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Biology

高分辨率成像和芽殖酵母个人星体微管动力学分析

doi: 10.3791/55610 Published: April 20, 2017

Summary

出芽酵母是研究体内微管动力学由于其强大的遗传学和其微管骨架的简单性的有利的模型。以下方案描述了如何变换和培养的酵母细胞,获得共焦显微镜图像,和定量分析在活酵母细胞的微管动力学。

Abstract

动态微管是许多细胞过程的根本,微管动力学的精确测量可以提供深入了解细胞如何调节这些过程和突变的影响如何调控基因。微管动力学的后生动物模型的量化有许多相关的挑战,包括高密度微管和限制遗传操作。相比之下,芽殖酵母模型提供了克服这些挑战的优势。这个协议描述来测量在活酵母细胞单个微管的动力学的方法。表达荧光标记的微管蛋白的细胞粘附到组装的滑动室,从而允许稳定的隔时图像采集。用于高速的详细指南,四维图像采集本发明还提供,以及用于在共焦图像栈量化动态微管的性质的协议。该方法中,结合常规酵母遗传学省IDES了一种方法,是唯一适合用于定量评估该改变微管蛋白亚单位的活性的微管调节剂或突变的影响。

Introduction

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微管是由αβ微管蛋白的蛋白质亚基的细胞骨架的聚合物和在多种细胞环境中,包括胞内转运,细胞分裂,形态发生和运动性的被使用。要建立微管网络对于这些不同的角色,细胞必须仔细调节何时何微管形式。这种调节是通过控制反应完成,要么组装αβ微管蛋白亚基插入微管聚合物或拆卸的微管转化为游离亚基;这被称为微管动力学。

微管字段的一个主要目标是阐明调节微管动力学,包括结合于微管蛋白和/或微管的αβ微管蛋白亚单元和外在调节研究的分子机制。行之有效的实验方法是在体外用纯化的αβ微管蛋白的蛋白质在COM重建该系统中,常常bination用纯化的外在调节器。虽然这是一个有用的方法,很显然,在重构的系统微管动力学从活细胞中观察到的强烈不同。例如,微管生长更快和收缩体内体外慢。这些差异可以归因于已知的外在调节器1的可用性,以及在细胞中尚未未定义的因素。因此,关键是要确定微管调节剂和破坏在天然细胞环境动力学突变体的活动。

虽然后生动物模型已经被证明是研究微管功能和高阶组织现行制度,有几个实际问题严重限制了这些模型的效用微管动力学的精确测量。首先,大量的微管,从几十到上千个细胞,使其难以理直气壮跟踪单个微管随着时间的推移。许多研究通过成像选择性定位于微管的端部,如在端部结合(EB)家族蛋白的蛋白应对这一挑战。然而,这些蛋白质是已知的唯一定位于在后生动物2生长微管的端部。因此,这些蛋白质的效用是有限的,以直接测量生长速率,而只有间接测量动力学的其他方面,诸如灾难的频率。其次,尽管在基因组编辑技术的进步,产生稳定表达荧光标记的微管蛋白或引入突变,以选择性地操纵微管蛋白的微管或调节细胞仍然是一个挑战显著。此外,许多微管蛋白同种型的后生动物存在混淆的突变如何影响个人微管蛋白基因的研究。

芽殖酵母系统提供几个重要的优点用于体内 microtubu测量乐动态。酵母具有简化的微管网络,它允许个别微管的可视化。在酵母中,微管从组织称为纺锤体极体(SPBS),其被嵌入在核膜3中心发出。所述SPBS用作支架用于该成核微管4,5γ微管蛋白小复合物。 SPBS核两类微管,纺锤体微管及微管星体的。纺锤体微管伸入和核质是重要的,用于经由微管的着丝点附连到染色体和用于经由重叠极间微管6稳定主轴。相比之下,微管星体向外项目进入细胞质,并比较少见相比纺锤体微管的密集网络。在有丝分裂,预后期细胞具有1-2只从任一SPB发出星体微管;这些都是普通的Individual微管,而不是作为束7。星体微管的有丝分裂过程中的作用是细胞核和主轴移动到母亲和芽的隔间,被称为芽颈部之间的交界处。这种运动包括良好定义的途径上星体微管生成的力,拉细胞核和主轴朝向并最终进入芽颈部8。

