Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær

doi: 10.3791/55610 Published: April 20, 2017

Summary

Spirende gjær er en fordelaktig modell for å studere mikrotubulidynamikk in vivo på grunn av sin kraftige genetikk og enkelheten mikrotubuli-cytoskjelettet. Følgende protokoll beskriver hvordan å transformere og kulturgjærceller, erverve konfokale mikroskopi bilder, og kvantitativt å analysere mikrotubulidynamikk i levende gjærceller.

Abstract

Dynamiske mikrotubuli er grunnleggende for mange cellulære prosesser, og nøyaktige målinger av mikrotubulidynamikk kan gi innsikt i hvordan cellene regulere disse prosesser, og hvor genetiske mutasjoner innvirkning regulering. Kvantifiseringen av mikrotubulidynamikk i metazo modeller har en rekke utfordringer i forbindelse, blant annet en høy tetthet mikrotubuli og begrensninger på genetiske manipulasjoner. I kontrast til den spirende gjær modellen gir fordeler som overvinne disse utfordringene. Denne protokollen beskriver en metode for å måle dynamikken av enkelte mikrotubuli i levende gjærceller. Celler som uttrykker fluorescensmerket tubulin er klebet til sammen glidekammere, slik at for stabil time-lapse bildeopptak. En detaljert guide for høy hastighet, blir fire-dimensjonale bildeinnsamling bringes også så vel som en protokoll for kvantifisering av egenskapene til dynamiske mikrotubuli i konfokalt bilde stabler. Denne fremgangsmåten, kombinert med konvensjonelle Yeast Genetics, provides en tilnærming som er unikt egnet for kvantitativt å vurdere effektene av mikrotubuli-regulatorer eller mutasjoner som endrer aktiviteten av tubulin subenheter.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mikrotubuli er cytoskeletale polymerer fremstilt av ap-tubulin protein subenheter og anvendes i en rekke forskjellige cellulære sammenhenger, inkludert intracellulær transport, celledeling, morfogenese, og motilitet. Å bygge mikrotubulidynamikk nettverk for disse ulike rollene, må cellene nøye regulere hvor og når mikrotubuli form. Denne regulering oppnås ved å styre reaksjonene som enten montere aB-tubulin-subenhetene til mikrotubuli-polymerer eller demontere mikrotubuli til frie underenheter; Dette er kjent som mikrotubulidynamikk.

Et hovedmål med mikrotubuli-feltet er å belyse de molekylære mekanismene som regulerer mikrotubul-dynamikk, inkludert studier av ap-tubulin underenheter og ytre regulatorer som binder seg til tubulin og / eller til mikrotubuli. En godt etablert eksperimentell tilnærming er å rekonstituere dette system in vitro ved anvendelse av renset tubulin αβ-protein, ofte i comsjonen fast med rensede ytre regulatorer. Selv om dette er en nyttig tilnærming, er det klart at mikrotubulidynamikk i rekonstituert systemer skiller seg sterkt fra det som ble observert i levende celler. For eksempel, mikrotubuli vokse raskere og langsommere krympe in vivo enn in vitro. Disse forskjellene kan skyldes tilgjengeligheten av kjente ytre regulatorer 1, så vel som til ennå-udefinerte faktorer i celler. Derfor er det viktig å bestemme aktivitetene til mikrotubulidynamikk regulatorer og mutanter som forstyrrer dynamikken i en innfødt cellulær sammenheng.

Selv om metazo modeller har vist seg å være rådende system for undersøkelse av mikrotubuli-funksjon, og høyere ordens organisasjon, flere praktiske problemer sterkt begrense anvendbarheten av disse modellene for nøyaktig måling av mikrotubulidynamikk. Først det høye antallet mikrotubuli, alt fra titalls til tusenvis per celle, gjør det vanskelig å trygtspore individuelle mikrotubuli over tid. Mange studier møte denne utfordring med CCD-proteiner som selektivt lokaliserer til mikrotubuli-ender, slik som proteiner i slutt-binding (EB) familie. Imidlertid er disse proteinene er kjent for å lokalisere bare til endene av økende mikrotubuli i metazoans 2. Derfor er nytten av disse proteinene er begrenset til direkte måling av veksthastigheter, mens bare indirekte måling av andre aspekter av dynamikk, som frekvens for en katastrofe. For det andre, til tross for fremskritt i genomet redigering teknologi, å lage celler som stabilt uttrykker fluorescensmerket tubulin eller å innføre mutasjoner til selektivt å manipulere tubulin eller mikrotubuli-regulatorer er fortsatt en betydelig utfordring. Videre, tilstedeværelsen av mange tubulin isotyper i metazoans forvirrer studiet av hvordan mutasjoner påvirker individuelle tubulin gener.

Den spirende gjær-systemet gir flere viktige fordeler for måling av in vivo microtubule dynamikk. Gjær har en forenklet mikrotubuli-nettverk som tillater visualisering av de enkelte mikrotubuli. I gjær, mikrotubuli utgå fra organisering sentre kjent som spindelpolen legemer (SPB), som er innleiret i kjerneomslaget 3. De to SPB tjene som stillas for y-tubulin små komplekser som kjerner mikrotubuler 4, 5. SPB enheter danne kjerner av to klasser av mikrotubuli, spindel mikrotubuli og astrale mikrotubuli. Spindel mikrotubuli rager inn i nukleoplasma og er viktig for å feste til kromosomer via kinetochore mikrotubuli og for å stabilisere spindelen via overlappende interpolare mikrotubuli 6. I motsetning til dette er astrale mikrotubuli prosjekt utover inn i cytosol og forholdsvis sjelden i forhold til det tett nettverk av spindel mikrotubuli. Under mitose, pre-anafase-celler har bare 1-2 astrale mikrotubuli som stammer fra enten SPB; disse eksisterer som jegindivid mikrotubuli i stedet for som bunter 7. Rollen til astrale mikrotubuli under mitose er å bevege kjernen og spindelen i krysningspunktet mellom mor og knoppen kamrene, kjent som knoppen halsen. Denne bevegelse medfører veldefinerte trasé som genererer kraft på astrale mikrotubuler, trekke kjernen og spindelen mot og til slutt inn i knoppen halsen 8.

