Summary
여기서는 샘플링 주파수 증가를 허용하고, 개복술을 수행하는 수술에 비해 부작용의 가능성을 감소 원숭이에서 간 및 장간막 림프절 (MLN)의 직렬 샘플링하는 최소 침습 복강경 기술을 설명한다.
Abstract
장간막 림프절 (MLN)과 간은 그들을 면역 학적으로 독특한 제작, 위장 (GI) 기관에서 미생물 및 미생물 제품에 노출되어있다. 위장관 및 관련 MLN 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 감염 초기 바이러스 복제의 사이트이며, MLN도 장기간 항 레트로 바이러스 치료 (ART) 후 잠복 감염된 세포를 항구 가능성이 중요한 저수지 사이트입니다. 간은 렌티 바이러스에 면역 반응에 중요한 역할을하는 것으로 순환에서 바이러스의 정리에 중요한 역할을 할 것으로 보인다되었습니다. 인간이 아닌 영장류가 HIV와 후천성 면역 결핍 증후군 (AIDS)에 대한 (NHP) 모델은 밀접하게 감염에서 중요한 이벤트를 해명하는 데 도움이 될 것입니다 HIV 감염과 바이러스 복제 및이 모델에 관련된 면역 반응의 주 사이트의 일련 종 샘플링의 이러한 측면을 모방, 병인 그리고 이러한 이벤트에 대한 다양한 개입 전략의 영향. CURR천만에 게시 된 기술은 간을 샘플링하고 MLN 함께 같은 동물에서 직렬 방식이 중요한 사이트를 조사 할 수있는 능력을 제한하는 주요 수술 및 / 또는 검시를 포함한다. 우리는 이전에 MLN의 컬렉션에 대한 복강경 기술을 설명했다. 여기서는 MLN의 수집에 필요한 같은 두 포트를 통해 지역 간 MLN 직렬 길이 샘플링하는 최소 침습 복강경 기술을 설명한다. 추가 절개가 필요하지 않습니다 같은 두 개의 포트의 사용은 동물에 미치는 영향을 최소화 할 수 있습니다. 이 기술은 주요 복부 수술에 비해 증가 샘플링 주파수 사용 및 수술 합병증의 가능성을 감소 및 결과의 해석을 복잡하게 할 수 로컬 및 전신 염증 반응을 연결할 수 있습니다. 이 절차는 동물 복지를 향상시키는 동시에 NHP 모델을 포함하는 연구를 촉진하기 가능성이있다.
Introduction
위장 (GI) 관은 신체에서 가장 큰 점막 표면이며 일반적으로 마이크로 바이 (1, 2)로 지칭 식품, 병원균, 박테리아 및 endosymbiotic 커뮤니티로부터 유도 항원의 무수에 노출된다. 장간막 림프절 (MLN)은 위장관 라인 이러한 다양한 항원에 대한 염증 또는 tolerogenic 반응을 촉진 면역 기능의 주요 사이트입니다. MLN의 물리적 조직은 로컬 전신 반응 (3)을 도출하지 않고 항원에 반응 할 수있는 구획 시스템을 만듭니다. 마찬가지로, 순환 복귀, 따라서 고유 층으로 위장관에서 전좌와 혈류 4를 입력 한 미생물 및 미생물 제품에 노출되기 전에 포털 정맥의 방법으로 간을 위장관 빼낸 혈액. 간은 또한 차 림프 기관 A와 기능ND는 전위 된 미생물 5, 6을 제거하는 전문 식세포를 포함하는 면역 세포의 큰 숫자를 가지고 있습니다. 따라서, MLN과 간은 위장관에서 공생과 병원성 세균에 노출 차 면역 기관뿐만 아니라 다른 소스에서 항원의 환경이되어 면역 학적 관점에서 그들이 독특하고 중요한 만들기.
MLN 인간 면역 결핍 바이러스 (HIV) 또는 병원성 유인원 면역 결핍 바이러스 (SIV) 감염의 바이러스 학적 및 면역 학적 효과의 평가를위한 중요한 사이트이며, 가능성이 직장 내 반칙으로 SIV의 조기 보급에 참여하고 있습니다. 창자 관련 림프 조직은 현대적인 항 레트로 바이러스 치료 (ART) (7)에 의한 바이러스 혈증의 효과적인 통제에도 불구하고, 지속적인 HIV 복제의 주요 사이트로 알려져있다. SIV 감염 모델에서, MLN 잠재 바이러스의 중요한 저수지 것으로 나타났다 및 수도있다주 저장 8,9 될. 급성 SIV 감염 원숭이 10시 간에서의 SIV 특이 CD8 + T 세포의 축적에 의해 입증되는 바와 같이 간은 렌티 바이러스 감염과 같은 중요하다. 또한, 순환 11에서 바이러스를 삭제에 대한 책임이있는 주요 기관이다.