酵母系统的另一个优点是它的遗传学,其可用于研究的微管调节剂和微管蛋白亚单位具有无可比拟的精度的效用。酵母也具有微管蛋白同种型的简化剧目:单β微管蛋白基因(TUB2)和两个α微管蛋白基因(TUB1TUB3)。突变可以容易地引入这些基因,从而以均匀的微管蛋白人口9,10研究。有许多的广泛对于标签的微管结构可用,而且这些设置可以针对在染色体位点稳定表达的整合(见讨论)。

该方法的总的目标是图像单个微管在活酵母细胞在四个维度(X,Y,Z和T​​)为微管动力学的高分辨率测量。用于荧光标记的微管蛋白在酵母细胞中的组成型,低水平表达整合构建体的方法进行说明。在成像之前,活细胞被安装到已经涂覆了凝集素伴刀豆球蛋白A,以稳定长期成像细胞的滑动室。用于图像采集的最佳参数,以及对数据进行分析的工作流,也有所说明。

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Protocol

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1.准备-Leu降板

  1. 添加800毫升的无菌去离子水(DIH 2 O)到2L烧瓶中。添加26.71克漏失碱(DOB)粉末,0.69克CSM-的Leu,和20g琼脂。用磁力搅拌棒混合。带来至1L DIH 2 O.
  2. 高压釜在121℃和19磅30分钟。
  3. 除去从高压釜的烧瓶中,并使其冷却至〜65℃,温和搅拌。
  4. 倾30毫升/板放入100mm直径板。让这些坐在室温下36-48小时,在4℃下储存之前。

2.整合GFP-TUB1的GFP标记的微管蛋白的组成型表达

  1. 煮沸的10毫克/毫升的单链DNA(ssDNA)的储备浓度3分钟。
  2. 结合煮沸ssDNA的2μL与400ng的纯化GFP-TUB1质粒DNA 11。
    注:有多种质粒可用于稳定,荧光标记在酵母中利用替代的荧光团和选择性标记微管。其中一些替代品的讨论部分描述。
  3. 的DNA混合物中加入感受态酵母细胞的50微升等分试样。
    注:准备感受态酵母细胞与山梨糖醇溶液(SORB; 100mM的LiOAc,10mM的Tris-盐酸pH为8,1mM EDTA中的pH 8,和1M山梨糖醇,用稀乙酸调节至pH 8)。制备感受态酵母细胞的详细描述,请参见参考12。
  4. 涡彻底。
  5. 加入6倍的聚乙二醇(PEG)溶液(100mM的LiOAc,10mM的Tris-盐酸pH为8,1mM EDTA中/ NaOH调节pH为8,和40%PEG3350)至DNA-细胞混合物的总体积。
  6. 涡彻底。
  7. 孵育在30℃下温和搅拌至少1小时。
  8. 二甲基亚砜(DMSO)添加到总体积和涡流的10%。
  9. 孵育在42℃下15分钟。
  10. 离心机中以2500×g离心5分钟。
  11. 2 O的
  12. 板单元上的压降-Leu板。
    注:GFP-TUB1结构中含有亮氨酸营养缺陷型标记,而其他的构造可以使用一个替代指标。漏失介质应该是特定于构建体的营养缺陷型标记。
  13. 允许转化的细胞在30℃下3-5天生长。
  14. 在新鲜-Leu漏失板重新条纹单一转化菌落通过使用高压灭菌牙签转移菌落。过夜孵育所述板在30℃下。
  15. 通过从单菌落从平板在步骤2.14中的水2μL,在一个干净的载玻片悬浮大约1细胞μL目视筛选每个转化为GFP信号。覆盖悬浮细胞用盖玻片并用荧光显微镜观察。
    1. 激发转化用488nm的光,并寻找一个GFP信号的存在。