En annen fordel med gjær system er anvendeligheten av dets gener, som kan brukes til å undersøke mikrotubuli-regulatorer og tubulin-underenheter med ny grad av nøyaktighet. Gjær også ha en forenklet repertoar av tubulin isotyper: en enkelt β-tubulin-genet (TUB2) og to a-tubulin-genene (TUB1 og TUB3). Mutasjoner kan lett innføres i disse genene, og dermed studert i en homogen populasjon tubulin 9, 10. Det finnes en rekke anertilgjengelige konstruksjoner for merking av mikrotubuli, og disse kan være målrettet for integrering ved kromosomal loci for stabil ekspresjon (se diskusjon).

Det overordnede målet for denne metode er å avbilde enkelt mikrotubuli i levende gjærceller i fire dimensjoner (X, Y, Z og T) for høyoppløselige målinger av mikrotubulidynamikk. Fremgangsmåter for å integrere konstruksjoner for den konstitutive, lavt nivå av ekspresjon av fluorescensmerkede tubulin i gjærceller, er beskrevet. Forut for bildebehandling, og levende celler montert i glidekammere belagt med lectin concanavalin A for å stabilisere celler for langvarig avbildning. De optimale parametere for bildeinnsamling, samt en arbeidsflyt for dataanalyse, er også beskrevet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Klar Leu Dropout Plates

  1. Legg 800 ml sterilt, avionisert vann (DIH 2 O) til en 2 liters kolbe. Legg 26,71 g av frafall base (DOB) pulver, 0,69 g av CSM-Leu, og 20 g agar. Bland med en magnetisk rørestav. Bring til en L med DIH 2 O.
  2. Autoklav ved 121 ° C og 19 psi i 30 minutter.
  3. Fjern flasken fra autoklaven og la den avkjøles til ~ 65 ° C med forsiktig omrøring.
  4. Hell 30 ml / plate på 100 mm diameter plater. La disse stå ved romtemperatur i 36-48 timer før den lagres ved 4 ° C.

2. Integrering av GFP-Tub1 for konstitutiv ekspresjon av GFP-merket Tubulin

  1. Kok en lager-konsentrasjon på 10 mg / ml enkelt-trådet DNA (ssDNA) i 3 minutter.
  2. Kombiner 2 pl ssDNA kokt med 400 ng av renset GFP-Tub1 plasmid DNA 11.
    MERK: Det finnes en rekke forskjellige plasmider som kan anvendes for den stabile, fluorescerende merkingav mikrotubuli i gjær som benytter alternative fluoroforer og selekterbare markører. Noen av disse alternativene er beskrevet i diskusjonen delen.
  3. Tilsett DNA-blandingen til en 50 pl aliquot av kompetente gjærceller.
    MERK: Fremstill kompetente gjærceller med sorbitol-løsning (SORB; 100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA pH 8, og 1 M sorbitol, justert med fortynnet eddiksyre til pH 8). For en detaljert beskrivelse av å gjøre kompetente gjærceller, se referanse 12.
  4. Vortex grundig.
  5. Legg 6x det totale volum av polyetylenglykol (PEG) -oppløsning (100 mM LiOAc, 10 mM Tris-HCl pH 8, 1 mM EDTA / NaOH, pH 8, og 40% PEG3350) til DNA-celleblandingen.
  6. Vortex grundig.
  7. Inkuber i minst 1 time ved 30 ° C med forsiktig omrøring.
  8. Legg dimetylsulfoksid (DMSO) til 10% av det totale volum og virvle.
  9. Inkuber ved 42 ° C i 15 min.
  10. Sentrifuger ved 2500 xg i 5 min.
  11. 2 O.
  12. Plate celler på en -Leu frafall plate.
    MERK: GFP-Tub1 konstruksjon inneholder et leucin auxotrop markør, mens andre konstruksjoner kunne bruke en alternativ markør. Droppouten Mediet bør være spesifikke for den auxotrofe markør av konstruksjonen.
  13. Tillate de transformerte cellene til å vokse i 3-5 dager ved 30 ° C.
  14. Re-strek enkelt transformasjons kolonier på en frisk -Leu frafall plate ved å overføre kolonier ved hjelp av en autoklavert tannpirker. Platen inkuberes over natten ved 30 ° C.
  15. Visuelt screene hver transformant for et GFP signal ved å suspendere ca. 1 ul av celler fra en enkelt koloni fra platen i trinn 2.14 i 2 pl vann på en ren lysbilde. Dekk de suspenderte celler med et dekkglass og observere ved å bruke fluorescensmikroskopi.
    1. Eksitere transformanter med 488 nm lys og se etter tilstedeværelsen av et GFP signal.