HIV와 SIV 감염이 변경된 GI의 미생물과 관련된, 위장관 상피 무결성을 중단하고, 주변 순환 (12), (13)에 결장에서 미생물 및 미생물 제품의 전위를 증가했다. 이러한 프로세스는 지역 및 전신 면역 활성화와 관련, 및 HIV 감염자 14 이환율과 사망률을 증가합니다. SIV 감염, 박테리아 MIC 전좌의 축적, 반면 MLN 15에서 관찰 된간에서 robial 제품은 기관 (16)에 염증과 손상을 초래할 것으로 나타났다. 따라서, HIV 및 SIV 감염의 맥락에서, MLN 간은 GI 상주 균에 의해 구동되는 염증 과정을 이해하는데 매우 유익 할 수있다.
여기서, 우리는 비 - 인간 영장류 (NHPs)에 직렬 MLN의 채취 및 간을위한 최소 침습 복강경 기술을 제시한다. 우리는 각 수술 사이에 각 동물 160일로 2 회, 샘플링, 두 개의 건강한 여성 붉은 털 원숭이 (RMS)에이 기술의 성공적인 성능을 보여줍니다. 우리는 두 시점 사이의 매우 일관된 데이터를 평가하고 유동 세포 계측법 사용하여 각 기관 내에서 키 백혈구 및 림프구 인구를 비교하고, 입증이 샘플을 사용하기에 이동합니다.
Protocol
동물 보관하고 평가 및 인증 실험 동물 관리의 국제 (AAALACi) 공인 시설 협회에서 보살핌, 모든 동물의 절차는 기관 동물 케어 및 사용 워싱턴 대학위원회 (IACUC)에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수행 하였다되었다 워싱턴 국립 영장류 연구 센터.
1. 제조 외과, 마취, 무통
- 진정 작용 및 유도
- 10 ㎎ / ㎏의 케타민 및 (한 주사기 결합) 0.015 ㎎ / ㎏ 덱스 메데 토미 딘의 근육 내 주사와 진정 원숭이. 케이지에서 제거하기 전에 철수 반사의 부재를 확인합니다.
- 동물을 삽관하고 이소 플루 란 마취를 사용하는 평면에서 동물 유지 (1.0 - 2.5 %) 및 100 % 산소. , 원숭이 17 삽관 및 전신 마취에 대한 자세한 내용은 참조를 참조하십시오REF "> 18, 19.
- 마취 지원 및 모니터링
- 말초 정맥 카테터를 삽입하고 마취 및 수술에 걸쳐 5 ㎖ / kg / h의 속도로 (예를 들면 락 테이트 화 링거 용액) 등장 성 정맥 내 유체를 제공한다. 각막 건조를 방지하기 위해 멸균 눈 윤활제를 적용합니다.
- 이러한 부 프레 노르 핀의 서방 성 제제 (0.2 ㎎ / ㎏, 피하)로, 진통제를 제공한다.
주 : NSAID (예 멜 록시 캄 또는 케토 프로 펜 등)과 같은 실험 프로토콜 NSAID 투여를 허용하도록 제공 마취 회복 중에 제공 될 수 있고 그 동물은 정상 혈압 마취 동안 잘 수화. - 마취 및 수술 내내 마취 깊이 (예 턱 톤), 심장 박동, 호흡 속도, EKG, 혈압, 맥박 산소, 단 조력 CO 2, 체온을 모니터링.
참고 : 복부가 채워 넣고 때, 동물 hypoventilate 수 있습니다.호흡 속도가 감소하거나 단부 조력 CO 2 레벨이 45 mmHg로 이상이면 기계적 환기. - 수술 후, 덱스 메데 토미 딘 반전 용 atipamezole (0.15 밀리그램 / kg, 근육 내)을 투여.