3.成长液体酵母培养物

  1. 接种的酵母细胞的〜1μL从单菌落上在3mL的合成完全培养基的板。使细胞以250rpm振荡在30℃下生长过夜。
  2. 稀释饱和培养翌日所述介质中的<0.1 OD 600。返回稀释的培养到30℃的振荡3-4小时或直至OD 600为0.4和0.8之间,当细胞准备被装载到成像室中。

4.准备流室幻灯片

  1. 切在长石蜡膜在宽的片材成片4和7。
  2. 放置一个标准显微镜载玻片上纵向石蜡膜的4英寸的宽度和缠绕3-4次,使得滑动被覆盖在膜是3-4层厚的载玻片上的膜。按层一起,以确保有一个合理的密封;这将使它更容易削减。请勿按压太硬或使膜起皱。
  3. 切割沿使用清洁盒切刀剃刀滑动件的外侧边缘上的石蜡膜。使用另一张幻灯片,以用于切割提供直边。
  4. 剥离多余的膜从上述工作滑动并丢弃。的膜的剩余堆叠将覆盖滑动的一个面,将被用来制造成像腔室之间的壁。
  5. 使用所述第二幻灯片作为直边,切割堆叠的薄膜层沿着滑动的长轴成大约10条,每2-4毫米宽。
  6. 垂直地切断层叠石蜡薄膜层到在步骤4.5制成,沿着滑动的短轴的切口,以创建条2-4毫米宽,23-24毫米长,和3-4层厚。
  7. 剥离使用剃刀以45°角切割的条带。使用镊子,均匀地分布在一个干净的显微镜载片切割薄膜条创建的腔室所需的数字。至多3个腔室(带4个石蜡膜带制成)可在一个载片被创建。
  8. 放置的薄膜条带的顶部上的单盖玻片并将其与镊子移动到位。
  9. 放置准备好的滑动,盖玻片起来,在设定在95〜℃的加热板上(这大约是在大多数电炉低介质设置)。加热滑动直到薄膜条带是半透明的(大约3分钟),然后密封所述滑动件和由与所述镊子盖玻片轻轻按压盖玻片一起。
    注意:这是仅在直接上方的石蜡膜条带盖玻片的区域按重要的,因为刮擦上述c的区域hambers会降低图像质量。小心不要过热幻灯片;汽化的薄膜将涂覆室的内部有防止细胞粘附的疏水性膜。
  10. 使用镊子从加热板除去所述滑动件(滑动会热)并放在一边与盖玻片面朝上冷却;作为滑动冷却时,该膜将返回到白色,不透明的着色。
    注意:此时,幻灯片已经准备好装载培养的酵母细胞。额外的幻灯片,可向这一点,并存储在一个干净,干燥的地方无限期量。

