluita al C shaker 30 ° per 3-4 ore o fino a quando la OD 600 è compreso tra 0,4 e 0,8, quando le cellule sono pronte per essere caricati in camere per l'imaging.
4. Preparare flusso Camera Slides
- Tagliareun foglio di pellicola paraffina in un pezzo 4 in larghezza e 7 a lungo.
- Collocare un vetrino da microscopio normale longitudinalmente sulla larghezza 4 pollici di parafilm e avvolgere il film attorno al vetrino 3-4 volte tale che la slitta è ricoperto di pellicola dello spessore di 3-4 strati. Premere insieme gli strati di garantire il sigillo ragionevole; questo renderà più facile da tagliare. Evitare di premere troppo duro o causando il film rughe.
- Tagliare il film paraffina lungo i bordi esterni del vetrino utilizzando un rasoio pulito taglierino. Utilizzare un'altra diapositiva per fornire un regolo per tagliare.
- Buccia pellicola in eccesso dal vetrino di lavoro e scartare. I restanti pile di fogli copriranno una faccia della slitta e saranno utilizzati per rendere le pareti tra camere di imaging.
- Utilizzando la seconda slitta come un regolo, tagliare gli strati di pellicola sovrapposti lungo l'asse della slitta in circa dieci strisce, ogni 2-4 mm di larghezza.
- Tagliare gli strati di pellicola paraffina impilati perpendicolarmentei tagli effettuati nella fase 4.5, lungo l'asse corto della slitta, per creare le strisce 2-4 mm a 23-24 mm di lunghezza, e 3-4 strati spessi.
- Le due strisce tagliate con un rasoio a 45 °. Utilizzando pinze, distribuire uniformemente le strisce di pellicola tagliata su un vetrino da microscopio pulito per creare i numeri desiderati delle camere. Fino a 3 camere (realizzati con 4 strisce di pellicola paraffina) possono essere creati su un vetrino.
- Posizionare un singolo coprioggetto sopra le strisce di pellicola e spostarlo in posizione con una pinza.
- Posizionare il vetrino preparato, coprivetrino su, su una piastra fissata a ~ 95 ° C (questa è di circa l'impostazione di bassa-media sulla maggior parte dei punti cottura). Riscaldare la slitta finché le strisce di pellicola sono trasparenti (circa 3 min) e quindi sigillare il vetrino e applicare il coprioggetto insieme premendo leggermente sul vetrino con le pinzette.
NOTA: È importante soltanto premere sulle regioni del coprioggetto che sono direttamente sopra le strisce di pellicola paraffina, come graffiare le regioni sopra il cHambers possono diminuire la qualità delle immagini. Fare attenzione a non surriscaldare la diapositiva; vaporizzato film di rivestimento volontà l'interno della camera con una pellicola idrofoba che impedisce alle cellule di aderire. - Usare pinze per rimuovere il vetrino dalla piastra (la diapositiva sarà caldo) e metterlo da parte a raffreddare con il lato coprioggetto rivolto verso l'alto; come la slitta raffredda, il film tornerà a un bianco, colorazione opaca.
NOTA: A questo punto, le diapositive sono pronti per essere caricato con cellule di lievito in coltura. diapositive supplementari possono essere fatti a questo punto e conservati in un luogo asciutto e pulito per un ammontare di tempo indefinito.
5. Caricamento di cellule di lievito in preparati flusso Chamber Slides
- Scongelare congelato, 200 microlitri aliquota di concanavalina A (2 mg / ml in sterile DIH 2 O).
- Aggiungere circa 100 ml di scongelato Concanavalina A ciascuna camera del vetrino preparato pipettando in una delle estremità aperte. Aggiungere abbastanza Concanavalina A per riempire la camera. Per questo step, il Concanavalina sarà tirato attraverso la camera attraverso l'azione capillare.