- 수술 준비
- 절차 20시 시각화 및 장 조작을 돕기 위해 대장에서 대변의 양을 줄이기 위해 여러 따뜻한 물 관장을 수행합니다.
- 수 (40) 블레이드를 사용하여 가위는 수술 부위에서 머리카락을 제거합니다. 치골에 늑골 능선에서 오른쪽 측면에 왼쪽에서 면도.
- 무균는 클로르헥시딘 알코올 또는 포비돈 - 요오드 알코올 수술 교대 적절한 방부제를 사용하여 수술 부위를 준비한다.
- 등쪽과 오른쪽 측면 드러 누움 사이의 각도의 중간에서의 배부에 운영 테이블에 동물을 배치합니다. 확장 된 위치에 밧줄로 팔과 다리를 묶어. 최종 chlorhexi 제공동물 수술실로 이동하고 수술 위치되면 식사 알코올 준비.
2. 수술
참고 : 작은 동물의 복강경 수술의 자세한 내용은 21를 참조하십시오.
- 복강경 악기 준비
- 멸균 유창 드레이프와 동물을 드레이프.
- 비 멸균 조수의 도움으로, 멸균 카메라 드레이프와 디지털 카메라를 감싸고 탑에 케이블을 연결합니다. 카메라 헤드 강성 범위를 부착.
- 강성 범위로 멸균 광 케이블을 연결 및 광원에 케이블을 연결한다. 화이트 제조업체의 지침에 따라 카메라를 균형.
- 주입기에 멸균 주입기 튜브를 연결합니다.
- 복강경 항목
- A # 15 메스를 사용하여 복부 근육, 응용 프로그램의 깊이로 피부를 통해 ~ 5mm의 자상 절개를roximately 1 - 배꼽의 왼쪽에 2cm.
- 비 지배적 인 손을 사용하여, 자상 절개의 사이트에 복벽의 두개골을 올립니다. 지배적 인 손으로 절개 각도 선단 두개쪽으로 통해 Veress 바늘의 선단을 배치.
참고 : Veress 바늘의 침투 각도는 동물의 몸 상태에 따라 달라집니다. 예를 들어, 지방 동물에서 Veress 바늘은 거의 복부 벽에 수직으로 삽입해야합니다. 얇은 동물에서 Veress 바늘은 내장 접촉의 위험을 줄이기 위해 두개쪽으로 기울어해야합니다.- Veress 바늘의 축 (되지 허브) 지주 단단히 복강 복벽을 관통하는 바늘을 누른다. 뚜렷한 "클릭"과 날카로운 선단이 복막 앞으로 복강 내로 Veress 바늘 스프링의 무딘 팁을 관통로 저항 감소 생각한다.
참고 : 바늘이 일에 적절하게 통과하면2cm은 1 - 고급 배출되면 전자는 복강 작은 저항이있을 것이다.
- Veress 바늘의 축 (되지 허브) 지주 단단히 복강 복벽을 관통하는 바늘을 누른다. 뚜렷한 "클릭"과 날카로운 선단이 복막 앞으로 복강 내로 Veress 바늘 스프링의 무딘 팁을 관통로 저항 감소 생각한다.
- 바늘에 CO 2 입기 튜브를 연결하고 꼭지를 엽니 다. pneumoperitoneum을 만들기 위해 더 이상 10 ~ 12 mmHg 이하로 복부에 압력을.
주 :이 대칭 적으로 팽창되면 배는 이상적인 통기를 달성하고 늑골 마진 정상 날카로운 형상의 손실이있다. 압력은 장기 접촉의 위험없이 정맥 / 투관침의 삽입을위한 충분한 공간을 제공한다.
- 정맥 배치
- 마지막 갈비뼈에 4cm의 꼬리 - 복부 근육 ~ 2 왼쪽 두개골 복부의 피부를 통해 # 15 메스 블레이드와 7mm 절개 - 복부가 완전히 채워 넣고되면, 5 ~합니다.
- caudomedially 60도 - 피부를 절개하고 그 각도 ~ 45 통해 5mm 투관침-뉼러 조립체를 놓는다. 1-2 cm의 깊이로 복강 침투. Scre1.5의 깊이 - 정맥 (1cm 더 ~ 0.5) - 회전시켜 복부 정맥 내로 나사 승 3cm를 상기 투관침을 제거한다.
