Summary
Gist is een voordelige model voor het bestuderen van de dynamica van microtubuli in vivo vanwege de krachtige genetica en de eenvoud van het microtubule-cytoskelet. Het volgende protocol wordt beschreven hoe om te transformeren en cultuur gistcellen, verwerven confocale microscopie afbeeldingen en kwantitatief te analyseren dynamiek van microtubuli in levende gistcellen.
Abstract
Dynamische microtubules zijn van fundamenteel belang voor vele cellulaire processen en nauwkeurige metingen van de dynamiek van microtubuli kan inzicht geven in hoe cellen reguleren deze processen en hoe genetische mutaties invloed regelgeving te bieden. De kwantificering van de dynamiek van microtubuli in metazoan modellen heeft een aantal bijbehorende uitdagingen, waaronder een hoge microtubule dichtheid en beperkingen van genetische manipulaties. In contrast, de gist model biedt voordelen die deze uitdagingen te overwinnen. Dit protocol beschrijft een methode om de dynamica van enkelvoudige microtubuli in levende gistcellen te meten. Cellen die fluorescent gelabeld tubuline worden nageleefd geassembleerd dia kamers, waardoor stabiele time-lapse beeldacquisitie. Een uitgebreide gids voor snelle, is het vierdimensionale acquisitie ook verschaft, evenals een protocol voor het kwantificeren van de eigenschappen van de microtubuli in confocale afbeeldingsstapels. Deze werkwijze, in combinatie met gebruikelijke gistgenetica, provIDE benadering die uniek geschikt voor het kwantitatief beoordelen van de effecten van microtubule regulators of mutaties die de activiteit van tubuline subeenheden veranderen.
Introduction
Microtubuli zijn cytoskelet polymeren van αβ-tubuline eiwit subeenheden en worden gebruikt in een grote verscheidenheid aan cellulaire contexten, zoals intracellulair transport, celdeling, morfogenese en motiliteit. Om microtubule netwerken op te bouwen voor deze verschillende rollen, moet cellen zorgvuldig te reguleren waar en wanneer microtubuli vorm. Deze regeling wordt bewerkstelligd door regeling van de reacties die ofwel assembleren αβ-tubuline subeenheden in microtubule polymeren of demonteren microtubules het vrije subeenheden; dit staat bekend als de dynamiek van microtubuli.
Een belangrijk doel van het veld microtubule is om de moleculaire mechanismen die de dynamica van microtubuli, waaronder studies van de αβ-tubuline subeenheden en extrinsieke toezichthouders die zich binden aan tubuline en / of aan microtubuli te reguleren op te helderen. Een gevestigde experimentele benadering om dit systeem te reconstitueren in vitro met gezuiverd tubuline αβ-eiwit, vaak combinatie met gezuiverd extrinsieke regulatoren. Hoewel dit een nuttige aanpak, is het duidelijk dat de dynamiek van microtubuli in gereconstitueerde systemen verschilt sterk van die in levende cellen. Bijvoorbeeld, microtubules sneller groeien en krimpen langzamer in vivo dan in vitro. Dit verschil wordt toegeschreven aan de beschikbaarheid van bekende extrinsieke regulators 1, alsmede een nog-undefined factoren in cellen. Daarom is het van cruciaal belang voor de activiteiten van de microtubule regelgevers en mutanten die dynamiek in een native cellulaire context verstoren bepalen.
Hoewel metazoan modellen hebben bewezen aan de heersende systemen voor het onderzoeken van microtubule functie en hogere orde organisatie, streng een aantal praktische bezwaren het nut van deze modellen te beperken voor de precieze meting van de dynamiek van microtubuli. Ten eerste, het grote aantal microtubuli, variërend van tientallen tot duizenden per cel, maakt het moeilijk om vol vertrouwentraceren individuele microtubules in de tijd. Vele studies pakken deze uitdaging door beeldvorming eiwitten die selectief lokaliseren microtubuli doeleinden, zoals eiwitten in het einde binding (EB) familie. Echter, deze eiwitten waarvan bekend is uitsluitend gelokaliseerd aan de uiteinden van microtubuli in meercelligen 2. Daarom is het nut van deze eiwitten beperkt tot het rechtstreeks meten van groei, terwijl slechts indirect meten van andere aspecten van de dynamiek, zoals de frequentie van een catastrofe. Ten tweede, ondanks de vooruitgang in het genoom van het bewerken technologie, het creëren van cellen die stabiel fluorescent gelabeld tubuline of het introduceren van mutaties om selectief te manipuleren tubuline of microtubule toezichthouders uit te drukken blijft een belangrijke uitdaging. Bovendien is de aanwezigheid van vele tubuline isotypes in metazoa verwart de studie van hoe mutaties invloed hebben op de individuele tubuline genen.