- Appendere la slitta, coprioggetto-down, tra due portaprovette microcentrifuga o penne per 5 minuti per consentire la Concanavalina di aderire al coprioggetto (cioè, la camera).
- Riportare il vetrino in una posizione coprioggetto-up. Lavare la camera con 2x il volume della camera (determinato nella fase 5.2, sopra; circa 200 ml) di mezzo completo sintetico per rimuovere la concanavalina
- Fluire il mezzo attraverso la camera, utilizzando l'angolo di un tovagliolo di carta o una carta da filtro piegato a metà per aspirare il fluido su un'estremità della camera e contemporaneamente pipettando fluido fresco nell'altro. In alternativa, utilizzare un aspiratore per disegnare con cura fluido fuori un'estremità, mentre pipettando fluido fresco nell'altro.
- celle di carico di fluire 2x il volume della camera (circa 200 ml) di sospensione cellulare (dal punto 3.4) utilizzando il meto flusso direttod descritto nel passaggio 5.4.1.
NOTA: L'obiettivo è quello di immagine un singolo strato di cellule al vetrino. Pertanto, è importante caricare una concentrazione di cellule abbastanza piccole da non accumulano uno sopra l'altro, ma abbastanza grandi che cellule sufficiente sono presenti nel campo per raccogliere la quantità massima di dati per l'acquisizione delle immagini. La concentrazione ottimale di cellule all'interno della camera può variare e dovrebbe essere determinato empiricamente. Per aumentare la concentrazione di cellule nella camera di flusso, pellet delicatamente la coltura cellulare a 1.000 xg per 2 minuti e rimuovere alcune delle surnatante. Per diminuire la concentrazione di cellule, aggiungere fresca terreno completo sintetico alla sospensione cellulare. La concentrazione di cellule può essere valutata dopo passo 5.7 (sotto) controllando la camera su un microscopio a contrasto di fase. A questo punto, le cellule possono essere aggiunti alla camera scorrendo in più sospensione cellulare. Tuttavia, riducendo la densità cellulare a questo punto non è fattibile e si raggiunge megliocaricando una nuova camera con una sospensione cellulare diluita. - Appendere il vetrino coprioggetto-down, come descritto al punto 5.3, per 10 min per permettere alle cellule di aderire al coprioggetto.
- Risciacquare le celle non incollata fluendo attraverso 4x il volume della camera (circa 400 mL) di sintetico terreno completo. Ciò elimina cellule fluttuanti nella camera, che può contaminare l'acquisizione dell'immagine.
- asciugare accuratamente ciascuna estremità della camera con un angolo pulito di un tovagliolo di carta, portando il menisco al bordo del vetrino.
- Sigillare ogni estremità della camera con caldo sigillante (75 ° C) (per esempio, VALAP; parti uguali vaselina, cera di lana e cera di paraffina).
NOTA: A questo punto, la diapositiva è pronto per l'immagine. Le camere possono essere esposte fino a 9 ore, a seconda della densità delle cellule in ciascuna camera. Le cellule producono anidride carbonica (CO 2) nel tempo, che gradualmente creare bolle che spostano le cellule.
- Portare la diapositiva a un microscopio invertito dotato di un obiettivo 1,45 NA 100X CFI Plan Apo, una fase piezoelettrico, un'unità scanner confocale disco rotante, un laser di illuminazione, e una fotocamera EMCCD. Mantenere la temperatura dello stadio a temperatura ambiente (25 ° C) durante l'acquisizione.
NOTA: L'elevata apertura numerica consente una maggiore risoluzione dell'immagine e la fase piezoelettrico consente l'acquisizione z-stack ad alta velocità. I requisiti minimi microscopio sono l'obiettivo 100X, il laser illuminazione, e la fotocamera EMCCD. - Portare le cellule a fuoco. Assicurarsi che il campo di acquisizione ha almeno 5-6 cellule raggruppati insieme ricercando il vetrino per cellule raggruppate.