- 의 Veress 바늘에서 주입기 튜브를 제거 꼭지를 끄고 바늘을 제거합니다. 캐 뉼러에 주입기 튜브를 연결하고 더 이상 10 이상에서 pneumoperitoneum을 유지하기 위해 꼭지를 엽니 다 - 12 mmHg로.
- 캐뉼라를 통하여 복강 내로 강성 범위를 삽입한다.
- 카메라 시각화에서 Veress 바늘 삽입에 사용되는 이전의 피부 절개에서 복부 근육과 복막을 통해 # 15 메스 블레이드와 작은 절개를 만들기 위해 계속합니다. 카메라가 혈관을 피하고 출혈을 최소화하기 위해 절개의 복부 측면을 시각화하기 위해 사용된다.
참고 : 근육을 통해 절개를 확인하고 복막이 장간막 (~ 0.5 cm)의 프로브의 입력과 exteriorization을 용이하게하기에 충분히 크다. 더 큰 절개 mesent을 외면 화하다해야 할 수 있습니다과도한 장간막 지방과 동물의 ery. - 머리 위 30 ° - 약 15 피트 상승과 Trendelenburg 위치 (21)에 동물을 놓는다. 이 옵션이지만 더 두개골 위치로 이동합니다 작은 창자와 결장의 장간막 림프절에 쉽게 액세스를 허용 할 수 있습니다.
- 장간막 림프절 생검
- 카메라 시각화 하에서, 단계 2.3.5에서 만들어진 복부 절개를 통해 고체 탐침을 삽입한다.
- 복막 및 창자 사이에 프로브를 넣고 가볍게 하부 장간막의 시각화를 허용하도록 장 오프 대망 청소하는 청소 동작을 사용한다. 두개골 복부에 꼬리에서 청소 운동을 계속 사용. 이 수술 필드를 벗어나도록 대망는 오른쪽 두개골 복부에 배치 할 수 있습니다.
- 왼쪽 또는 오른쪽 복부 벽쪽으로 하행 결장을 이동 프로브를 사용합니다. 이것은 t의 더 나은 시각화 수 있습니다그는 장간막 림프절에 대한 검색에 도움이 장간막.
- 콜론과 장간막 혈관을 따라 장간막 림프절의 위치를 장간막을 통해 청소하기 위해 프로브를 사용합니다.
참고 : 콜론의 장간막 국경을 따라 실행 대장 노드는 왼쪽 심한 복통 노드는 선박의 분기점 근처에서 발견 할 수 있으며, 장간막 노드는 장간막 혈관을 따라 발견 할 수있다. 장간막 림프절 린 동물에서 쉽게 볼 수 있습니다. 장간막 지방에 묻혀 때 그들은 종종 위에 놓인 장간막에 약간 상승, 반짝이는 외관 빌려 것이다 다음 장간막 지방을 둘러싼 더 많은 잿빛 황갈색 수 있습니다. 또한, 장간막 림프절은 림프관 및 장간막 혈관을 따라 거짓말을하는 경향이있다. - 림프절이 식별되면, 상기 프로브를 분리하고 복강 메릴랜드 래칫 겸자를 삽입한다. 인접한 타겟 노드를 파악하는 장간막 나이프를 사용한다. INCI으로 장간막을 당겨시온과 정맥의 범위를 제거합니다.
- 주입기의 전원을 끄고 장간막의 exteriorization을 용이하게하기 위해 복부의 압력을 감소 오픈 정맥 꼭지를 떠난다. 절개를 통해 신체의 외부 장간막을 당깁니다. 표면화되면, 절개를 통해서 액세스를 보장하기 위해 만곡 모기 지혈제 또는 엄지와 집게 장간막 파악.
- 탄력 림프절 및 / 또는 더 회색 색상 또는 림프절의 마디 모양의 직접 시각화 palpating하여 표면화 내의 장간막 림프절 (들)을 식별한다.
- 지혈제 곡선을 사용하여 노드 근처에있는 장간막 - (5mm ~ 3)에 의해 식별되면, 작은 개구를 만든다. 곡선의 지혈제로 무딘 절개를 사용하여 장간막 무료 첨부. 필요에 따라 4-0 비 흡수성 모노 필라멘트 봉합사와 혈관을 결찰. 림프절을 제거하는 메스와 날카로운 절개를 사용합니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소의 노드 (RPMI) 중간에 1640 배치얼음.