Het gist-systeem biedt een aantal belangrijke voordelen voor het meten van in vivo microtubule dynamiek. Gist een vereenvoudigd microtubule netwerk dat visualisatie van individuele microtubules toelaat. In gist microtubules afkomstig uit het organiseren centra bekend als spil poolelementen (SPBs), die zijn ingebed in de kern envelop 3. De SPBs dienen als scaffolds voor γ-tubuline kleine complexen die microtubules 4, 5 kiemen. SPBs nucleëren twee klassen van microtubuli, spindel microtubuli en astrale microtubuli. Spindel microtubuli uitsteken in de nucleoplasma en zijn belangrijk voor bevestiging aan chromosomen via kinetochoor microtubuli en voor het stabiliseren van de spil via overlappende interpolaire microtubuli 6. Daarentegen worden microtubuli stervormig naar buiten uitsteken in de cytosol en relatief zeldzaam in vergelijking met het dichte net van spindel microtubuli. Tijdens de mitose, pre-anafase cellen slechts 1-2 stervormig microtubules afkomstig van ofwel SPB; deze bestaan als individuele microtubuli plaats van als bundels 7. De rol van stervormige microtubuli tijdens mitose is om de kern en spil verplaatsen naar de verbinding tussen de moeder en knop compartimenten, bekend als het gewas hals. Deze beweging gaat goed gedefinieerde paden die te genereren op stervormige microtubules, trekken de kern en de spil naar en uiteindelijk in de kiem hals 8.
Een ander voordeel van het gistsysteem is het nut van de genetica, die kan worden gebruikt om microtubuli regelaars en tubuline subeenheden onderzoeken met ongekende nauwkeurigheid. Gist bezitten ook een vereenvoudigde repertoire van tubuline isotypen: een β-tubuline-gen (tub2) en twee α-tubuline-genen (TUB1 en TUB3). Mutaties kunnen gemakkelijk worden ingebracht in deze genen en daardoor bestudeerd in een homogene tubuline populatie 9, 10. Er zijn een aantal grote schaalbeschikbaar constructen voor labeling microtubuli, en deze kunnen worden gericht voor integratie op chromosomale loci voor stabiele expressie (zie discussie).
Het algemene doel van deze methode is enkel beeld microtubuli in levende gistcellen in vier dimensies (X, Y, Z en T) voor hoge-resolutie metingen dynamiek van microtubuli. Werkwijzen voor het integreren van constructen voor de constitutieve, lage expressie van fluorescent gelabeld tubuline in gistcellen beschreven. Voorafgaand aan beeldvorming worden levende cellen gemonteerd op slede kamers bekleed met de lectine Concanavaline A aan de cellen op lange termijn imaging stabiliseren. De optimale parameters voor beeldopname, alsook een werkstroom voor gegevensanalyse, worden ook beschreven.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Voorbereiding Leu Dropout Plates
- Voeg 800 ml steriel, gedeïoniseerd water (Dih 2 O) in een 2 L kolf. Voeg 26.71 g uitval base (DOB) poeder, 0,69 g CSM-Leu, en 20 g agar. Mengen met een magnetische roerstaaf. Breng op 1 L met dih 2 O.
- Autoclaaf bij 121 ° C en 19 psi gedurende 30 min.
- Neem de kolf uit de autoclaaf laten afkoelen tot -65 ° C onder zacht roeren.
- Giet 30 ml / plaat in 100 mm platen. Laat deze staan bij kamertemperatuur gedurende 36-48 uur vóór opslag bij 4 ° C.
2. De integratie van GFP-Tub1 voor de constitutieve expressie van GFP-gelabelde Tubulin
- Kook een voorraad concentratie van 10 mg / ml enkelstrengs DNA (ssDNA) gedurende 3 min.
- Voeg 2 pl gekookt ssDNA met 400 ng gezuiverde GFP-plasmide-DNA Tub1 11.
OPMERKING: Er zijn een aantal verschillende plasmiden die kunnen worden gebruikt voor de stabiele, fluorescente labelingmicrotubuli in gist dat alternatieve fluoroforen en selecteerbare markers gebruiken. Sommige van deze alternatieven worden beschreven in de discussie sectie. - Voeg de DNA-mengsel aan een 50 pl aliquot van competente gistcellen.
OPMERKING: Bereid competente gistcellen met sorbitoloplossing (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, en 1 M sorbitol, ingesteld met verdund azijnzuur op pH 8). Voor een gedetailleerde beschrijving van het maken van competente gistcellen, zie referentie 12. - Vortex grondig.
- Voeg 6x het totale volume van polyethyleenglycol (PEG) oplossing (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH pH 8, en 40% PEG 3350) aan het DNA-celmengsel.
- Vortex grondig.
- Incubeer gedurende ten minste 1 uur bij 30 ° C onder zacht schudden.
- Voeg dimethylsulfoxide (DMSO) tot 10% van het totale volume en vortex.
- Incubeer bij 42 ° C gedurende 15 minuten.
- Centrifugeer bij 2500 xg gedurende 5 minuten.
- Plaat cellen op een plaat Leu uitval.
OPMERKING: De GFP-Tub1 construct bevat een leucine auxotrofe marker, terwijl andere constructies een alternatieve marker zou kunnen gebruiken. De uitval medium moet specifiek zijn voor de auxotrofe marker van het construct zijn. - Laat de getransformeerde cellen om te groeien gedurende 3-5 dagen bij 30 ° C.
- Opnieuw streak enkele transformatie kolonies op een verse plaat Leu uitval door het overbrengen van kolonies onder gebruikmaking van een autoclaaf tandenstoker. Incubeer de plaat gedurende de nacht bij 30 ° C.
- Visueel screenen elke transformant voor een GFP signaal door suspenderen ongeveer 1 pl van cellen uit een enkele kolonie van de plaat in stap 2,14 in 2 pl water op een schoon objectglas. Bedek de gesuspendeerde cellen met een dekglaasje en observeren met fluorescentiemicroscopie.