5.安装酵母细胞制备成流室幻灯片

  1. 解冻伴刀豆球蛋白A(2毫克/毫升在无菌DIH 2 O)的冻结,将200μL等分试样。
  2. 通过吸取到开放端中的一个添加约100μL解冻伴刀豆球蛋白A的所制备的载玻片的每个室。加入足够的伴刀豆球蛋白A,以填补室。对于这个STEP,在伴刀豆球蛋白A将通过经由毛细管作用室中拉出。
  3. 挂滑动,盖玻片向下两个离心管架或笔之间5分钟,以允许所述伴刀豆球蛋白A粘附在盖玻片( 即,腔室)。
  4. 返回幻灯片盖玻片上位置。用2x洗涤腔室中的腔室体积(在步骤5.2,以上确定的;约200微升)的合成完全培养基的除去伴刀豆球蛋白A.
    1. 通过腔室的流动介质,使用纸巾的任角落或对半折叠滤纸以将流体从室的一端的同时吸取新鲜流体到另一个。可替代地,使用真空吸气器仔细吸取流体从一端的同时吸取新鲜流体到另一个。
  5. 称重传感器通过使用定向流流动方法具2倍的细胞悬浮液(来自步骤3.4)的腔室容积(约200μL)D IN步骤5.4.1说明。
    注意:我们的目标是在图像盖玻片细胞的单层。因此,加载细胞足够小,它们不会桩上彼此的顶部,但足够大,足够的细胞存在于字段来收集每图像采集的最大数据量的浓度是重要的。细胞的腔室中的最佳浓度可以变化,并应根据经验确定。为了提高细胞的浓度在流动室,在1,000×g下轻轻沉淀细胞培养物2分钟,并除去一些上清液。为了降低细胞的浓度,新鲜的合成完全培养基添加到细胞悬浮液。细胞的浓度可通过在相差显微镜检查室(见下文)步骤5.7之后进行评估。在这一点上,附加的细胞可以通过在多种细胞悬浮液流向被添加到腔室中。然而,减少细胞密度在这一点上是不可行的,并最好地实现通过加载新的腔室用稀释的细胞悬浮液。
  6. 挂在滑动盖玻片向下,如在步骤5.3所描述的,10分钟,以使细胞附着在盖玻片。
  7. 由流过4倍的合成完全培养基的腔室容积(约400微升)冲洗掉未粘附的任何细胞。这将消除在腔室自由浮动的细胞,这可能污染图像采集。
  8. 仔细干燥用纸巾的干净的角腔室的每个端部,使所述弯月面到盖玻片的边缘。
  9. 密封用温水(75℃)密封剂室的每个端部( 例如,VALAP;等份凡士林,羊毛蜡和石蜡)。
    注意:此时,幻灯片准备图像。所述腔室可被成像多达9个小时,这取决于在每个室中的细胞密度。细胞将产生二氧化碳(CO 2)随着时间的推移,这将逐渐创建置换细胞气泡。

  1. 使滑动到装有1.45 NA 100X CFI计划的Apo目的,压电阶段,旋转盘共聚焦扫描仪单元,照明激光器和照相机EMCCD倒置显微镜。维持阶段的在室温(25℃)采集期间的温度。
    注意:高数值孔径允许更大的图像分辨率,并且压电阶段可实现高速Z堆叠采集。最小显微镜要求是100X物镜,照射激光,并且EMCCD相机。
  2. 使细胞成为关注的焦点。确保采集字段具有通过搜索分组在一起细胞滑动聚类在一起的至少5-6细胞。
    注意:虽然没有必要对图像多于一个小区更多的时间,成像多个小区在同一领域提高了数据采集的效率而不会损害数据质量。然而,这是关键细胞在同一焦平面,而不是堆积在彼此的顶部。
  3. 程序的多维采集随着时间的推移,收集多个z系列。
    1. 调节活性采集设置为以下范围内的设置:总Z深度= 6微米,以包含整个酵母细胞; Z-步长大小= 300纳米,以最大化光收集没有过采样;总持续时间= 10分钟;时间间隔= Z系列每4秒;和曝光时间=对于每个z平面90毫秒。
      注:最佳曝光时间将根据照相机,激发光源,和其它因素而有所不同。通常,最佳曝光时间将是实现了3所需的最小时间:从GFP-标记的星体微管信号的1比从基于由所述测量EMCCD像素值细胞质到信号。
  4. 通过点击“运行”开始采集。允许它为完整的10分钟时间运行。保存数据作为图像系列(.TIFF或.nd2)。
  5. 在室内选择一个新的领域,以图像,并重复步骤6.2-6.4。
    注意:单个腔室应产生细胞的15和20之间的领域,根据腔室中的细胞密度。更高的细胞密度将产生较低的总的字段,作为CO 2在腔室将更快建立。