- 출혈에 대한 표면화 장간막을 검사합니다. 출혈이 언급되는 경우, 또는 소작 이용하여 지혈 또는 결찰 (4-0 비 흡수성으로하는 모노 필라멘트 봉합사)과 혈관을 폐색하여 적절한 지혈을 제공한다. 장간막을 해제하고 10 복부를 다시 insufflate - 장간막이 복강으로 돌아 할 수 있도록 12 mmHg로.
- 반복하여 림프절 생검을 얻기 위해 2.4.8을 통해 2.4.1 단계를 반복합니다.
- 간 생검
- 수평 위치에 테이블을 돌려줍니다.
- 이전 (단계 2.3.5로 만들어진 절개) 림프절 생검 컬렉션에 사용 복부 절개를 통해 캐뉼라로 나사를 놓는다. 투관침 삽입없이 정맥 배치를 허용하는 - (7mm ~ 5) 절개가 충분히 큰 확인합니다. 뇌 복강 향해이 캐 뉼러를 통해 강성 영역을 삽입하고 뇌 복부 간 시각화.
- 카메라 시각화에서 생검 F를 삽입캐뉼라를 통해 orceps는 이전 좌측 두개골 복부 (단계 2.3.1로 만들어진 절개)에 두었다.
- 간 생검을 수득 간 대향 턱 가동부와 상기 선택된 간 로브 마진 아래 생검 겸자를 배치 포셉을 열고 마진 개방 조우 빠질 수 있도록한다. 더 대망가 간 생검 겸자 사이 없는지 확인합니다. 나이프의 위치를 조정하여 원하는 샘플 영역 위에기구를 닫는다.
- 30 초 지혈을 위해 - 약 20가 압력을 유지한다. 나이프 닫은 부드럽게 뉼러를 통하여 집게를 들어 올려, 샘플을 제거한다. 이 부드럽게 간에서 조직 검사를 찢어 것입니다. 얼음에 RPMI 1640 배지에서 간 조직 검사를 놓습니다.
주 : 간 생검 크기는 약 5mm 생검 겸자를 사용하여 X 5mm 2mm × 2 mm이다.
- 30 초 지혈을 위해 - 약 20가 압력을 유지한다. 나이프 닫은 부드럽게 뉼러를 통하여 집게를 들어 올려, 샘플을 제거한다. 이 부드럽게 간에서 조직 검사를 찢어 것입니다. 얼음에 RPMI 1640 배지에서 간 조직 검사를 놓습니다.
- 카메라 시각화를 사용하여 출혈 생검 사이트를 검사합니다. 출혈이 관찰되는 경우, 식염수 moistene를 배치캐뉼라를 통해 D 멸균 면봉과 생검 부위에 압력을 적용한다. 또한, 지혈을 돕기 위해 살균 젤 거품 생검 사이트를 팩.
- 반복하여 간 조직 검사를 얻기 위해 2.5.5을 통해 2.5.3 단계를 반복합니다.
참고 : 여기, 절차 당 동물 당 3 생검 수집, 모든 다운 스트림 분석에 충분하다.
- 외과 폐쇄
- 출혈 복강을 조사한다.
참고 :이 현재까지 발생하지 않았다. 과도한 출혈이 기록 된 경우에는, 출혈 부위를 확인하고 멸균 면봉 또는 겔 발포체의 사용에 적절한 압력을 통하여 지혈을 제공한다. - 주입기의 전원을 끄고 캐 뉼러의 마개를 엽니 다. 완전히 복강의 압력을 감소하기 위해 복부에 부드러운 수동 압력을 적용합니다. 캐뉼라를 제거합니다.
- 사이트 당 1 ~ 2 간단한 중단 봉합과 복벽 절개의 각을 닫습니다. 4-0 흡수성 봉합사를 권장합니다.
- 지역의 진통을 위해 사전 피부 폐쇄 각 절개에서 0.1 ~ 0.3 CC bupivacaine을 배치하여 스플래시 블록을 수행합니다.
- 사이트 당 2 매장 중단 봉합 (4-0 흡수성 봉합사 권장) - 1로 피부를 닫습니다. 조직 접착제가 도포 될 수있다.
- 출혈 복강을 조사한다.