3. Økende Flytende gjærkultur

  1. Inokuler ~ 1 mL av gjærceller fra en enkelt koloni på en plate i 3 ml syntetisk komplett medium. La cellene vokse over natt ved 30 ° C med rysting ved 250 rpm.
  2. Fortynn den mettede kultur følgende dag til en OD600 på <0,1 i mediet. Returnere den fortynnede kultur til 30 ° C risteapparat i 3-4 timer eller inntil OD600 er mellom 0,4 og 0,8, når cellene er klare til å bli lastet inn i kamrene for avbildning.

4. Klar Flow Chamber Slides

  1. Kutte oppet ark av parafin film til et stykke 4 i bred og 7 i lang tid.
  2. Plasser en standard objektglass lengderetningen på 4 tommers bredde av parafin film og vikle filmen rundt sleiden 3-4 ganger, slik at sleiden er dekket av filmen som er 3-4 lag tykk. Trykke lagene sammen for å sikre at det er en rimelig tetning; Dette vil gjøre det enklere å kutte. Unngå å trykke for hardt eller forårsaker filmen å rynke.
  3. Skjær parafin filmen langs de ytre kantene av sleiden ved hjelp av en ren boks kutter barberhøvel. Bruke et annet lysbilde for å tilveiebringe en rett kant for skjæring.
  4. Skrell overflødig film av arbeids lysbilde og kast. De gjenværende stabler av film dekker den ene side av sleiden, og vil bli brukt til å lage veggene mellom avbildnings kamre.
  5. Ved hjelp av den andre glider som en rett kant, skjæres de stablede filmlagene langs den lange aksen av sleiden til omtrent ti strimler, hver 2-4 mm i bredde.
  6. Kutt de stablede parafinfilmlagene perpendikulærtde snittene som er gjort i trinn 4.5, langs den korte akse av sleiden, for å lage strimler 2-4 mm i bredde, 23-24 mm i lengde, og 3-4 lag tykke.
  7. Skrelle de skårede strimler ved hjelp av en barberhøvel i 45 ° vinkel. Ved hjelp av pinsett, fordele snitt filmstrimler på et rent objektglass for å skape den ønskede antall kamre. Opp til 3 kamre (laget med 4 parafin filmstrimler) kan opprettes på ett lysbilde.
  8. Plasser en enkelt dekkglass på toppen av strimler av film og bevege den inn i stilling med pinsett.
  9. Plasser den fremstilte glide, dekkglass opp, på en varm plate innstilt på ~ 95 ° C (dette er omtrent den lav-medium innstillingen på de fleste kokeplater). Varm sleiden inntil filmstrimler er gjennomskinnelige (ca. 3 minutter), og deretter forsegle sleiden og dekkglass sammen med et lett trykk på dekkglasset med pinsett.
    Merk: Det er viktig å bare trykke på de områder av dekkglass som befinner seg direkte over parafin filmstrimler, som skraping regionene over cHambers kan redusere bildekvaliteten. Pass på å ikke overopphetes lysbildet; fordampede film vil belegge innsiden av kammeret med en hydrofob film som hindrer cellene i å feste seg.
  10. Bruk pinsett for å fjerne objektglasset fra varmeplaten (sleiden vil bli varmt) og settes til side for å avkjøles med dekksiden som vender opp; som sleiden kjøler vil filmen tilbake til en hvit, ugjennomsiktig farge.
    MERK: på dette punkt, lysbildene er klar til å bli lastet med dyrkede gjærceller. Ekstra lysbilder kan gjøres til dette punktet, og oppbevares på et rent og tørt sted på ubestemt tid.

5. Legge gjærceller i forberedt Flow Chamber Slides

  1. Tine et frosset, 200 ul alikvot av Concanavalin A (2 mg / ml i steril Dih 2 O).
  2. Tilsett omtrent 100 ul opptint Concanavalin A til hvert kammer av den fremstilte glide ved pipettering inn i en av de åpne ender. Legg nok Concanavalin A til å fylle kammeret. For denne sTEP, vil den Concanavalin A trekkes gjennom kammeret via kapillarvirkningen.
  3. Henge lysbilde, dekkglass og ned, mellom to mikrofuge-rør-stativer eller penner i 5 min for å tillate at Concanavalin A til å klebe til dekkglass (dvs. det kammer).
  4. Returner lysbildet til en dekk-up posisjon. Vask kammeret med 2x kammervolumet (bestemt i trinn 5.2, ovenfor; ca. 200 pl) av syntetisk komplett medium for å fjerne Concanavalin A.
    1. Strømme det medium gjennom kammeret, enten ved hjelp av hjørne av et papirhåndkle eller en filterpapiret brettet i to for å trekke fluid ut av den ene ende av kammeret, mens samtidig å pipettere fersk væske inn i den andre. Alternativt kan bruke en aspirator vakuum for å nøye trekke fluid ut av den ene ende mens pipetteres fersk væske inn i den andre.
  5. Veieceller ved å strømme 2x kammervolumet (ca. 200 pl) av cellesuspensjonen (fra trinn 3,4) ved å anvende rettet strøm method beskrevet i trinn 5.4.1.
    MERK: Målet er å avbilde et enkelt lag av celler på dekkglass. Derfor er det viktig å legge i en konsentrasjon av celler små nok til at de ikke haug på toppen av hverandre, men store nok til at tilstrekkelig antall celler er til stede i feltet for å samle inn den maksimale datamengde per bildeopptak. Den optimale konsentrasjonen av celler i kammeret kan variere, og bør bestemmes empirisk. For å øke konsentrasjonen av celler i strømningskammeret, forsiktig nedsentrifugering av cellekulturen ved 1000 x g i 2 minutter og fjerne noe av supernatanten. For å redusere konsentrasjonen av celler, tilsett friskt syntetisk komplett medium til cellesuspensjonen. Konsentrasjonen av celler kan evalueres etter trinn 5,7 (nedenfor) ved å inspisere kammeret på et fasekontrastmikroskop. På dette punktet, kan flere celler tilsettes til kammeret ved å strømme i flere cellesuspensjon. Imidlertid reduserer celletetthet på dette punkt er ikke gjennomførbart og oppnås bestved å laste inn et nytt kammer med en fortynnet cellesuspensjon.
  6. Henge glidedekk-ned, slik det er beskrevet i trinn 5.3, i 10 minutter for å la cellene få feste seg til dekkglass.
  7. Spyle ut eventuelle ikke-adhererte celler ved å strømme gjennom 4x kammervolumet (ca. 400 ul) av syntetisk komplett medium. Dette vil eliminere frittflytende celler i kammeret, noe som kan forurense bildeopptak.
  8. nøye tørr hver ende av kammeret med en ren hjørne av et papirhåndkle, og bringer menisken til kanten av dekkglasset.
  9. Forsegle hver ende av kammeret med varm (75 ° C) tetningsmiddel (f.eks VALAP; like deler vaselin, ull voks og parafinvoks).
    MERK: På dette punktet, er lysbildet klar til bildet. Kamrene kan avbildes i opp til 9 timer, avhengig av tettheten av celler i hvert kammer. Cellene vil produsere karbondioksyd (CO 2) over tid, noe som etter hvert vil skape bobler som fortrenger cellene.