7.图像分析

  1. 打开的ImageJ(图像文件https://imagej.nih.gov通过使用生物格式进口商插件),为hyperstack。
    1. 开放的ImageJ并拖动从部分6所获取的图像堆栈直接到控制面板。生物格式进口商将自动启动。选择“OK”来加载图像堆栈作为hyperstack。
      注意:“生物格式导入选项”的提示将打开,并确保“堆栈查看”部分,在“查看栈:”设置为“Hyperstack”;和“堆叠顺序:”设置为“XYCZT。”
  2. 折叠每个Z系列到使用Z-项目功能的最大强度,二维投影。
    1. 选择“图像”菜单,在“堆栈”子菜单,“Z-项目”功能。从下拉列表中选择“最大投影”,然后单击“确定”。
  3. 应用中值滤波器的图像堆栈通过选择“过程”菜单,“过滤器”子菜单中,和“中值”功能来减少散斑噪声。输入2.0像素成方圆框,然后点击“确定”。
  4. 确定在该领域前后期的细胞。
    注意:这些的特征在于中型芽和短有丝分裂纺锤体,1-1.5微米的长度( 图1;箭头指向一个短有丝分裂纺锤体)。在此阶段细胞是理想的用于分析的微管动力学,因为它们通常表现出仅一个FE发出的纺锤极7瓦特星体微管。星体微管能够被识别为表现出均匀的GFP信号强度从负端,在SPB,到正端,在细胞质中线性长丝。
  5. 开始在图像序列的第一时间点,使用所分割的线路工具画沿着单个星体微管的管线,从负端,位于所述星体微管和更强烈标记纺锤体微管之间的连接处,向正端,这是在细胞质中(参见图1中的红线)。对微管的末尾双击即可完成分割线。
  6. 记录使用“测量”功能通过按下键盘上的“M”按钮,在结果表中的测量。
    注:其他的功能,如灰色的强度,可以通过在“分析”菜单中设置的测量和“设置测量”子菜单被记录。
  7. 通过单击在Z滑块向右箭头或按下键盘上的“./>”键前进到下一个时间点。重复步骤图像序列中的所有时间点的7.5和7.6。
  8. 数据结果表中复制并粘贴到电子表格中。通过选择保存数据“另存为”。
    注意:这些测试将包括多个值,但最重要的值是切片,这表明该系列中的时间点,长度,这表明该线( 星体微管)的长度。含有其它测量列( 例如,区域,平均像素值,角度 )可以被保持或丢弃。
  9. 创建通过右击并使用“插入”功能的电子表格的新列。输入每个时间点的时间(s)。
  10. 创建使用“插入线微管长度(μm)的作为时间(s)的函数的XY散点图图表”特征;选择的长度测量为‘Y’和时间列为‘X’。
    1. 通过寻找长度随着时间的推移从步骤7.10散点图正负变化确定聚合,解聚,和暂停的区域。
      注:聚合事件由至少0.5μm的微管增加长度跨越至少3个时间点和适合的线性回归用的R 2≥0.9,R值> 0( 图1BD,绿点)。解聚的事件跨至少3个时间点由至少0.5μm的微管减小长度和适合的线性回归用的R 2≥0.9和R值<0( 图1BD,粉红色点)。暂停事件是从聚合和解聚分开。停顿被定义为小于0.5μm跨越至少3个时间点的微管长度的净变化;适合与-0.4和0.4之间的R值的线性回归;和具有斜面,是不是从零统计学差异,如通过F-检验确定。
    2. 使用散点图为指导,确定的时间段时长的变化是积极的,并强调他们在一个绿色。突出的时区时的长度变化是在粉红色的彩色负片。
    3. 计算各线性回归突出显示的部分,并记录R-和R 2 -值在列接近的区域每个部分。分类每个色区域,可以是聚合事件或解聚的事件。
  11. 除以长度的净变化通过改变在时间上对每个生长事件计算聚合率。记录这些结果列相邻的线性回归值从步骤7.10.3。
  12. 除以长度的净变化通过改变在时间上对每个shrinkin计算解聚速率摹事件。记录这些结果列相邻于聚合速度的值从步骤7.11。
  13. 通过所有的生长事件13的总时间除以聚合到解聚的转变的数目计算灾难频率。记录这些结果列相邻的解聚速率值从步骤7.12。
  14. 通过所有收缩事件13的总时间除以解聚到聚合转变的数量计算出的救援频率。记录这些结果列相邻于灾难频率值从步骤7.13。
  15. 除以由图像获取的总持续时间的所有长度的变化,在步骤7.10.1中计算出的绝对值的总和,并且通过27.0833相乘以获得每秒14微管蛋白亚单位计算动态性。记录相邻的救援频率VAL这些结果列从步骤7.14的UE并保存结果表。
    注意:这是可以自动在使用定制的程序步骤7.10-7.15所描述的分析方法(Estrem,等人 ,手稿提交)。该方案旨在通过按照上述详细描述的参数,以确定在所述长度测量聚合和解聚的周期。