- Prikkelen de transformanten met 488 nm licht en kijken naar de aanwezigheid van een GFP-signaal.
- Prikkelen de transformanten met 488 nm licht en kijken naar de aanwezigheid van een GFP-signaal.
3. Groeiende Liquid Yeast Cultuur
- Inoculeren ~ 1 pi van gistcellen van een enkele kolonie op een plaat in 3 ml synthetisch volledig medium. Laat de cellen gedurende de nacht groeien bij 30 ° C onder schudden bij 250 rpm.
- Verdun de verzadigde kweek de volgende dag tot een OD 600 van <0,1 in het medium. Zet de verdunde kweek tot 30 ° C schudder gedurende 3-4 uur of totdat de OD 600 tussen 0,4 en 0,8, wanneer de cellen klaar zijn in kamers voor beeldvorming te laden.
4. Voorbereiden van Flow Chamber Slides
- Besnoeiingeen vel paraffinefilm in een stuk 4 in brede en lange 7.
- Plaats een standaard microscoopglaasje de lengterichting op de 4 inch breedte van paraffinefilm en wikkel de film rond het objectglaasje 3-4 malen zodat de schuif bedekt met film die 3-4 lagen dik. Drukt de lagen samen om te zorgen voor een redelijke afdichting; Dit zal het gemakkelijker te snijden maken. Vermijd te hard drukken of het veroorzaken van de film te rimpel.
- Snijd de paraffinefilm langs de buitenranden van de schuif met een schone doossnijder scheermes. Met andere dia een rechte rand voor het snijden.
- Schil de overtollige film van de werkende glijbaan en weggooien. De resterende stapels film dekt één zijde van de schuif en wordt gebruikt om de muren tussen imaging camera maken.
- Met de tweede slede als een rechte rand, snijd de gestapelde filmlagen langs de lange as van de slede in ongeveer tien stroken, elk 2-4 mm breed.
- Snijd de gestapelde paraffinefilm lagen loodrecht opde sneden in stap 4.5, langs de korte as van de slede, stroken maken 2-4 mm breed, 23-24 mm lang en 3-4 lagen dik.
- Schil de gesneden stroken met behulp van een scheermes op 45 °. Behulp van een tang, verdelen de gesneden filmstroken op een schoon objectglaasje het gewenste aantal kamers te creëren. Tot 3 kamers (gemaakt met 4 paraffinefilm stroken) kunnen worden gemaakt op één dia.
- Plaats een enkel dekglaasje bovenop de filmstroken en beweeg het in positie met een pincet.
- Plaats de voorbereide dia, dekglaasje op, op een kookplaat ingesteld op ~ 95 ° C (dit is ongeveer het lage gemiddelde instelling meeste kookplaten). Verwarm de slede totdat de foliestroken zijn doorschijnend (ongeveer 3 minuten) en vervolgens sluit de glijbaan en dekglaasje samen met lichte druk op het dekglaasje met de pincet.
NB: Het is belangrijk om alleen druk op de regio's van het dekglaasje die direct boven de paraffine film strips, zoals krassen op de regio's boven de chambers kan de beeldkwaliteit verminderen. Zorg ervoor dat u de dia oververhit raken; verdampte film bekleden van de binnenzijde van de kamer met een hydrofobe film die de cellen verhindert hechten. - Gebruik een tang om de schuif van de kookplaat te verwijderen (de slide is heet) en leg het opzij om af te koelen met het dekglaasje zijde naar boven; de slede afkoelt, zal de film weer een witte, opake kleuring.
LET OP: Op dit punt, de dia's zijn klaar om te worden geladen met gekweekte gistcellen. Extra dia's kunnen worden gemaakt op dit punt en opgeslagen in een schone en droge plaats voor onbepaalde tijd.
5. Laden gistcellen in Bereid Flow Chamber Slides
- Ontdooi een bevroren, 200 pl aliquot van Concanavaline A (2 mg / ml in steriele Dih 2 O).
- Voeg ongeveer 100 ul van ontdooid concanavaline A aan elke kamer van het bereide slede pipetteren in een van de open einden. Voeg genoeg Concanavaline A om de kamer te vullen. Hiervoor istep de Concanavaline A wordt getrokken door de kamer via capillaire werking.
- Hang de glijbaan, dekglaasje-vast tussen twee microfugebuis rekken of pennen voor 5 minuten om de Concanavaline A te houden aan het dekglaasje (dat wil zeggen, de kamer).
- Breng de dia naar een dekglaasje-up positie. Was de kamer met 2x het kamervolume (bepaald in stap 5.2 hierboven, ongeveer 200 pl) van synthetisch volledig medium tot de Concanavaline A verwijderen
- Stroming het medium door de kamer, met behulp van de hoek van een papieren handdoek of een filtreerpapier gevouwen te trekken vloeistof uit een einde van de kamer terwijl tegelijkertijd pipetteren verse vloeistof in de andere. Of gebruik een aspirator vacuüm om fluïdum zorgvuldige wijze uit één uiteinde terwijl pipetteren verse vloeistof in de andere.
- Belastingcellen door stromend 2x de volumekamer (ongeveer 200 pi) celsuspensie (uit stap 3.4) met de gerichte stroom method beschreven in stap 5.4.1.