  1. Bringe sleiden til et invertert mikroskop utstyrt med en 1,45 NA 100X CFI Plan Apo objektiv, en piezoelektrisk scene, en roterende skive konfokal skannerenheten, en belysning laser, og en EMCCD kamera. Opprettholde temperaturen av scenen ved romtemperatur (25 ° C) under innhenting.
    MERK: høy numerisk apertur, gir større bildeoppløsning, og den piezoelektriske trinnet muliggjør høyhastighets z-stabel anskaffelse. Minste mikroskop kravene er 100X objektiv, belysning laser, og den EMCCD kameraet.
  2. Ta med cellene i fokus. Sikre at kjøpet Feltet har minst 5-6 celler gruppert sammen ved å søke sleiden for celler gruppert sammen.
    MERK: Selv om det ikke er nødvendig å avbilde mer enn en celle om gangen, billeddannende multiple celler i det samme feltet forbedrer effektiviteten av datainnsamlings uten å svekke kvaliteten på dataene. Det er imidlertid viktig atCellene er på samme fokusplanet og ikke stablet på toppen av hverandre.
  3. Programmere en multidimensjonal oppkjøp for å samle flere z-serien over tid.
    1. Justere innstillingene innenfor de aktive innsamlings innstillingene til følgende: total Z-dybde = 6 um, slik at hele gjærcellen; Z-trinnstørrelse = 300 nm, for å maksimere lys samling uten overprøvning; total varighet = 10 min; tidsintervaller = Z-serie hver 4. s; og eksponeringstid = 90 ms for hver z-planet.
      MERK: Den optimale eksponeringstiden vil variere avhengig av kameraet, eksitasjonslyskilde, og andre faktorer. Generelt vil det optimale eksponeringstiden være den minimale tid som er nødvendig for å oppnå et 3: 1 forhold mellom signal fra GFP-merket astrale mikrotubuli å signalere fra cytoplasma på grunnlag av bildeelementverdier som måles av EMCCD.
  4. Begynn kjøpet ved å klikke på 'Kjør'. Tillate det å kjøre for hele 10 min varighet. Lagre dataene som et bildeserie (TIFF eller .nd2).
  5. Velg et nytt felt å avbilde i kammeret og gjenta trinn 06.02 til 06.04.
    MERK: En enkelt kammer bør gi mellom 15 og 20 felt av celler, avhengig av celletetthet i kammeret. Høyere celletettheter vil gi lavere totalfelt, som CO 2 i kammeret vil bygge opp raskere.