3. 간 생검 처리 및 림프구 분석
- 간 조직의 여러 개 저장소 (약 0.5 mm X 0.5 mm 크기의 X 0.5 mm) 미래 분자 학적위한 바람직한 RNA 저장 용액에서 동결 보존 용 튜브에, 10 % 포르말린 분석.
- 뚜껑 멸균 250ml의 플라스틱 컵에 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신, 상업적으로 이용 가능한 콜라게나 제 용액 40 ㎍ / ㎖, 4 ㎍ / ㎖의 DNase를 보충 된 50 ㎖의 RPMI 1640 배지에 남아있는 간 생검을 놓는다. 격렬 자기 교반 막대 및 37 ° C에서 1 시간 동안 교반 플레이트를 사용하여 교반 하였다.
- 균등하게 소화 조직을 부어 배포 할 수 있습니다. 할머니두 개의 70 ㎛의 필터를 통해 (단계 3.1.1)에서 분해 된 조직 산업사 멸균 5 ㎖ 주사기의 끝을 사용하여 단일 세포 현탁액 내로 개의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 장착한다. RPMI 10 % 소 태아 혈청 및 1X 페니실린 / 스트렙토 마이신 (R10)로 보충 1640 배지를 50ml로 두 튜브의 양을 준비한다.
- 4 ℃에서 6 분 동안 840 XG에서 세포를 원심 분리기. 뜨는을 가만히 따르다. 5 ㎖ 튜브 R10 모두에서 세포를 현탁 한 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 결합하여 하나의 50 ㎖ 원뿔형 튜브에 세포를 농축시켰다. R10를 사용하여 50 mL의 용적을 가지고. 세포 수율을 결정하는 혈구를 사용하여 세포를 계산합니다.
- 4 ℃에서 6 분 동안 840 XG에서 세포를 원심 분리기. 1 mL의 R10에서 세포를 재현 탁 두 5 ㎖ 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 균등하게 분배하고, 각 관> 500,000 세포 타겟팅 R10 4 mL를 각 튜브의 양을 가져온다.
- 4 ℃에서 6 분 동안 840 XG에서 세포를 원심 분리기. 의 S를 가만히 따르다upernatant 4 ㎖의 인산 완충 식염수 (PBS)으로 세포 펠렛을 재현 탁. 4 ℃에서 6 분 동안 840 XG 원심 분리기.
- 상등액을 가만히 따르다 가볍게 볼 텍싱하여 PBS 100 ㎕에 세포를 재현 탁. 고칠 수 죽은 세포 얼룩의 1.5 μL를 추가합니다. 실온에서 5 분 동안 인큐베이션.
- CD45-를 PerCP (복제 D058-1283), CD3-PE-CF594 (복제 SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (클론 2H7), CD4-BV605 (: 제조업체에서 권장하는 역가에 다음 원액 표면 얼룩 항체 추가 클론 OKT4), CD8-BV570 (클론 RPA-T8) 및 CD14-BV785 (클론 M5E2). 20 분 동안 4 ℃에서 인큐베이션.
- 39 ° C에서 6 분 동안 840 ㎖의 PBS XG에 원심 분리기 (4)을 추가한다. 상등액을 경사 분리하고 PBS 중 1 % 파라 포름 알데하이드 250 μL에 세포를 재현 탁.
주의 : 파라 포름 알데히드는 독성이있다. 적절한 개인 보호 장비를 착용하십시오. - 참조로서 22에서 설명한 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 집단을 분석한다.
Representative Results
이러한 장기 복강경 수집 MLN의 처리를위한 상세한 방법뿐만 아니라 셀룰러 수율 및 백혈구 주파수 이전 13보고되었다. 그림 1은 이러한 복강경 기술을 사용하여 두 개의 건강한 여성의 RM (160)으로부터의 일 간격이 개 시점에서 수집 MLN을 비교 세포 수율과 생존 데이터 및 간 생검을 보여줍니다. 우리는 MLN에서 셀룰러 수율은 각각 수득 33.5 × 106 및 6.74 × 106 세포의 평균 간 (P = 0.0021)에서보다 훨씬 높은 것을 발견했다. 유동 세포 계측법에 의해 사균 염색 및 분석 모두의 장기에서 분리 된 세포의> 90 %가 생존 하였다 것으로 나타났다.