NB: Het doel is om de afbeelding een enkele laag van cellen op het dekglaasje. Daarom is het belangrijk om een celconcentratie klein dat ze niet opstapelen boven elkaar, maar groot genoeg dat er voldoende cellen aanwezig in het veld om de maximale hoeveelheid data per beeldverwerving verzamelen zijn geladen. De optimale celconcentratie in de kamer kan variëren en moet empirisch worden bepaald. De concentratie van cellen in de stroomkamer verhogen voorzichtig pellet de celkweek bij 1000 xg gedurende 2 minuten en verwijder een deel van het supernatant. Om de concentratie van de cellen te verminderen, voeg verse synthetische compleet medium aan de celsuspensie. De celconcentratie kan worden na stap 5.7 (hieronder) door inspectie van de kamer op een fasecontrastmicroscoop. Op dit moment kan extra cellen aan de kamer toegevoegd door stroming in meer celsuspensie. Echter, het verminderen van celdichtheid op dit moment niet haalbaar is en wordt het beste bereikthet plaatsen van een nieuwe kamer met een verdunde celsuspensie. - Hang de slide dekglaasje beneden, zoals beschreven in stap 5.3, gedurende 10 minuten om de cellen te hechten aan het dekglaasje.
- Spoelen eventuele niet-gehechte cellen door te stromen 4x de volumekamer (ongeveer 400 pl) van synthetisch volledig medium. Dit zal elimineren vrij zwevende cellen in de kamer, die beeldacquisitie kunnen besmetten.
- droog zorgvuldig elk uiteinde van de kamer met een schone hoek van een papieren handdoek, waardoor de meniscus aan de rand van het dekglaasje.
- Verzegelt elk uiteinde van de kamer met warm (75 ° C) kit (bijvoorbeeld valap; gelijke delen vaseline, wolwas en paraffinewas).
LET OP: Op dit punt, de schuif is klaar om de afbeelding. De kamers kunnen worden afgebeeld tot 9 uur, afhankelijk van de dichtheid van cellen in elke kamer. De cellen zullen kooldioxide (CO2) in de tijd, die geleidelijk bellen die de cellen verdringen zal leiden produceren.
- Breng de slede een omgekeerde microscoop uitgerust met een 1,45 NA 100X CFI Plan Apo doel, een piëzo-elektrische fase, een draaiende schijf confocale scanner, een belichtingssysteem laser en een camera EMCCD. Houd de temperatuur van het podium kamertemperatuur (25 ° C) tijdens acquisitie.
OPMERKING: De hoge numerieke apertuur maakt een grotere beeldresolutie en de piëzo-elektrische fase ondersteunt snelle z-stack acquisitie. De minimale microscoop eisen zijn 100x objectief, de verlichting laser en de camera EMCCD. - Breng de cellen in focus. Ervoor dat het gebied verwerving tenminste 5-6 cellen geclusterd vormen door de glijbaan voor cellen gegroepeerd.
LET OP: Hoewel het niet nodig is om de afbeelding meer dan één cel per keer, imaging meerdere cellen in hetzelfde veld verbetert de efficiëntie van data-acquisitie, zonder afbreuk te doen aan de kwaliteit van de gegevens. Echter, het is van cruciaal belang dat decellen op hetzelfde brandvlak en niet gestapeld bovenop elkaar. - Programmeer een multi-dimensionale overname om meerdere z-series te verzamelen in de tijd.
- Pas de instellingen in het actieve acquisitie instellingen op: totale Z-diepte = 6 um, de gehele gistcel omvatten; Z-stapgrootte = 300 nm, tot lichtopvang maximaliseren zonder oversampling; totale tijdsduur = 10 min; tijdsintervallen = Z-series elke 4 s; en blootstellingstijd = 90 ms voor elke z-vlak.
OPMERKING: De optimale belichtingstijd is afhankelijk van de camera, de excitatie lichtbron, en andere factoren. 1 verhouding van signaal van GFP-gelabeld stervormig microtubules signaal uit het cytoplasma basis van pixelwaarden gemeten door EMCCD: In het algemeen zal de optimale belichtingstijd de minimale tijd die nodig is om 3 te bereiken.
- Pas de instellingen in het actieve acquisitie instellingen op: totale Z-diepte = 6 um, de gehele gistcel omvatten; Z-stapgrootte = 300 nm, tot lichtopvang maximaliseren zonder oversampling; totale tijdsduur = 10 min; tijdsintervallen = Z-series elke 4 s; en blootstellingstijd = 90 ms voor elke z-vlak.
- Begin met de overname door te klikken op 'Run'. Laat het lopen voor de volledige 10 minuten duren. Sla de gegevens als een afbeeldingseries (.tiff of .nd2).
- Selecteer een nieuw veld om de afbeelding binnen de kamer en herhaal de stappen 6,2-6,4.
OPMERKING: Eén kamer dient tussen 15 en 20 velden cellen opleveren, afhankelijk van de celdichtheid in de kamer. Hogere celdichtheden lager totaalvelden verkregen, als CO2 in de kamer zal opbouwen sneller.
7. Beeldanalyse
- Open de afbeelding-bestand in ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) als een HyperStack met behulp van de bio-formats importeur plugin.
- Open ImageJ en sleep het verkregen beeld stapel uit hoofdstuk 6 rechtstreeks op het bedieningspaneel. De importeur bio-formats wordt automatisch gestart. Selecteer "Ok" om het beeld stack als een HyperStack laden.