7. Bildeanalyse

  1. Åpne bildefilen i ImageJ ( https://imagej.nih.gov ) som en hyperstack ved hjelp av bio-formater importør plugin.
    1. Åpen ImageJ og dra ervervet bildestabelen fra punkt 6 direkte på kontrollpanelet. Den bio-formater importøren vil starte automatisk. Velg "OK" for å laste bildet stabelen som en hyperstack.
      MERK: "Bio-formater Importer Options" prompt vil åpne og sikre at under "Stack Ser" delen, "Vis stabel med:" er satt til "Hyperstack"; og "Stack Order:" er satt til "XYCZT."
  2. Kollapse hver Z-serie til en maksimal intensitet, to-dimensjonale projeksjon ved hjelp av Z-prosjektet funksjon.
    1. Velg "Image" menyen, den "Stack" undermenyen, og "Z-prosjektet" -funksjonen. Velg "Maksimal projeksjon" fra rullegardinlisten og klikk "OK."
  3. Påfør en median filter til bildebunken for å redusere speckling støy ved å velge "Process" -menyen, "Filter" undermenyen, og "Median" -funksjonen. Skriv inn 2,0 piksler inn i radius boksen og klikk "OK."
  4. Identifisere pre-anaphase celler i feltet.
    MERK: Disse er kjennetegnet ved mellomstore knopper og en kort mitotisk spindel, 1-1,5 um i lengde (figur 1; pilhodet som peker til en kort mitotisk spindel). Celler på dette stadiet er ideell for å analysere mikrotubulidynamikk fordi de vanligvis utviser bare en few astrale mikrotubuli som utgår spinde polene 7. Astral mikrotubuli kan identifiseres som lineære filamenter som oppviser en ensartet GFP signalintensitet fra minusenden, ved SPB, til plussenden, i cytoplasma.
  5. Fra den første endepunktet av den bildeserien, bruke den segmenterte linjen verktøyet til å tegne en linje langs en enkelt astral mikrotubuli, fra minus-enden, som ligger ved overgangen mellom det astrale mikrotubul og mer intenst merkede spindel mikrotubuli, til plussenden , som er i cytoplasma (se den røde linjer i figur 1). Dobbeltklikk på slutten av microtubule å fullføre segmentert linje.
  6. Spill målingen i resultattabellen ved hjelp av "tiltaket" funksjonen ved å trykke på "M" knappen på tastaturet.
    MERK: Andre funksjoner, som for eksempel grå intensitet, kan registreres ved å sette målingene i "Analyze" -menyen og "Set Målinger" undermenyen.
  7. Avansere til neste endepunktet enten ved å klikke på høyre pilen i Z-glidebryteren, eller trykke på "./>" tasten på tastaturet. Gjenta trinn 7,5 og 7,6 for alle tidspunktene i bildesekvensen.
  8. Kopiere data fra resultattabellen og lime dem inn i et regneark. Lagre dataene ved å velge "Lagre som".
    MERK: Disse målingene vil omfatte flere verdier, men de viktigste verdiene er den skive, som angir den endepunktet i serien, og den lengde, som angir lengden av linjen (dvs. astral mikrotubuli). Kolonner som inneholder andre målinger (f.eks området, betyr pikselverdien, vinkel, etc.) kan enten holdes eller kasseres.
  9. Opprett en ny kolonne i regnearket ved å høyreklikke og bruke "Sett inn" funksjon. Input tiden (e) for hvert tidspunkt.
  10. Lag punktplott av microtubule lengde (mikrometer) som en funksjon av tiden (e) ved hjelp av "Sett LinjeChart" feature; velge lengdemålinger som 'Y' og tiden kolonne som 'X.'
    1. Identifisere regioner av polymerisering depolymerisasjon, og pause ved å se etter positive og negative forandringer i lengde over tid i spredningsplott fra trinnet 7.10.
      MERK: Polymerisasjon arrangementer øke mikrotubuli-lengde av minst 0,5 mikrometer over et minimum på 3 tidspunkter og tilpasse en lineær regresjon med et R2 ≥ 0,9 og en R-verdi> 0 (figur 1 B og D, grønne punktene). Depolymerisering hendelser redusere mikrotubuli-lengde av minst 0,5 mikrometer over et minimum på 3 tidspunkter og tilpasse en lineær regresjon med et R2 ≥ 0,9 og en R-verdi <0 (figur 1 B og D, rosa poeng). Pause hendelser er atskilt fra polymeriseringen og depolymerisering. Pauser er definert som netto endring i mikrotubuli-lengde som er mindre enn 0,5 um på tvers i minst 3 tidspunktene;tilpasse en lineær regresjon med en R-verdi på mellom -0,4 og 0,4; og har en skråning som er ikke signifikant forskjellig fra null, som bestemt ved hjelp av en F-test.
    2. Bruke punktplott som en guide, identifisere de deler av tiden når lengden endringen er positiv og markere dem i en grønn farge. Fremheve områder av tid når lengden endringen er negativ i en rosa farge.
    3. Beregn lineær regresjon fra uthevede avsnitt og registrere R- og R2 -verdi for hver seksjon i søylene proksimalt til regionene. Klassifisere hver farget region som enten en polymerisasjon hendelse eller en depolymerisering hendelse.
  11. Beregn at polymeriseringshastighetene ved å dividere endringen i lengde av endringen i tid for hvert vekst hendelse. Registrere disse resultatene i spalten ved siden av den lineære regresjonen verdier fra trinn 7.10.3.
  12. Beregn depolymeriseringen priser ved å dividere endringen i lengde av endringen i tid for hver shrinking event. Registrere disse resultatene i spalten ved siden av polymerisasjonshastigheten verdier fra trinnet 7.11.
  13. Beregn katastrofen frekvens ved å dividere antall polymeriser-til-depolymerisering overganger av den totale tiden for alle vekst hendelser 13. Registrere disse resultatene i spalten ved siden av de depolymerisering rateverdier fra trinn 7,12.
  14. Beregn redning frekvens ved å dividere antall depolymerisering-til-polymeriseringen overganger av den totale tiden for alle krymping hendelser 13. Registrere disse resultatene i spalten ved siden av de katastrofe frekvensverdiene fra trinnet 7.13.
  15. Beregn dynamicity ved å dividere summen av den absolutte verdien av alle lengdeendringer av den totale varighet av bilde-innhentings, beregnet i trinn 7.10.1, og multiplisere med 27,0833 å oppnå tubulin subenheter per sekund 14. Registrere disse resultatene i kolonne tilstøtende til unnsetning frekvens valUES fra trinn 7.14 og lagre resultattabellen.
    Merk: Det er mulig å automatisere analysen fremgangsmåten beskrevet i trinn 7,10-7,15 ved hjelp av et skreddersydd program (. Estrem, et al, manuskript presentert). Programmet er utviklet for å identifisere perioder med polymerisering depolymerisasjon og i lengdemålinger ved å følge de parametre som er beskrevet ovenfor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Måling mikrotubulidynamikk i levende gjærceller gir en overbevisende verktøy for å vurdere hvor mutasjoner i gener som koder for mikrotubuli-regulatorer eller tubulin underenheter innvirkning polymerisasjon og depolymeriseringsprosesser priser, så vel som frekvensen av overgangen mellom disse tilstander. Figur 1 viser en tidsserie av astral mikrotubul-dynamikk i et villtype-celle og en mutant celle med en mutasjon i β-tubulin (tub2- 430Δ). Mikrotubuli er merket med GFP-merket α-tubulin for å visualisere mikrotubuli lengde. De røde pilene spore lengden av astrale mikrotubuli i hvert bilde (Figure1A og 1 C). Mikrotubul lengder ble målt ved hvert tidspunkt i 8 minutter, og disse samlet lengde er avbildet i livs plott (figur 1B og 1 D). Disse data ble brukt for å bestemme polymerisasjonshastigheten, depolymeriseringen hastighet, polymerisasjon duratipå, depolymerisering varighet, redning frekvens, katastrofe frekvens, og dynamikk.