NOTA: Anche se non è necessario immagine più di una cella alla volta, di imaging più celle nello stesso campo migliora l'efficienza di acquisizione dati senza compromettere la qualità dei dati. Tuttavia, è fondamentale che ille cellule sono sullo stesso piano focale e non accatastati uno sopra l'altro. - Programmare un'acquisizione multidimensionale per raccogliere più serie Z nel tempo.
- Regolare le impostazioni all'interno delle impostazioni di acquisizione attivi al seguente: totale Z-depth = 6 um, fino a comprendere l'intera cella di lievito; Z-step size = 300 nm, per massimizzare la raccolta luce senza sovracampionamento; durata totale = 10 min; intervalli di tempo = Z-serie ogni 4 s; e tempo di esposizione = 90 ms per ogni piano z.
NOTA: Il tempo di esposizione ottimale varierà a seconda della telecamera, la sorgente di luce di eccitazione, e altri fattori. In generale, il tempo di esposizione ottimale sarà il tempo minimo necessario per raggiungere un rapporto 3: 1 del segnale da microtubuli astrali GFP-marcato per segnalare dal citoplasma basata sui valori pixel misurati dal EMCCD.
- Regolare le impostazioni all'interno delle impostazioni di acquisizione attivi al seguente: totale Z-depth = 6 um, fino a comprendere l'intera cella di lievito; Z-step size = 300 nm, per massimizzare la raccolta luce senza sovracampionamento; durata totale = 10 min; intervalli di tempo = Z-serie ogni 4 s; e tempo di esposizione = 90 ms per ogni piano z.
- Iniziare l'acquisizione facendo clic su 'Esegui'. Permettono di correre per l'intera durata 10 min. Salvare i dati come immagineserie (.tiff o .nd2).
- Selezionare un nuovo campo per l'immagine all'interno della camera e ripetere i passaggi 6,2-6,4.
NOTA: Una singola camera dovrebbe produrre tra 15 e 20 settori delle celle, a seconda della densità delle cellule all'interno della camera. Densità cellulari più alti produrranno campi totali inferiori, come il CO 2 nella camera si accumula più velocemente.
Analisi 7. Immagine
- Aprire il file di immagine in ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) come HyperStack utilizzando la bio-formati importatore plugin.
- Aperto ImageJ e trascinare la pila immagine acquisita dalla sezione 6 direttamente sul pannello di controllo. L'importatore bio-formati si avvierà automaticamente. Selezionare "OK" per caricare la serie di immagini come HyperStack.
NOTA: i "Bio-formati opzioni di importazione" Prompt viene aperto e garantire che sotto il "Stack Visualizzazione" sezione "View stack con:" è impostato su "HyperStack"; e "Stack ordine:" è impostato su "XYCZT."
- Aperto ImageJ e trascinare la pila immagine acquisita dalla sezione 6 direttamente sul pannello di controllo. L'importatore bio-formati si avvierà automaticamente. Selezionare "OK" per caricare la serie di immagini come HyperStack.
- Comprimere ciascuna Z-serie in una massima intensità di proiezione 2-dimensionale utilizzando la funzione Z-progetto.
- Selezionare il menu "Immagine", il sottomenu "Stack", e la funzione "Z-progetto". Selezionare "proiezione massima" dall'elenco a discesa e fare clic su "OK".
- Applicare un filtro mediano alla serie di immagini per ridurre il rumore screziature selezionando il menu "Azione", il sottomenu "filtri", e la funzione "mediana". Inserisci 2.0 pixel nella casella di raggio e fare clic su "OK".
- Identificare le cellule pre-anafase nel campo.