OPMERKING: De "Bio-formats Import Options" prompt zal openen en ervoor te zorgen dat onder de "Stack bekijken" sectie, "View stack met:" is ingesteld op "HyperStack"; en "Stack Order:" is ingesteld op "XYCZT."
- Open ImageJ en sleep het verkregen beeld stapel uit hoofdstuk 6 rechtstreeks op het bedieningspaneel. De importeur bio-formats wordt automatisch gestart. Selecteer "Ok" om het beeld stack als een HyperStack laden.
- Samenvouwen elke Z-serie tot een maximum intensiteit, 2-dimensionale projectie met de Z-project functie.
- Selecteer het menu "Beeld", de "Stack" submenu, en de "Z-project" -functie. Selecteer "Maximum projectie" uit het drop-down menu en klik op "OK."
- Breng een mediaan filter om het beeld stack om spikkels ruis te verminderen door het selecteren van het menu "Actie", het submenu "Filters", en de "mediaan" -functie. 2.0 Voer pixels in de straal en klik "Ok."
- Identificeer pre-anafase cellen in het veld.
Opmerking: Deze worden gekenmerkt door middelgrote toppen en een korte mitotische spoel, 1-1,5 urn lang (figuur 1, de pijlpunt wijst naar een korte mitotische spoel). Cellen in dit stadium zijn ideaal voor het analyseren van de dynamiek van microtubuli, omdat ze meestal vertonen slechts een few stervormig microtubuli afkomstige de spindel polen 7. Stervormig microtubuli kan worden geïdentificeerd als lineaire filamenten die een uniforme GFP signaalintensiteit vertonen van het minteken ten SPB, met de plus einde in het cytoplasma. - Vanaf het eerste tijdstip van de afbeelding serie de gesegmenteerde lijn gereedschap om een lijn langs een stervormige microtubule trekken van het minteken, gelegen op de kruising tussen de stervormige microtubule en intenser gemerkte spindle microtubuli, het plusteken , die in het cytoplasma (zie de rode lijnen in figuur 1). Dubbelklik op het uiteinde van de microtubule naar de gesegmenteerde lijn te voltooien.
- Noteer de meting in de tabel met resultaten met behulp van de "maatregel" functie door te drukken op de knop "M" op het toetsenbord.
OPMERKING: Extra functies, zoals grijs intensiteit, kan worden opgenomen door het instellen van de metingen in het menu "Analyse" en submenu "Afmetingen instellen". - Naar het volgende meetpunt door ofwel te klikken op de pijl naar rechts in de Z-slider bar of op de "./>" toets op het toetsenbord. Herhaal stap 7.5 en 7.6 voor alle tijdstippen in de sequentie van beelden.
- Kopieer de gegevens van de tabel met resultaten en plak ze in een spreadsheet. Sla de gegevens door het selecteren van "Opslaan als."
Opmerking: Deze metingen zal een aantal waarden, maar de belangrijkste waarden zijn het segment, die het tijdstip in de reeks aangeeft, en de lengte, waarbij de lengte van de leiding (dat wil zeggen, het stervormige microtubuli) aangeeft. Kolommen met andere metingen (bijvoorbeeld de omgeving, gemiddelde pixelwaarde, hoek, etc.) kunnen ofwel worden bewaard of weggegooid. - Maak een nieuwe kolom in de spreadsheet door rechts te klikken en het gebruik van de functie "Invoegen". Voer de tijd (s) van elk tijdstip.
- Maak een XY scatter plot van microtubule lengte (pm) als functie van de tijd (s) met behulp van de "Lijn invoegenChart" -functie; selecteer lengtemetingen als 'Y' en de tijdkolom als 'X'
- Identificeer gebieden van de polymerisatie, depolymerisatie en pauze door te zoeken naar positieve en negatieve veranderingen in de lengte over de tijd op de scatter plot van stap 7.10.
OPMERKING: Polymerisatie events verhogen microtubule lengte ten minste 0,5 urn in minimaal 3 tijdstippen en past een lineaire regressie met R2 ≥ 0,9 en een R-waarde> 0 (figuur 1B en D, groene punten). Depolymerisatie gebeurtenissen verlagen microtubule lengte van ten minste 0,5 urn in minimaal 3 tijdstippen en past een lineaire regressie met R2 ≥ 0,9 en een R-waarde <0 (figuur 1B en D, roze punten). Pauze gebeurtenissen zijn gescheiden van polymerisatie en depolymerisatie. Pauzes worden gedefinieerd als netto veranderingen in microtubuli lengte kleiner dan 0,5 micrometer in minimaal 3 tijdstippen;past een lineaire regressie met een R-waarde tussen -0,4 en 0,4; en een helling die niet statistisch verschillend van nul, zoals bepaald door een F-test. - Met behulp van de scatter plot als leidraad, identificeren van de secties van de tijd wanneer de lengte verandering positief is en markeer ze in een groene kleur. Markeer regio's van de tijd wanneer de lengte verandering negatief is in een roze kleur.
- Bereken de lineaire regressie van elke gemarkeerde sectie en noteer de R- en R2-waarde voor elke sectie in de kolommen proximaal van de regio. Classificeren elk gekleurd gebied als ofwel een polymerisatie gebeurtenis of depolymerisatie gebeurtenis.
- Identificeer gebieden van de polymerisatie, depolymerisatie en pauze door te zoeken naar positieve en negatieve veranderingen in de lengte over de tijd op de scatter plot van stap 7.10.