Figur 1
Figur 1. tidsforsinkelse Imaging av GFP-merket Mikrotubuli og Målinger av Astral mikrotubulidynamikk. (A og C) De første fem sekvensielle bilder av intervall avbildning for villtype og mutante celler tub2 -430Δ. Mikrotubuli er merket med GFP-Tub1 og avbildes i pre-anafase av cellesyklusen. Hvert bilde er en maksimal intensitet projeksjon fra en konfokal Z-serien. Skala barer: 1 um. Tidsstempler viser den totale tid på hver ramme anskaffelse. De røde pilene følge langs den samlede lengde av en astral mikrotubuli, med pilene betegner pluss ender. (B og D) mikrotubuli-life plott viser lengdene av enkelt astrale mikrotubuli over tid. Den grønne punktets betegner polymeriseringen og den rosa punktene betegne depolymerisering. Pilene peker katastrofe hendelser. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 1 viser endrede mikrotubulidynamikk mellom en villtype-stamme og en mutant-stamme som mangler de 27 aminosyrer av β-tubulin på den C-terminale ende, en mutant som tidligere ble vist å ha mer stabile mikrotubuli 15. Som vist i mikrotubuli livsplottene, mikrotubuli i tub2 -430Δ mutant er lengre og oppviser færre katastrofer enn villtype-mikrotubuli (figur 1B og D pilspisser, tabell 1). I tillegg, polymeriseringsbetingelsene og depolymeriseringsprosesser priser, bestemt fra bakken av den stigende og synkende microtubule lengths, blir redusert i den mutanten sammenlignet med villtype (figur 1B og 1D, tabell 1). Til slutt, mikrotubuli i tub2 -430Δ mutantcelle tilbringer mer tid i tilstander av polymerisering og depolymerisering og har sunket dynamicity sammenlignet med villtype (tabell 1).

Press Dynamicity (subenheter / s) Polymerisasjonshastigheten (um / min) % Tid i Polymerisering Depolym hastighet (um / min) % Tid i depolymeriseringsreaksjo
Iser
% Tid i Pause Rednings frekvens (events / min) Katastrofe frekvens (eventene / min)
Vill-type n = 1 54 1.8 ± 0.5 48 3.0 ± 0.3 29 3 1.8 1.4
tub2-430Δ n = 1 40 1,4 ± 0,1 41 1.5 ± 0.2 32 0 0.8 0.7
Forkortelser er som følger: um, um; min, minutt; s, sekund; n, enkelt mikrotubuli analysert fra mikrotubuli-liv plot (Fig1B, D). Verdier er gjennomsnitt ± standardavvik.

Tabell 1: mikrotubulidynamikk Målinger Celler i figur 1. Verdiene er gjennomsnitt ± standardavviket for middelverdien fra målinger av de enkelte mikrotubuli vist i figur 1.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Den spirende gjær modellen gir store fordeler for å samle målinger av mikrotubulidynamikk med høy oppløsning i et in vivo miljø, inkludert muligheten til å avbilde enkelt mikrotubuli over tid, og evnen til å manipulere tubulins og mikrotubuli-regulatorer ved hjelp av verktøyene på Yeast Genetics.

De Concanavalin A-belagte kammere gir en rekke fordeler i forhold til tidligere beskrevne innretninger, inkludert smeltet agar puter. Lysbilder med kamre kan være pre-laget og lagret i lengre tid eller kan brukes umiddelbart. I tillegg er Concanavalin A-belagte kamre er i stand til dyrking av gjærceller i> 6 timer i det samme medium i hvilket cellene ble opprinnelig dyrket. Det er viktig å merke seg at antall celler i kammeret vil diktere hvor lenge kammeret kan avbildes. De belagte kamrene sikre at bare et enkelt lag av gjærceller fester seg til dekkglass. Endelig opprette flere kammere tillaterflere forskjellige gjærstammer som skal avbildes på samme lysbilde.