NOTA: Questi sono caratterizzati da gemme medie e una breve fuso mitotico, 1-1.5 micron di lunghezza (figura 1, punti punta di freccia per un breve fuso mitotico). Cellule in questa fase sono ideali per l'analisi dinamica dei microtubuli perché di solito mostrano solo femicrotubuli astrali w emanano i poli del fuso 7. microtubuli astrali possono essere identificati come filamenti lineari che presentano un'intensità di segnale GFP uniforme dall'estremità meno, a SPB, al fine plus, nel citoplasma. - A partire dal primo timepoint della serie di immagini, utilizzare lo strumento linea segmentata per disegnare una linea lungo un singolo microtubuli astrale, dall'estremità meno, che si trova all'incrocio tra microtubuli astrali ei microtubuli del fuso più intensamente etichettati, all'estremità più , che è nel citoplasma (vedere le linee rosse nella figura 1). Fare doppio clic sulla fine del microtubulo per completare la linea segmentata.
- Registrare la misura nella tabella dei risultati utilizzando la funzione "misura" premendo il tasto "M" sulla tastiera.
NOTA: Le funzioni aggiuntive, come l'intensità grigio, può essere registrato impostando le misure nel menu "Analizza" e sottomenu "Set Misure". - Passare alla successiva timepoint facendo clic sulla freccia a destra nella barra Z-cursore o premendo il tasto "> ./" sulla tastiera. Ripetere i punti 7.5 e 7.6 per tutte le visite nei la sequenza di immagini.
- Copiare i dati dalla tabella dei risultati e incollarli in un foglio di calcolo. Salvare i dati scegliendo "Salva con nome".
NOTA: Queste misure includono diversi valori, ma i valori più importanti sono la fetta, che indica il tempo di valutazione nella serie, e la lunghezza, che indica la lunghezza della linea (cioè, il microtubulo astrale). Colonne contenenti altre misure (ad esempio, l'area, il valore medio dei pixel, angolo, ecc) può o essere mantenuto o scartato. - Creare una nuova colonna nel foglio di calcolo facendo clic destro e usando la funzione "Inserisci". Ingresso il tempo (s) di ciascun tempo di valutazione.
- Creazione di un diagramma a dispersione XY di lunghezza microtubuli (micron) in funzione del tempo (s) utilizzando il "Inserisci lineaGrafico" caratteristica; selezionare le misure di lunghezza come 'Y' e la colonna tempo come 'X'
- Identificare le regioni di polimerizzazione, depolimerizzazione e pausa, cercando di variazioni positive e negative di lunghezza nel tempo del terreno dispersione dal punto 7.10.
NOTA: eventi polimerizzazione aumentano lunghezza microtubuli di almeno 0,5 pm attraverso un minimo di 3 timepoints e montare una regressione lineare con R 2 ≥ 0,9 e un valore di R> 0 (Figura 1B e D, punti verdi). Eventi depolimerizzazione dei microtubuli diminuiscono lunghezza di almeno 0,5 pm attraverso un minimo di 3 timepoints e montare una regressione lineare con R 2 ≥ 0,9 e un valore di R <0 (Figura 1B e D, punti rosa). eventi pausa sono separati da polimerizzazione e depolimerizzazione. Pause sono definiti come variazioni nette di lunghezza microtubuli inferiore a 0,5 um attraverso un minimo di 3 timepoints;adattare una regressione lineare con un valore di R tra -0.4 e 0,4; e hanno una pendenza che non è statisticamente diverso da zero, come determinato da un F-test. - Utilizzando il grafico a dispersione come una guida, identificare le sezioni di tempo in cui il cambiamento di lunghezza è positiva e mettere in evidenza in un colore verde. Evidenziare le regioni del momento in cui la variazione di lunghezza è negativa in un colore rosa.
- Calcolare la regressione lineare di ciascun evidenziato sezione e registrare il -value R e R 2 per ogni sezione nelle colonne prossimali alle regioni. Classificare ciascuna regione colorato come sia un evento di polimerizzazione o un evento di depolimerizzazione.
- Identificare le regioni di polimerizzazione, depolimerizzazione e pausa, cercando di variazioni positive e negative di lunghezza nel tempo del terreno dispersione dal punto 7.10.