유동 세포 계측법을 사용하여, 우리는 평가와 MLN 및 간에서 백혈구와 림프구의 풍요 로움을 비교 하였다. 간을위한 대표 게이팅 방식은 같다
직렬 수집 MLN 및 간 생검에서 그림 1. 전체 휴대 수익률 (위)와 세포 생존 능력 (아래). MLN은 간을보다 상당히 높은 세포 수율을 보였다. 그러나, 두 샘플 유형 하류 분석을위한 충분한 세포를 제공 하였다. 유량 측정 cytom 세포 생존,etrically 정착 사균 아민 염색을 이용하여 두 종류의 샘플은 일반적으로 조직의 분리 후> 90 %의 세포 생존율을 산출되었습니다. 오차 막대는 샘플 사이의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 대표 유동 세포 계측법 게이팅 전략. 먼저, 응집 세포를 정착 사균 아민 염색을 이용하여 염색 한 후에 만 생존 세포의 선택에 따라, 제외 하였다. 다음으로, CD45 + 백혈구가 선택 CD3 + T 세포의 선택에 의해 관찰 하였다. CD3 + 인구에서 CD4 +와 CD8 + T 세포를 분석 하였다. CD3에서 - 인구, CD14 + 및 CD20 + 세포를 분석 하였다. 티 의 게이팅 전략도 MLN에 사용되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
MLN와 두 동물 종 방향의 간에서 그림 3. 유동 세포 계측법의 플롯. MLN 간 샘플은 모두 동물 160 일 간격 수집되었다. (A). MLN는 CD45 + 세포 (백혈구); (B) 간 CD45 + 세포 (백혈구); (C) MLN + CD3 + 세포 (T 세포); (D) 간 CD3 + 세포 (T 세포). 두 동물의 경우, MLN은 간장에 비해 CD45 + 및 CD3 + 세포의 높은 비율을 보였다. 시간에 걸쳐, 이러한 인구의 주파수는 모두 동물 비슷했다.S / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg "target ="_ blank "> 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 CD45 + (왼쪽)의 셀 (4) 주파수 및 다양한 백혈구 23 개 개인 샘플링 부분 집단 간 림프구 (오른쪽). 간은 각 기관의 고유 기능을 보여주는 CD14 + 백혈구의 상당히 큰 주파수를 보였다 동안 MLNs는, CD45 +, CD3 +, 및 CD4 + 세포의 상당히 큰 주파수를 표시. 오차 막대는 샘플 사이의 표준 편차를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
Discussion
여기서 우리는이 연구에 설명되지 않은 이들과 다른 동물에서 100 % 성공률을했다 일련 MLN의 수집 및 간 조직 검사를위한 최소 침습 기술을 보여줍니다. 또한, 시간에 걸쳐 같은 동물이 기술의 사용은 어떤 부작용과 관련되지 않았습니다. 실제로, SIV, 유인원 / 인간 면역 결핍 바이러스 (SHIV), 또는 Zika 바이러스 (게시되지 않은 데이터)에 감염된 동물의 다른 집단에서이 기술의 사용으로 인한 합병증은 없었다. 마찬가지로,이 수술은 심지어 이전에 주요 복부 수술을받은 동물과 혈소판 동물 (게시되지 않은 데이터)에 성공적으로 입증되었습니다. 우리는 추가로 절개에 대한 필요성을 회피간에 MLN에서 스위칭 할 때 이들 샘플은 카메라 위치를 반전 같은 두 개의 포트를 통해 수집 될 수 있음을 보여 주었다. MLN의 수집에 영향을 미치는 요인은 이전 13보고되었다.
완료 45 분 두 ~ 0.5 cm 절개를 통해 수행된다 - 전체 절차는 일반적으로 30 걸린다. 비만 동물에서는 더 큰 절개 할 필요가있을 수있다 -을 통해 MLN를 검색 (1 ~ 1.5 cm)를 완료하기 위해 추가 시간이 필요할 수 있습니다. 광범위한 장간막 지방과 동물은 종종 D에 상당한 경험을 필요로주변 지방에서 MLN을 ifferentiate. MLN은 종종 장간막 혈관을 따라 발견과 혈관의 분기점 근처 더 널리 퍼진 것 같다된다. 이 기술의 중요한 양상은 장간막에서 복부 절개를 통해 표면화 될 충분한 이동성을 갖도록 선택 MLN을 필요로한다는 것이다. 그 결과,이 기술은 장간막의 루트에 MLN 가까이를 수집하는 데 사용할 수 없습니다. 때문에 확대, 그것은 카메라와 함께 MLN를 식별하고, MLN에 근접 파악하는 위치와 그것이 표면화되면 노드를 식별하는 데 도움이 쉽게 시간입니다.