- Bereken de polymerisatiesnelheden door de netto lengteverandering te delen door de verandering in de tijd voor elk event groei. Noteer deze resultaten in de kolom naast de lineaire regressie waarden uit stap 7.10.3.
- Bereken de depolymerisatie tarieven netto lengteverandering te delen door de verandering van de tijd voor elke shrinking event. Noteer deze resultaten in de kolom nabij de polymerisatiesnelheid waarden uit stap 7.11.
- Bereken de ramp frequentie door het aantal polymerisatie-to-depolymerisatie overgangen te delen door de totale tijd van alle groeistadia gebeurtenissen 13. Noteer deze resultaten in de kolom nabij de depolymerisatie snelheid waarden uit stap 7.12.
- Bereken de redding frequentie door het aantal depolymerisatie tot polymerisatie overgangen te delen door de totale tijd van alle gebeurtenissen krimp 13. Noteer deze resultaten in de kolom nabij de catastrofe frequentiewaarden uit stap 7.13.
- Bereken de dynamicity door de som van de absolute waarde van lengteveranderingen van de totale duur van de beeldopname, berekend in stap 7.10.1 en vermenigvuldigen met 27,0833 aan tubuline subeenheden per seconde 14 te verkrijgen. Noteer deze resultaten in de kolom naast de redding frequentie valUES vanaf stap 7.14 en de resultaten tafel.
Opmerking: Het is mogelijk om de analyse in de stappen 7,10-7,15 via een op maat gemaakt programma beschreven automatiseren (. Estrem, et al, manuscript ingediend). Het programma is ontworpen om perioden van polymerisatie en depolymerisatie in de lengtemeting te identificeren door de hierboven beschreven parameters.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Het meten van de dynamiek van microtubuli in levende gistcellen biedt een dwingende instrument om te beoordelen hoe mutaties in genen die coderen voor microtubuli regulatoren of tubuline subeenheden invloed polymerisatie en depolymerisatie tarieven, alsmede de frequentie van de overgang tussen deze toestanden. Figuur 1 toont een tijdreeks van stervormige dynamiek van microtubuli in een wildtype cel en een mutante cel met een mutatie in β-tubuline (tub2- 430Δ). Microtubuli worden gelabeld met GFP gemerkte α-tubuline tot microtubuli lengte visualiseren. De rode pijlen traceren van de lengte van de stervormige microtubule dat het beeld (Figure1A en 1C). Microtubule lengten werden gemeten op elk tijdstip gedurende 8 min en deze samengestelde lengtes zijn afgebeeld in leven plots (figuur 1B en 1D). Deze gegevens werden gebruikt om de polymerisatiesnelheid, depolymerisatie snelheid polymerisatie durati bepalenop, depolymerisatie duur, redding frequentie, ramp frequentie en dynamica.
Figuur 1. Time-lapse beeldvorming van GFP-gelabelde microtubuli en Metingen van Astral dynamiek van microtubuli. (A en C) De eerste vijf opeenvolgende beelden van time-lapse beeldverwerking met het wild-type en mutante tub2 -430Δ cellen. Microtubuli zijn gelabeld met GFP-Tub1 en afgebeeld in de pre-anafase van de celcyclus. Elk beeld is een maximum-intensiteitsprojectie van een confocale Z-serie. Schaalbalken: 1 um. Tijdstempels toont de totale tijd in elk frame acquisitie. De rode pijlen volgen over de gehele lengte van een stervormig microtubule, de pijlpunten aanduiding van de plus uiteinden. (B en D) Microtubuli leven plots tonen de lengtes van enkele stervormige microtubuli tijd. De groene punts duiden polymerisatie en de depolymerisatie roze punten duiden. De pijlpunten wijzen naar catastrofe gebeurtenissen. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 1 toont een gewijzigde microtubuli tussen een wild-type stam en een mutantstam zonder de 27 aminozuren van β-tubuline op de C-terminal, een mutant die eerder aangetoond was stabielere microtubuli 15 hebben. Zoals weergegeven in de microtubule leven plots de microtubule in tub2 -430Δ mutant meer en vertoont minder rampen dan het wildtype microtubuli (figuur 1B en D pijlpunten; Tabel 1). Bovendien, de polymerisatie en de depolymerisatie tarieven, bepaald uit de hellingen van de stijgende en dalende microtubule lengths, nemen af in de mutant in vergelijking met het wildtype (figuur 1B en 1D; Tabel 1). Tenslotte de microtubule in tub2 -430Δ mutante cel brengt meer tijd in staten van polymerisatie en depolymerisatie en heeft dynamicity verminderd vergeleken met het wild-type (tabel 1).
| spanning | Dynamica (subeenheden / s) | Polymerisatiesnelheid (um / min) | % Tijd in Polymerization | Depolym rate (um / min) | % Tijd in Depoly- merization | % Tijd in Pauze | Rescue frequentie (events / min) | Catastrofe frequentie (events / min) |
| Wildtype n = 1 | 54 | 1,8 ± 0,5 | 48 | 3,0 ± 0,3 | 29 | 3 | 1.8 | 1.4 |
| tub2-430Δ n = 1 | 40 | 1.4 ± 0.1 | 41 | 1.5 ± 0.2 | 32 | 0 | 0.8 | 0.7 |
| Afkortingen zijn als volgt: um, micron; min minuten; s seconde; n, enkele microtubule geanalyseerd microtubule leven plot (Fig1B, D). Waarden zijn gemiddelden ± standaard fout van het gemiddelde. | ||||||||
Tabel 1: microtubuli Metingen Cellen in figuur 1. De waarden zijn het gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde van metingen van de enkelvoudige microtubuli figuur 1.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De gist model biedt grote voordelen voor het verzamelen van hoge-resolutie metingen van de dynamiek van microtubuli in een in vivo setting, inclusief de mogelijkheid om enkel beeld microtubules loop van de tijd en het vermogen om tubulines en microtubule toezichthouders gebruik van de tools van gist genetica te manipuleren.