- Calcolare la velocità di polimerizzazione dividendo la variazione netta lunghezza dalla variazione di tempo per ogni evento crescita. Registrare questi risultati nella colonna adiacente ai valori di regressione lineare dal punto 7.10.3.
- Calcolare i tassi di depolimerizzazione dividendo la variazione netta lunghezza dalla variazione di tempo per ogni SHRINKINevento g. Registrare questi risultati nella colonna adiacente ai valori di velocità di polimerizzazione dal punto 7.11.
- Calcolare la frequenza catastrofe dividendo il numero di transizioni polimerizzazione-to-depolimerizzazione per il tempo totale di tutti gli eventi di crescita 13. Registrare questi risultati nella colonna adiacente ai valori della frequenza depolimerizzazione dal punto 7.12.
- Calcolare la frequenza di salvataggio dividendo il numero di transizioni depolimerizzazione-to-polimerizzazione per il tempo totale di tutti gli eventi ritiro 13. Registrare questi risultati nella colonna adiacente ai valori di frequenza catastrofe dal punto 7.13.
- Calcolare la dinamicità dividendo la somma del valore assoluto di tutte le variazioni di lunghezza nel durata totale dell'acquisizione dell'immagine, calcolati al passaggio 7.10.1, e moltiplicando per 27,0833 avere tubulina subunità al secondo 14. Registrare questi risultati nella colonna adiacente alla Val frequenza di salvataggioUES dal punto 7.14 e salvare la tabella dei risultati.
NOTA: E 'possibile automatizzare il processo di analisi descritto nei punti 7.10-7.15 utilizzando un programma su misura (. Estrem, et al, manoscritto presentato). Il programma è progettato per identificare periodi di polimerizzazione e depolimerizzazione nelle misure di lunghezza seguendo i parametri descritti sopra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Misurazione dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi fornisce uno strumento valido per valutare come mutazioni in geni codificanti regolatori microtubuli o tubulina subunità polimerizzazione impatto e tassi di depolimerizzazione, così come la frequenza di transizione tra questi stati. La figura 1 mostra una serie temporale di dinamica dei microtubuli astrali in una cella wild-type e una cellula mutante con una mutazione nel β-tubulina (tub2- 430Δ). Microtubuli sono etichettati con GFP-tagged α-tubulina per visualizzare lunghezza microtubuli. Le frecce rosse tracciano la lunghezza del microtubulo astrale in ogni immagine (Figure1A e 1 C). Lunghezze microtubuli sono stati misurati a ciascun timepoint per 8 minuti, e queste lunghezze compilati sono raffigurati nelle piazzole vita (Figura 1B e 1 D). Questi dati sono stati utilizzati per determinare la velocità di polimerizzazione, tasso di depolimerizzazione, polimerizzazione duratisu, la durata depolimerizzazione, la frequenza di soccorso, la frequenza catastrofe, e dinamicità.