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Representative Results

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在活酵母细胞测量微管动力学提供了令人信服的工具,以评估在编码微管调节剂或微管蛋白基因中的突变如何亚基冲击聚合和解聚率,以及这些状态之间的过渡频率。 图1显示在野生型细胞中的时间序列的星体微管动力学的和β微管蛋白具有突变的突变型细胞(tub2-430Δ)。微管标记有GFP标记的α微管蛋白可视化微管的长度。红色箭头跟踪每个图像(Figure1A和1 C)在微管星体的长度。微管的长度分别在每个时间点8分钟测量,并且这些编译长度在寿命的图线( 图1B1D)所描绘的。这些数据被用于确定聚合反应速率,解聚速率,聚合durati上,解聚持续时间,救援频率,频率的灾难,和动态性。

图1
图1. GFP标记的微管和星芒微管动力学的测量的成像定时。 (AC)的时间推移成像的野生型和TUB2-430Δ突变体细胞的前五个连续图像。微管标记有GFP-TUB1并在细胞周期的预后期成像。每个图像是由共焦Z系列的最大强度投影。比例尺:1微米。时间戳示出了在每一帧采集的总时间。红色箭头沿星体微管的总长度按照与箭头表示的加结束。 (BD)微管寿命曲线随着时间的推移显示单星体微管的长度。绿点小号表示聚合和粉红色点表示的解聚。该箭头指向灾难事件。 请点击此处查看该图的放大版本。

图1显示野生型菌株和缺乏C末端上β微管蛋白的27个氨基酸的突变株,先前显示出具有更稳定的微管15的突变体之间改变的微管动力学。如显示在微管寿命的图线,在TUB2-430Δ突变体微管是长和灾难比野生型微管( 图1BD箭头; 表1)显示出更少。此外,在聚合和解聚率,从上升的斜坡和下降微管楞确定部份,在所述突变体与野生型(; 表1 图1B1D)降低。最后,在TUB2-430Δ突变细胞微管花费更多的时间在聚合和解聚的状态和相对于野生型( 表1)减小动态性。

应变 动态性(亚基/ s)的 聚合反应速率(μm/分钟) %时间聚合 Depolym速率(μm/分钟) 在Depoly-%时间
merization
%时间暂停 救援频率(次/分钟) 巨灾频(EV已废除/分钟)
野生型n = 1的 54 1.8±0.5 48 3.0±0.3 29 3 1.8 1.4
tub2-430Δn = 1的 40 1.4±0.1 41 1.5±0.2 32 0 0.8 0.7
缩写如下:微米,微米;分钟,分钟; S,第二; N,单个微管的微管从生活的情节(Fig1B,D)进行分析。值是平均值±平均值的标准差。

表1:微管动力学的测量为在图1中的细胞的值是平均值±从图1中所示的单个微管的测量的平均值的标准误差。

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Discussion

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芽殖酵母模型聚集在体内环境的微管动力学的高分辨率测量,包括对时间的能力,形象单一微管和操纵使用酵母遗传学的工具,微管蛋白和微管监管机构的能力提供了重要的优势。