De concanavaline A-beklede kamers bieden een aantal voordelen ten opzichte van eerder beschreven inrichtingen, met inbegrip van gesmolten agar pads. Objectglaasjes met kamers kunnen vooraf worden gemaakt en opgeslagen op lange termijn of kan direct worden gebruikt. Bovendien, de Concanavaline A gecoate kamers kunnen kweken gistcellen gedurende> 6 uur in hetzelfde medium waarin de cellen oorspronkelijk gekweekt. Het is belangrijk op te merken dat het aantal cellen in de kamer zal bepalen hoe lang de kamer kan worden afgebeeld. De beklede kamers gekozen dat slechts enkele laag gistcellen zich aan het dekglaasje. Tenslotte maken van meerdere kamers maaktverschillende giststammen worden afgebeeld op dezelfde dia.
Er zijn grote uitdagingen om de dynamiek van microtubuli beeldvorming in gist, met inbegrip van relatief lage signaal niveaus en de zeer dynamische aard van het proces. Groothoek microscopen zijn geschikt voor het vastleggen van single-tijdstip beelden van gelabeld microtubules. Echter, groothoek microscopie veroorzaakt sneller fotobleek door langere belichtingstijden en het bombardement van het monster met een out-of-focus licht. Evenzo laser scanning confocale microscoop ontoereikend vanwege de snellere fotobleken. Draaiende schijf confocale microscopie is bij uitstek geschikt voor de beeldvorming van de dynamiek van microtubuli in gist. De draaiende schijf confocale microscoop systeem hier gebruikt is ontworpen met deze eisen in het achterhoofd.
De microscoop systeem moet worden ontworpen voor hoge snelheid en hoge gevoeligheid. Hoewel er diverse soorten microscoop die geschikt kan blijken, verschillende onderdelen zijn essentieel. Een 100Xobjectief met een hoge numerieke apertuur (1.45NA) is nodig om individuele microtubules en lengteveranderingen lossen in de orde van 100 nm. Een draaiende schijf confocale scanner moet minimaliseren fotobleken en toxiciteit, door het blokkeren out-of-focus licht, en de resolutie en de gevoeligheid maximaliseren door het verzamelen uitsluitend in-focus licht. De EMCCD camera moet snel en gevoelig genoeg GFP-signaal Tub1 verzamelen tijdens elke 90 ms van de time-lapse acquisitie. Op dit moment, EMCCD camera's zijn de beste keuze voor deze toepassing. Huidige CMOS-sensor camera's missen de gevoeligheid van high-end EMCCDs; echter, wordt deze technologie aanzienlijk verbeterd en kan binnenkort geschikt zijn. Ten slotte wordt een piëzo-elektrische fase die nodig is voor een snelle en nauwkeurige beweging in Z, dat de snelheidsbeperkende stap in de vier-dimensionale afbeelding acquisitie kan zijn.
De specifieke microscoopsysteem beschreven in dit protocol kan een belemmering vormen als gelijkwaardig apparaat is niet beschikbaar. wijzigingen cEen worden naar verschillende beeldvormingssystemen nemen, maar deze modificaties ten koste van tijdelijke en / of ruimtelijke resolutie hebben. A-spindel aangedreven fase motor kan worden gebruikt in plaats van de piëzo-elektrische fase. Echter, deze motoren zijn trager, minder nauwkeurig, en gevoelig voor drift. Postacquisitie-beeldstabiliteit plug-ins worden gebruikt om de drift in de XY afmetingen in verband met deze motor aangedreven fasen te minimaliseren. Bovendien kunnen alternatieve camera's met lagere snelheden uitlezing worden gebruikt. Om een tragere acquisitie snelheid tegemoet te komen, kan Z-serie minder vaak te worden verzameld (dat wil zeggen, meer tijd tussen de Z-serie). Echter, het verhogen van de tijd tussen de Z-serie's ontbrekende overgangen die kunnen optreden tussen tijdstippen. Als alternatief kan de afstand tussen Z-vlakken worden verhoogd als manier verminderen van het aantal beelden verzameld per Z-series. Echter, het verhogen van deze afstand dreigt te verliezen beeldinformatie tussen vliegtuigen, die het vermogen van de experimentator te accur zal aantastendellijk te identificeren microtubule eindigt. Het is duidelijk dat wijzigingen worden aangebracht om alternatieve beeldvormende systemen tegemoet te komen, maar deze wijzigingen dienen te worden afgewogen tegen het mogelijke verlies van beeldinformatie.