Figura 1. Time-lapse imaging di microtubuli e misure di Astral microtubuli Dynamics GFP-marcato. (A e C) I primi cinque immagini sequenziali di time-lapse imaging per il tipo selvaggio e tub2 -430Δ cellule mutanti. Microtubuli sono etichettati con GFP-tub1 e ripreso in pre-anafase del ciclo cellulare. Ogni immagine è una proiezione massima intensità da una serie Z confocale. Barre di scala: 1 micron. Timestamp mostra il tempo totale in ogni acquisizione fotogramma. Le frecce rosse seguono lungo la lunghezza complessiva di un microtubulo astrale, con le frecce che indica l'estremità più. (B e D) trame di vita microtubuli visualizzano le lunghezze dei singoli microtubuli astrali nel corso del tempo. Il punto verdes denotano polimerizzazione ed i punti rosa denotano depolimerizzazione. Le frecce indicano gli eventi catastrofali. Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
La figura 1 illustra dinamica dei microtubuli alterati tra un ceppo wild-type e un ceppo mutante privo acidi 27 amminoacidi di β-tubulina sul C-terminale, un mutante che è stato precedentemente dimostrato di avere microtubuli più stabili 15. Come mostrato nelle trame vita microtubuli, microtubulo nel mutante tub2 -430Δ è più lungo e presenta un minor numero di catastrofi rispetto al tipo selvaggio microtubuli (frecce Figura 1B e D; Tabella 1). Inoltre, la velocità di polimerizzazione e depolimerizzazione, determinati dalle piste di salire e scendere microtubuli lengTHS, sono diminuiti nel mutante rispetto al wild-type (Figura 1B e 1D, Tabella 1). Infine, microtubulo nella cella mutante tub2 -430Δ passa più tempo in stati di polimerizzazione e depolimerizzazione e dinamicità è diminuito rispetto al tipo selvaggio (Tabella 1).
| Sforzo | Dinamicità (subunità / s) | Velocità di polimerizzazione (micron / min) | % Tempo di polimerizzazione | Tasso Depolym (micron / min) | % Tempo in Depoly- merization | % Tempo di pausa | Frequenza di salvataggio (eventi / min) | Frequenza catastrofe (evEnt / min) |
| Wild-type n = 1 | 54 | 1.8 ± 0.5 | 48 | 3,0 ± 0,3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430Δ n = 1 | 40 | 1.4 ± 0.1 | 41 | 1.5 ± 0.2 | 32 | 0 | 0.8 | 0.7 |
| Abbreviazioni sono i seguenti: um, micron; min, minuto; s, secondo; n, singolo microtubuli analizzato dalla trama vita microtubuli (Fig1B, D). I valori sono media ± errore standard della media. | ||||||||
Tabella 1: microtubuli Dynamics Misure per celle in figura 1. I valori sono la media ± errore standard della media dalle misure dei singoli microtubuli indicate nella figura 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Il modello lievito gemmante offre importanti vantaggi per la raccolta di misurazioni ad alta risoluzione della dinamica dei microtubuli in un ambiente in vivo, compresa la capacità di immagini singole microtubuli nel tempo e la capacità di manipolare tubuline e regolatori microtubuli utilizzando gli strumenti della genetica del lievito.
Le camere Concanavalina A-patinata forniscono un certo numero di vantaggi rispetto apparati precedentemente descritti, tra pastiglie fuso agar. Vetrini con camere possono essere pre-fatte e conservate a lungo termine o possono essere usati immediatamente. Inoltre, le camere Concanavalina A-rivestiti sono capaci di coltura di cellule di lievito per> 6 ore nello stesso mezzo in cui le cellule sono state coltivate in origine. È importante notare che il numero delle cellule all'interno della camera detterà quanto tempo la camera può essere ripreso. Le camere rivestite garantire che solo un singolo strato di cellule di lievito aderisce al coprioggetto. Infine, creando camere multiple permettediversi ceppi di lievito differenti per essere ripreso sullo stesso vetrino.
I principali problemi di dinamica dei microtubuli di imaging in erba lievito, compresi i livelli relativamente bassi di segnale e la natura altamente dinamica del processo. microscopi grandangolari sono adeguati per catturare immagini a singolo timepoint di microtubuli etichettati. Tuttavia, la microscopia widefield provoca più veloce photobleaching a causa di tempi di esposizione più lunghi e il bombardamento del campione con out-of-focus luce. Analogamente, scansione laser confocale sono inadeguate per photobleaching veloce. Spinning disco di microscopia confocale è particolarmente adatto per l'imaging della dinamica dei microtubuli in erba lievito. Il sistema di microscopio confocale disco rotante utilizzato qui è stato progettato con questi requisiti in mente.