Det er store utfordringer til avbildning mikrotubulidynamikk i spirende gjær, inkludert forholdsvis lave signalnivåer og svært dynamisk natur av prosessen. Widefield mikroskoper er tilstrekkelig for å fange enkeltendepunktet bilder av merket mikrotubuli. Imidlertid fører Widefield mikros raskere photobleaching grunn lengre eksponeringstider og bombingen av prøven med out-of-fokus lys. Likeledes, laserskanning confocal mikroskoper er utilstrekkelig på grunn av raskere fotobleking. Roterende skive konfokal mikroskopi er unikt egnet for avbilding av mikrotubulidynamikk i spirende gjær. Spinning disk confocal mikroskop system som brukes her er designet med disse kravene i tankene.

Mikroskopet Systemet må utformes for høy hastighet og høy følsomhet. Selv om en rekke mikroskop systemer kan vise seg egnet, flere komponenter er avgjørende. En 100XFormålet med en høy numerisk apertur (1.45NA) er nødvendig for å løse de enkelte mikrotubuli og endringer lengde av størrelsesorden 100 nm. En roterende skive konfokal skanner er nødvendig for å minimalisere fotobleking og toksisitet, ved å blokkere ut-av-fokus lys, og for å maksimalisere oppløsningen og følsomhet, ved å samle inn bare i-fokus lys. Den EMCCD kamera må være rask og følsom for å samle nok GFP-Tub1 signal i løpet av hver 90-ms av time-lapse anskaffelse. Foreløpig EMCCD kameraer er det beste valget for dette programmet. Gjeldende CMOS-sensor-kameraer mangler følsomhet av high-end EMCCDs; imidlertid denne teknologien forbedrer betydelig og kan snart være egnet. Til slutt blir en piezoelektrisk trinn er nødvendig for rask og presis bevegelse i Z, som kan være det hastighetsbegrensende trinn i fire-dimensjonal bildeopptak.

Den spesifikke mikroskopsystemet beskrevet i denne protokollen kan utgjøre en barriere hvis tilsvarende utstyr er ikke lett tilgjengelig. skreddere cen skje for å gi rom for forskjellige avbildningssystemer, men disse modifikasjonene kan gå på bekostning av tidsmessig og / eller romlig oppløsning. En spindel-drevet trinns motor kan anvendes i stedet for det piezoelektriske trinnet. Imidlertid er disse motorer er langsommere og mindre nøyaktig, og utsatt for drift. Etter ervervet bildestabiliserende plug-ins kan brukes til å redusere avdriften i XY dimensjoner er forbundet med disse motordrevne trinn. I tillegg kan alternative kameraer med tregere utleste hastigheter benyttes. For å få plass til en lavere anskaffelsespris, kan Z-serie samles sjeldnere (dvs. mer tid mellom Z-serien). En økning av tiden mellom Z-serie risikerer mangler overganger som kan oppstå mellom tidspunkter. Alternativt kan avstanden mellom Z-plan bli øket som en måte å redusere antallet av bilder fanget per Z-serien. Men å øke denne avstanden risikerer å miste bildeinformasjon mellom flyene, noe som vil svekke experimenter evne til accurbart identifisere mikrotubuli-ender. Det er klart at endringer gjøres for å imøtekomme alternative avbildningssystemer, men disse forandringer må veies mot potensialet tap av bildeinformasjon.

En annen begrensning ved denne protokollen er tap av romlig informasjon når tre-dimensjonale bilde stabler blir omdannet til to-dimensjonale bildeprojeksjoner. En individuell astral mikrotubuli i en pre-anafase gjærcellen er typisk mellom 0,5 og 2,0 mikrometer i lengde og rager tvers over de tre-dimensjonale rommet av cytoplasmaet. Det er derfor viktig å skaffe bilder fra en serie av Z-posisjonene for å samle all den romlige informasjonen til et individ mikrotubuli. I en time-lapse anskaffelse, kan dette frembringe et komplekst datasett, sammen med 20 Z-stykker på hver av de 150 tidspunkter, for et total på 3000 bilder. For å møte denne utfordring og for å forenkle den bildeanalyse, blir den romlige informasjonen til Z-stabler komprimert under analysen. Mens dette benefdens analyse, kommer det på bekostning av romlig informasjon fra den Z-dimensjon. Hvor mye informasjon går tapt når Z-dimensjonen er komprimert? For å beregne dette tapet, ble eksperimenter utført for å måle avstanden mellom to SPB i forhånds anafase celler, som er forholdsvis enkelt å måle fordi Spc110-GFP-merket SPB enheter oppviser sfæriske foci med høye signal-til-støy-forhold. Selv om spindelen kan oppvise forskjellig forskyvning i Z enn astral mikrotubuli, er den gjennomsnittlige lengde lik (~ 1,5 um), og derfor gir en nyttig proxy. Spindel lengder er i gjennomsnitt 15% lengre tid målt i fulle tredimensjonale bildestakker enn når de samme spindlene er målt i to-dimensjonale fremspring (JM, upubliserte resultater). Således må nytte av de forenklede datasettet og målinger veies mot kostnadene ved å kastes Z informasjon.