Een andere beperking van dit protocol is het verlies aan ruimtelijke informatie bij driedimensionale afbeeldingsstapels omgezet in tweedimensionale beeld uitsteeksels. Een individuele stervormig microtubule in een pre-anafase gistcel ligt typisch tussen 0,5 en 2,0 urn lang en projecten in de driedimensionale ruimte van het cytoplasma. Het is daarom van groot belang te verwerven beelden van een reeks Z-posities van alle ruimtelijke informatie van een individu microtubule verzamelen. In een time-lapse acquisitie, kan dit een complexe dataset te produceren met 20 Z-segmenten bij elk van de 150 tijdstippen, voor een totaal van 3000 afbeeldingen. Om deze uitdaging aan te pakken en de beeldanalyse te vereenvoudigen, is de ruimtelijke informatie van de Z-stacks samengedrukt tijdens de analyse. Hoewel deze benefzijn analyse gaan ten koste van ruimtelijke informatie van de Z-dimensie. Hoeveel informatie verloren gaat als de Z-dimensie wordt gecomprimeerd? Om dit verlies te schatten, werden experimenten uitgevoerd om de afstand tussen SPBs meten pre-anafase cellen, die relatief eenvoudig te meten omdat Spc110-GFP-gemerkte SPBs vertonen bolvormige foci met hoge signaal-ruisverhoudingen zijn. Hoewel de spil verschillende verplaatsing in Z dan stervormige microtubuli kan vertonen, de gemiddelde lengte gelijk (-1,5 urn) en biedt daarom een bruikbare aanwijzing. Spindel lengten gemiddeld 15% langer gemeten in volledig driedimensionale afbeeldingsstapels dan wanneer dezelfde spillen worden gemeten tweedimensionale projecties (JM, niet gepubliceerde resultaten). Aldus moet het voordeel van de vereenvoudigde set gegevens en metingen worden afgewogen tegen de kosten van afgedankte Z informatie.
De gist celbiologie gemeenschap heeft een veelzijdige toolkit voor imaging microtubule networ ontwikkeldks. Dit omvat een verscheidenheid van fluorescente proteïnen gefuseerd aan a-tubuline / Tub1 en gemerkt met verschillende auxotrofe merkers. Deze constructen omvatten LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, welke bevat het chromosomale LEU2 locus, en een aantal fusies met GFP en andere fluoroforen, die wordt geïntegreerd op de URA3-locus, zoals URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-CFP) en URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. Daarnaast is een aantal Tub1 fusies met verschillende fluorescerende eiwitten recentelijk aangemaakt die doelstelling integratie ofwel de chromosomale locus URA3 of op een plaats aangrenzend aan het natieve locus TUB1 18. Deze uitgebreide palet van fluoroforen en markers is zeer nuttig voor co-lokalisatie experimenten met differentieel gelabelde eiwitten. De GFP-Tub1 fusie blijft de beste tool voor de time-lapse beeldvorming van microtubule dynamiek vanwege de helderheid en fotostabiliteit. De GFP-Tub1 fusie gecreëerd door Song & Lee (pSK1050) 11 bevat een fusie van GFP aan het amino-uiteinde van α-tubuline / Tub1 en integreert in het LEU2 locus in leucine auxotrofie redden. Zo wordt het fusie-eiwit ectopisch tot expressie gebracht naast natieve α-tubuline en omvat ~ 20% van de totale α-tubuline in de cel 9. Belangrijk is dat de GFP-Tub1 fusie niet de functie van inheemse α-tubuline / Tub1 (JM, niet-gepubliceerde resultaten) te redden. Dit geldt ook voor andere TUB1 fusieconstructen 18.
Met de beschikbare instrumenten aan microtubuli en hun bindende eiwitten te visualiseren, gist is een ideaal systeem om mutaties in tubulines en andere microtubule toezichthouders bestuderen. Bovendien, het beperkte aantal tubuline genen maakt het directe onderzoek van een homogene pool van mutant tubuline. Naast de mutaties intubuline genen, gist heeft een aantal microtubulus geassocieerde eiwitten (MAPs) die homoloog metazoan tegenhangers. Deze kaarten kunnen direct worden bestudeerd, en de effecten die mutaties hebben op een enkele microtubule filamenten kunnen ook worden onderzocht. Het protocol hier beschreven maakt het mogelijk voor het onderzoek van zowel de intrinsieke en extrinsieke processen die de dynamiek van microtubuli beïnvloeden.
Samenvattend moet microtubules dynamisch tijdens de vele cellulaire processen om goed te functioneren. Het is noodzakelijk om de factoren die eigen zijn aan tubuline en de extrinsieke eiwitten, die onder de dynamica van microtubuli te reguleren begrijpen. Gist is een ideaal systeem om het effect van deze factoren te bestuderen door het direct kwantificeren van de dynamiek van een enkele microtubule. Het protocol hierboven gedetailleerd beschreven hoe een fluorescerend fusieproteïne stabiel te integreren in het gistgenoom en hoe te verwerven en analyseren beeld confocale stapels microtubuli dynamiek in vivo kwantificeren
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen.
Acknowledgments
Wij danken Kerry Bloom (Universiteit van North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University) en Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) voor het delen van diverse FP-TUB1 plasmiden. We zijn dankbaar voor Melissa Gardner (Universiteit van Minnesota) voor ons trainen in de schuif kamer bereidingswijze. Dit werk werd ondersteund door de National Institutes of Health (NIH) verlenen R01GM112893-01A1 (naar JKM) en T32GM008730 (CE).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100 mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