所述涂覆的伴刀豆球蛋白室提供许多优于先前所描述的设备中,包含熔化的琼脂垫。与腔室玻片可以被预先制成并存储长期或可以立即使用。此外,该涂覆的伴刀豆球蛋白室能够培养的酵母细胞中,其中细胞最初培养相同的培养基> 6小时的。需要注意的是,室内的细胞数量将决定室多久可以成像是很重要的。将涂覆的腔室确保只有酵母细胞的单层附着在盖玻片。最后,创建多个室允许几种不同的酵母菌株,以在同一滑动成像。

存在要成像的微管动力学在芽殖酵母,包括相对低的信号电平与该过程的高度动态性质的主要挑战。广角显微镜是足够的捕捉标记微管的单时间点的图像。然而,宽视场显微镜导致更快由于更长的曝光时间,并与失焦光的样品的轰击光漂白。同样地,激光扫描共焦显微镜不足以由于更快的光漂白。旋转盘共聚焦显微镜是唯一适用于在芽殖酵母成像微管动力学。这里使用的旋转盘共聚焦显微镜系统被设计时考虑到了这些要求。

显微镜系统必须被设计用于高速和高灵敏度。虽然各种显微镜系统可以证明合适的,几个部件是必要的。 100倍具有高数值孔径(1.45NA)的目标是要解决100纳米的数量级上单独的微管和长度的变化。甲旋转盘共聚焦扫描仪是要尽量减少光漂白和毒性,通过阻断外的焦点的光,并且通过收集仅聚焦光以最大化分辨率和灵敏度。该EMCCD相机一定要快,并在敏感时间推移采集的每90毫秒收集到足够的GFP-TUB1信号。目前,EMCCD相机是这种应用的最佳选择。当前的CMOS传感器的相机缺乏高档EMCCDs的敏感性;然而,这项技术显著改善,可能很快就会是合适的。最后,需要一种用于沿Z快速和精确的运动,其可以是在四维图像获取中的限速步骤的压电阶段。

如果类似的设备是不容易得到的在这个协议中描述的特定显微镜系统可以呈现一个的屏障。改变ç一个制成,以适应不同的成像系统,但这些修改可能以时间和/或空间分辨率为代价的。主轴驱动级马达来代替压电级的使用。然而,这些电动机是比较慢,不太准确,而且容易漂移。采集后图像稳定插件可以被用于最小化与这些马达驱动的阶段相关联的XY尺寸漂移。此外,可以使用具有更慢的读出速度备用摄像机。为了适应较慢的采集速率,Z系列可以收集较少(即,Z-系列之间有更多的时间)。但是,增加的Z系列之间的时间风险的时间点之间可能发生的失踪过渡。可替代地,Z-平面之间的距离可以增大作为减少每Z系列收集的图像的数目的一种方式。但是,增加这个间距可能失去平面之间的图像信息,这将削弱实验者对ACCUR能力ately识别微管两端。显然,改变可以被制成容纳可供选择的成像系统,但这些改变必须与图像信息的潜在损失进行权衡。

此协议的另一个限制是空间信息的丢失时三维图像栈被转换成二维图像的预测。在一个-后期预酵母细胞的个体星体微管是在整个细胞质的三维空间的长度和项目通常在0.5和2.0微米。因此,至关重要的获取从一系列Z位置的图像,以收集一个单独的微管的所有的空间信息。在时间推移采集,这可以产生复杂的数据集,并在每个所述时间点150 20 Z-片,总共3000个的图像。为了应对这一挑战,并简化图像分析,Z-栈的空间信息的分析过程中被压缩。虽然这benef其分析,它是在从Z-维空间信息的成本。当Z-尺寸被压缩多少信息会丢失?为了估算这一损失,进行实验以测量在预后期细胞,这是比较容易测量,因为Spc110-GFP标记的SPBS表现出具有高的信号 - 噪声比球形灶SPBS之间的距离。虽然主轴可沿Z比星体微管显示出不同的位移,平均长度相似(〜1.5微米),因此提供了有用的代理。主轴长度,平均15%的较长时在全三维图像栈当相同的主轴在二维投影(JM,未发表的结果)被测量比测量。因此,简化的数据集和测量的益处应该针对的丢弃Z信息的成本进行权衡。