Il sistema microscopio deve essere progettato per l'alta velocità e alta sensibilità. Sebbene una varietà di sistemi microscopio può risultare adatto, diversi componenti sono essenziali. A 100Xobiettivo con una elevata apertura numerica (1.45NA) è necessario per risolvere singoli microtubuli e variazioni di lunghezza dell'ordine di 100 nm. Uno scanner di filatura del disco confocale è necessario ridurre al minimo photobleaching e la tossicità, bloccando la luce out-of-focus, e per massimizzare la risoluzione e sensibilità, raccogliendo la luce solo nella messa a fuoco. La telecamera EMCCD deve essere veloce e sensibile a raccogliere abbastanza segnale GFP-tub1 durante ogni 90 ms di acquisizione time-lapse. Attualmente, le telecamere EMCCD sono la scelta migliore per questa applicazione. Attuali fotocamere sensore CMOS non hanno la sensibilità di EMCCDs fascia alta; Tuttavia, questa tecnologia migliora significativamente e potrebbe presto essere adatto. Infine, è necessaria una fase piezoelettrico per il movimento rapido e preciso in Z, che può essere il fattore limitante nella acquisizione delle immagini quadridimensionale.
Il sistema microscopio specifico descritto in questo protocollo può presentare una barriera se usate simile non è prontamente disponibile. alterazioni cun essere fatto per adattarsi ai diversi sistemi di imaging, ma queste modifiche possono andare a scapito della risoluzione temporale e / o spaziali. Un motore fase mandrino a motore può essere usato al posto della fase piezoelettrico. Tuttavia, questi motori sono più lenti, meno precisi, e incline ad andare alla deriva. Post-acquisizione immagini stabilizzante plug-in possono essere utilizzati per ridurre la deriva nelle dimensioni XY associati a questi stadi motorizzati. Inoltre, le telecamere alternano con velocità di lettura più lenti possono essere usate. Per ospitare un tasso più lento di acquisizione, Z-serie potrebbe essere raccolto meno spesso (cioè, più tempo tra serie Z). Tuttavia, aumentando il tempo tra serie Z rischi transizioni mancanti che possono verificarsi tra momenti. In alternativa, la distanza tra i piani Z può essere aumentata in modo di diminuire il numero di immagini raccolte a Z-serie. Tuttavia, l'aumento di questo distanza rischia di perdere le informazioni dell'immagine tra i piani, che compromettere la capacità del sperimentatore di accuratamente identificare estremità microtubuli. Chiaramente, alterazioni possono essere apportate per ospitare sistemi di imaging alternativi, ma queste modifiche devono essere valutati rispetto al potenziale perdita di informazioni di immagine.
Un altro limite di questo protocollo è la perdita di informazioni spaziali quando tridimensionali pile di immagini vengono convertiti proiezioni di immagini bidimensionali. Un individuo microtubuli astrale in una cellula di lievito pre-anafase è tipicamente compresa tra 0,5 e 2,0 micron di lunghezza e progetti attraverso lo spazio tridimensionale del citoplasma. È pertanto fondamentale per acquisire immagini da una serie di Z-posizioni per raccogliere tutte le informazioni spaziali di un individuo microtubuli. In un'acquisizione time-lapse, questo può produrre un insieme di dati complessi, con 20 Z-fette a ciascuno dei 150 timepoints, per un totale di 3.000 immagini. Per affrontare questo problema e per semplificare l'analisi dell'immagine, le informazioni spaziali dei Z-stack viene compresso durante l'analisi. Mentre questo benefla sua analisi, si tratta a costo di informazioni spaziali dalla Z-dimensione. Quante informazioni si perde quando la Z-dimensione è compresso? Per stimare questa perdita, sono stati condotti esperimenti per misurare la distanza tra SPB in cellule pre-anafase, che sono relativamente facili da misurare perché Spc110-GFP-etichettata SPB presentano foci sferico con elevati rapporti segnale-rumore. Sebbene il mandrino può presentare spostamento differente a Z di microtubuli astrali, la lunghezza media è simile (~ 1,5 um) e quindi fornisce un utile proxy. lunghezze mandrino sono, in media, il 15% più lungo quando misurati per intero stack di immagini tridimensionali che quando gli stessi mandrini sono misurate in proiezioni bidimensionali (JM, risultati non pubblicati). Così, il beneficio dei dati semplificate e misure deve essere valutato contro il costo di scartato informazioni Z.