Trendelenburg 위치의 사용은 항상 MLN 수집에 필요하지 않을 수 있으며, MLN 쉽게 Trendelenburg 위치를 사용하지 않고 검색 할 수있는 경우는 두개쪽으로 이동에서 장기를 차단하므로 간 조직 검사를 쉽게 할 수 있습니다. 때때로, Trendelenburg 위치에 배치 한 후, 간은 횡격막해야 대항 이동 부드럽게 다시 조직 검사 모음 이전 위치로 조작 할 수. MLN 컬렉션의 포트 위치가 좌측에있는 바와 같이들은 캐뉼라에 가까운만큼, 간 생검은 일반적 좌측 및 좌측 측면 간 중간 엽에서 촬영된다.
MLN 수집 간 생검 하류 다양한 분석을위한 충분한 세포 수율을 제공하고, 수집 된 세포의 높은 가능성을 보여 주었다. 여기에, 세포는 백혈구와 림프구 인구의 유세포 분석을 위해 염색,이 두 가지 중요한 면역 기관 사이의 키 차이가 밝혀졌다. 예를 들어, MLN이 높은 염증성 관리뿐만 아니라 CD4 + T의 중요성에 대한 수집 및 적응 면역 반응을 전파하기위한 중앙 점과 MLN의 중요성 때문에, 간장에 비해 CD4 + T 세포에 대한 풍부하고 환경에 tolerogenic 응답은식이 섭취와 GI 상주 미생물에서 유래 된 항원S = "외부 참조"> 24. 그러나, 간은 크게 MLN에 비해 CD14 + 백혈구에 대한 풍부한했다. CD14은 단핵구 및 대 식세포에 주로 발현 및 세균성 리포 폴리 사카 라이드 (LPS) (25)에 대한 수용체 복합체의 주요 구성 요소이다. 실제로, 가용성 CD14의 증가 된 혈장 농도는 미생물의 전좌 및 HIV의 면역 활성화 및 병원성 SIV 감염 (26)과 연관된다. MLN 비교할 때 즉, 간에서 CD14 + 백혈구 고주파수 가능성이 큰 장기 세균 부담 기인한다.
여기서 우리는 일련 MLN의 수집 및 부작용을 주도하지 않은 복강경 항목에 대한 두 개의 작은 절개를 이용하여 간 생검에 대한 신속하고 최소 침습 수술 기법을 보여줍니다. 이 샘플은 괞 찮아을 주요 면역 학적, 바이러스 학적, 미생물 학적 프로세스를 평가하는 유용한 경로를 제공면역 조직으로부터 분리하고 고유 한 MLN 간에서 CE. 마찬가지로, 간 조직 검사는 종종 큰 간 손상 (16)을 유도 결합 HIV / SIV, 약물 치료, 그리고 전위 된 미생물의 효과의 장기 평가를 위해 중요하다. MLN 간은 GI의 미생물에 노출 된 면역 기관이기 때문에 또한, 능력이 시간에 걸쳐 이들 기관에 내성을 평가하기 위해 마이크로 바이 옴 호스트 면역 항상성을 유지하는 역할을 이해하기위한 훌륭한 플랫폼을 제공합니다. 함께 찍은 간 평가 및 MLN 백신 및 치료 효능, SIV 바이러스 저수지 통관, 일반 점막 면역의 맥락에서 주요 중요하다. 최소한의 침습적 인 방법을 통해 이러한 샘플을 수집 할 수있는 능력은 현재 게시 된 기술과 동물의 생리에 미치는 영향 존재보다 절차와 관련된 염증 덜 위험이 있다는 것을 의미한다. 푸에진짜야, 우리는에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다 면역 시스템의 또 다른 중요하고 서로 다른 부분의 샘플링이 가능하도록 동일한 두 포트 위치를 통해 비장의 수집과 MLN의 수집 및 간 결합 가능성을 평가합니다 질병 모델의 수.
Disclosures
저자는 더 경쟁 재정적 이익을 선언합니다.
Acknowledgments
이 작품은 NIH 교부금 번호 P51OD010425에 의해 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