酵母细胞生物学界已经制定了成像微管BP网络在一个多功能工具包KS。这包括各种稠合到α-微管蛋白/ TUB1并标有各种营养缺陷型标记的荧光蛋白的。这些构建体包括LEU2 :: GFP-TUB1(pSK1050)11,其在染色体LEU2基因座整合,和若干融合到GFP和其他荧光团,其整合在URA3基因座,包括URA3 :: GFP-TUB1(pAFS125)16, URA3 :: CFP-TUB1(pAFS125-CFP)URA3 :: pHIS3-的mCherry-TUB1(pAK011)17。此外,为不同的荧光蛋白的一组TUB1融合物最近已被创建的靶整合要么染色体URA3基因座或到邻近天然TUB1轨迹18上的轨迹。这种广泛的荧光和标记的调色板是不同的可标记蛋白共定位实验是非常有用的。在GFP-TUB1融合仍然microtu的延时成像的最佳工具BULE动力学由于其亮度和光稳定性。宋和Lee(pSK1050)11产生的GFP-TUB1融合含有GFP的融合到α微管蛋白/ TUB1的氨基末端和在LEU2基因座整合到营救亮氨酸营养缺陷型。因此,融合蛋白是除了天然α微管蛋白异位表达的,并且包括〜总α微管蛋白的20%,在电池9。重要的是,GFP-TUB1融合不抢救的天然α微管蛋白/ TUB1(JM,未发表的结果)的功能。这也是其他TUB1融合的真实构造18。

可用的工具来可视化微管和其结合蛋白,芽殖酵母是一种理想的系统来研究微管蛋白和其它微管调节突变。此外,微管蛋白基因的数目有限允许突变体的微管蛋白的均匀池的直接研究。除了突变微管蛋白基因,芽殖酵母具有许多同源的后生动物对应的微管相关蛋白(MAP中)的。这些地图可以直接学习,也可以检查的效应突变对单一微管细丝。这里详述该协议允许两个影响微管动力学的内在和外在过程的调查。

综上所述,微管必须是动态的过程中许多细胞过程才能正常工作。有必要了解固有的微管蛋白和因子的外在相关蛋白调节微管动力学。出芽酵母是一种理想的系统通过直接定量单个微管的动态性,研究了这些因素的影响。上面详细描述的协议描述了如何将荧光融合蛋白稳定地整合到酵母基因组中,以及如何获取和分析共焦图像堆栈量化体内微管动力学

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

Acknowledgments

我们感谢克里·布卢姆(北卡罗莱纳大学),凯·李(NCI),史蒂文·马库斯(科罗拉多州立大学)和埃尔马·希贝尔(海德堡大学)分享各种FP-TUB1质粒。我们是在滑动室制备方法训练我们感谢梅利莎·加德纳(明尼苏达大学)。这项工作是由美国国立卫生研究院(NIH)授予R01GM112893-01A1(以JKM)和T32GM008730(到CE)的支持。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOB (dropout bases) Sunrise science  1650
CSM-Leu Sunrise science  1005
Agar Ameresco N833
100 mm polystyrene plates Fisher Scientific FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O Sigma-Aldrich   D7656 resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media  Sunrise science  1459-100
Concanavalin A Sigma-Aldrich  L7647 resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
Microscope Coverslips Fisher Scientific 12-541-B
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) melt at 75 ºC before use
forceps  Fisher Scientific 16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich  202444
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope Nikon Instruments MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective Nikon Instruments MRD01905
Piezo electric stage  Physik Instrumente P-736
Spinning disk scanner Yokogawa CSU10
Laser combiner module Agilent Technologies MCL400B
EMCCD camera Andor Technology iXon Ultra 897 
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elements software Nikon Instruments MQS31100
Microsoft Excel software Microsoft
MATLAB software MathWorks, Inc
ImageJ64 NIH Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in Open Microscopy Environment
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1 pSK1050 reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

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References

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高分辨率成像和芽殖酵母个人星体微管动力学分析
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Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).More

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).

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