La comunità biologia cellulare di lievito ha sviluppato un kit di strumenti versatili per l'imaging dei microtubuli networks. Questo include una varietà di proteine fluorescenti fuse ad a-tubulina / tub1 e contrassegnati con vari marcatori auxotrofici. Questi costrutti includono LEU2 :: GFP-tub1 (pSK1050) 11, che integra al cromosomico LEU2 locus, e diverse fusioni di GFP e altri fluorofori, che integrano al locus URA3, tra cui URA3 :: GFP-tub1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-tub1 (pAFS125-PCP), e URA3 :: pHIS3-mCherry-tub1 (pAK011) 17. Inoltre, una serie di fusioni tub1 alle proteine fluorescenti diverse è stato recentemente creato che l'integrazione di destinazione su locus cromosomico URA3 o ad un locus adiacente alla tub1 locus nativo 18. Questa vasta gamma di fluorofori e marcatori è molto utile per gli esperimenti di co-localizzazione con proteine differenzialmente etichettati. La fusione GFP-tub1 rimane lo strumento migliore per il time-lapse imaging di microtudinamica bule grazie alla sua luminosità e fotostabilità. La fusione GFP-tub1 creato da Song & Lee (pSK1050) 11 contiene una fusione di GFP al amino-terminale di α-tubulina / tub1 e si integra a livello del locus LEU2 per salvare leucina auxotrofia. Pertanto, la proteina di fusione viene espressa ectopicamente oltre al nativo α-tubulina e comprende ~ 20% del totale α-tubulina nella cella 9. È importante sottolineare che la fusione GFP-tub1 non salvare la funzione di α-tubulina / tub1 (JM, risultati non pubblicati) native. Ciò vale anche per altre fusione tub1 costruisce 18.
Con gli strumenti disponibili per visualizzare i microtubuli e le loro proteine di legame, in erba lievito è un sistema ideale per studiare mutazioni in tubulina e altri regolatori microtubuli. Inoltre, il numero limitato di geni di tubulina consente lo studio diretto di un pool omogeneo di tubulina mutante. In aggiunta alle mutazioni ingeni tubulina, erba lievito ha un certo numero di proteine associate ai microtubuli (MAP) che sono omologhe alle controparti metazoi. Queste mappe possono essere studiate direttamente, e gli effetti che mutazioni hanno sui singoli filamenti microtubuli può anche essere esaminato. Il protocollo dettagliato qui consente l'indagine sia dei processi intrinseci ed estrinseci che influenzano dinamica dei microtubuli.
In sintesi, i microtubuli devono essere dinamici per funzionare correttamente durante molti processi cellulari. È necessario comprendere i fattori intrinseci alla tubulina e le proteine associate estrinseci che regolano dinamica dei microtubuli. Erba lievito è un sistema ideale per studiare l'effetto di questi fattori quantificando direttamente la dinamica di un singolo microtubuli. Il protocollo dettagliato sopra descrive come integrare stabilmente una proteina di fusione fluorescenti nel genoma del lievito e come acquisire e analizzare l'immagine confocale stack di quantificare dinamica dei microtubuli in vivo
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.
Acknowledgments
Ringraziamo Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), e Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) per la condivisione di vari plasmidi FP-tub1. Siamo grati a Melissa Gardner (University of Minnesota) per noi la formazione nel metodo di preparazione camera di scorrimento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concedere R01GM112893-01A1 (a JKM) e T32GM008730 (a CE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