Gjærcellebiologi samfunnet har utviklet seg til en allsidig verktøy for avbildning microtubule networks. Dette inkluderer en rekke forskjellige fluorescerende proteiner fusjonert til a-tubulin / Tub1 og som er merket med forskjellige auksotrofe markører. Disse konstruksjoner omfatter LEU2 :: GFP-TUB1 (pSK1050) 11, som integrerer ved den kromosomale LEU2-locus, og flere fusjoner til GFP og andre fluoroforer, som integrerer ved URA3-locus, inkludert URA3 :: GFP-TUB1 (pAFS125) 16, URA3 :: CFP-TUB1 (pAFS125-CFP), og URA3 :: pHIS3-mCherry-TUB1 (pAK011) 17. I tillegg er et sett av Tub1 fusjoner til forskjellige fluorescerende proteiner nylig blitt opprettet som mål integrasjon til enten det kromosomale locus URA3 eller til en locus som grenser til det native locus TUB1 18. Det omfattende palett av fluoroforer og markører er meget nyttig for å ko-lokalisering av eksperimenter med differensielt kodede proteiner. GFP-Tub1 fusjon forblir den beste verktøyet for den time-lapse avbildning av microtuBule dynamikk på grunn av sin lysstyrke og fotostabilitet. GFP-Tub1 fusjon laget av Song & Lee (pSK1050) 11 inneholder en blanding av GFP til den amino-terminale ende av α-tubulin / Tub1 og integrerer ved LEU2-locus for å redde leucin auxotrofi. Således blir fusjonsproteinet uttrykt ectopically i tillegg til nativ α-tubulin og omfatter ~ 20% av den totale α-tubulin i cellen 9. Viktigere, ikke GFP-Tub1 fusjon ikke redde funksjon av innfødte α-tubulin / Tub1 (JM, upubliserte resultater). Dette er også tilfelle for andre TUB1 fusjonskonstruksjonene 18.

Med de tilgjengelige verktøy for å visualisere mikrotubuli og deres bindende proteiner, spirende gjær er et ideelt system for å studere mutasjoner i tubulins og andre mikrotubulidynamikk regulatorer. I tillegg er det begrensede antallet av tubulin genene tillater direkte studium av et homogent pool av mutant tubulin. I tillegg til mutasjoner iTubulin-gener, spirende gjær har en rekke mikrotubul-assosierte proteiner (kartene) som er homologe med metazo motstykker. Disse kartene kan studeres direkte, og effektene at mutasjoner har på enkelt mikrotubulidynamikk filamenter kan også bli undersøkt. Protokollen detaljert her åpner for gransking av både indre og ytre prosesser som påvirker mikrotubulidynamikk.

Oppsummert må mikrotubuli være dynamisk fungerer ordentlig i mange cellulære prosesser. Det er nødvendig å forstå de faktorer som iboende til tubulin og de ytre assosierte proteiner som regulerer mikrotubulidynamikk. Spirende gjær er et ideelt system for å studere effekten av disse faktorene ved direkte å kvantifisere dynamikken i en enkelt mikrotubuli. Protokollen beskrevet ovenfor beskriver hvordan stabilt å integrere et fluorescerende fusjonsprotein i gjærgenomet og hvordan de kan oppnå og analysere konfokalt bilde stabler for å kvantifisere mikrotubulidynamikk in vivo

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Vi takker Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), og Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) for å dele ulike FP-TUB1 plasmider. Vi er takknemlige for Melissa Gardner (University of Minnesota) for å trene oss i raset kammeret forberedelse metode. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gi R01GM112893-01A1 (til JKM) og T32GM008730 (CE).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DOB (dropout bases) Sunrise science  1650
CSM-Leu Sunrise science  1005
Agar Ameresco N833
100 mm polystyrene plates Fisher Scientific FB0875713
ssDNA (Samon Sperm)  in sterile DiH2O Sigma-Aldrich   D7656 resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Synthetic Complete Media  Sunrise science  1459-100
Concanavalin A Sigma-Aldrich  L7647 resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-1
Microscope Coverslips Fisher Scientific 12-541-B
Parafilm Fisher Scientific 13-374-12 paraffin film
VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) melt at 75 ºC before use
forceps  Fisher Scientific 16-100-106
Poyethylene glycol (PEG) 3350 Sigma-Aldrich  202444
Name Company Catalog Number Comments
Microscope
Ti E inverted Perfect Focus microscope Nikon Instruments MEA53100
1.45 NA 100X CFI Plan Apo objective Nikon Instruments MRD01905
Piezo electric stage  Physik Instrumente P-736
Spinning disk scanner Yokogawa CSU10
Laser combiner module Agilent Technologies MCL400B
EMCCD camera Andor Technology iXon Ultra 897 
Name Company Catalog Number Comments
Software
NIS Elements software Nikon Instruments MQS31100
Microsoft Excel software Microsoft
MATLAB software MathWorks, Inc
ImageJ64 NIH Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.
Bio-Formats Importer plug-in Open Microscopy Environment
Name Company Catalog Number Comments
Plasmids
pUC19-LEU2::GFP-TUB1 pSK1050 reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15, (6), 688-693 (2013).
  2. Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10, (14), 865-868 (2000).
  3. Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124, (1), 511-523 (1975).
  4. Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134, (2), 443-454 (1996).
  5. Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134, (2), 429-441 (1996).
  6. Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190, (4), 1197-1224 (2012).
  7. Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13, (8), 2919-2932 (2002).
  8. Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21, (3), 283-289 (2010).
  9. Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409, (2), 406-419 (2016).
  10. Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27, (11), 1786-1796 (2016).
  11. Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152, (3), 451-469 (2001).
  12. Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15, (10B), 963-972 (1999).
  13. Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12, (9), 2870-2880 (2001).
  14. Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32, (5), 1285-1293 (1993).
  15. Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24, (12), 1295-1303 (2014).
  16. Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277, (5325), 574-578 (1997).
  17. Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177, (6), 981-993 (2007).
  18. Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16, (7), 773-786 (2015).
Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).More

Fees, C. P., Estrem, C., Moore, J. K. High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast. J. Vis. Exp. (122), e55610, doi:10.3791/55610 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter