Summary
Här beskriver vi en minimalinvasiv laparoskopisk teknik för serie provtagning av lever och kröslymfknutor (MLN) i makaker som möjliggör ökad samplingsfrekvens, och minskar risken för kirurgiska komplikationer jämfört med att utföra en laparotomi.
Abstract
De mesenteriska lymfnoder (MLN) och levern exponeras för mikrober och mikrobiella produkter från det gastrointestinala (GI) kanalen, vilket gör dem immunologiskt unika. Gl-kanalen och tillhörande MLN är områden av tidig viral replikation i humant immunbristvirus (HIV) -infektion och MLN är troliga viktiga reservoarställen som härbärgerar latent infekterade celler även efter långvarig antiretroviral terapi (ART). Levern har visat sig spela en viktig roll i immunsvar mot lentivirus och verkar spela en viktig roll i clearance av virus från cirkulation. Icke-human primat (NHP) modeller för HIV och förvärvat immunbristsyndrom (AIDS) noga efterlikna dessa aspekter av HIV-infektion och serielängd provtagning av primära platser i virusreplikation och tillhörande immunsvar hos denna modell kommer att bidra till att belysa viktiga händelser i infektion, patogenes och effekterna av olika åtgärdsstrategier på dessa händelser. Current publicerade tekniker för att sampla levern och MLN tillsammans omfattar större operation och / eller obduktion, vilket begränsar möjligheten att undersöka dessa viktiga platser i ett seriellt sätt i samma djur. Vi har tidigare beskrivit en laparoskopisk teknik för insamling av MLN. Här beskriver vi en minimalinvasiv laparoskopisk teknik för seriell längd provtagning av levern och MLN genom samma två port platser som krävs för insamling av MLN. Användningen av samma två portar minimerar påverkan på djuren som inga ytterligare snitt krävs. Denna teknik kan användas med ökad frekvens samplings jämfört med stor bukkirurgi och minskar risken för kirurgiska komplikationer och tillhörande lokala och systemiska inflammatoriska reaktioner som kan komplicera tolkningen av resultaten. Detta förfarande har potential för att underlätta studier med NHP modeller samtidigt förbättra djurskyddet.
Introduction
Den gastrointestinala (GI) kanalen är kroppens största mukosal yta och är utsatt för en myriad av antigener härledda från livsmedel, patogener, och endosymbiotiska bakteriella gemenskaper som vanligtvis kallas den microbiome 1, 2. Mesenteriska lymfnoder (MLN) kantar GI-kanalen och är en huvudsaklig plats av immunfunktion för främjande inflammatoriska eller tolerogena responser mot dessa olika antigener. Den fysiska organisationen av MLN skapar en compartmentalized system som kan svara på antigener lokalt utan att framkalla systemiska responser 3. På liknande sätt, blod från mag-tarmkanalen avlopp till levern via portvenen innan de återvänder till cirkulationen, och är således utsatta för mikrober och mikrobiella produkter som har translokerade från det gastrointestinala systemet i lamina propria och kommit in i blodomloppet 4. Levern fungerar också som ett sekundärt lymfoidorgan ennd har ett stort antal av immunceller, inklusive specialiserade makrofager, för att avlägsna translokerade mikrober 5, 6. Sålunda, MLN och levern är de primära immun organ som exponerats för kommensalism och patogena bakterier från mag-tarmkanalen, såväl som den miljö av antigener från andra källor, vilket gör dem unika och viktiga ur en immunologisk synvinkel.
Den MLN är kritiska platser för utvärdering av virologiska och immunologiska effekter av humant immunbristvirus (HIV) eller patogena simian immunbristvirus (SIV) infektion, och är sannolikt inblandade i början av spridning av SIV efter intrarektal utmaning. Tarmassocierade lymfoid vävnad är känd att vara en viktig plats av ihållande HIV-replikation, trots effektiv kontroll av viremi av moderna antiretroviral behandling (ART) 7. I SIV infektion modeller har MLN visat sig vara viktiga reservoarer av latent virus och kanvara den primära reservoaren 8, 9. Levern är också viktig i lentiviral infektion såsom bevisas genom ackumulering av SIV-specifika CD8 + T-celler i levern hos makaker under akut SIV-infektion 10. Vidare är det viktigt organ som ansvarar för att rensa viruset från cirkulationen 11.
HIV och SIV-infektion är associerade med förändrad GI mikrobiota, störde GI epitelial integritet och ökad translokation av mikrober och mikrobiella produkter från kolon in i periferin och cirkulationen 12, 13. Dessa processer är förknippade med lokal och systemisk immunaktivering och ökad sjuklighet och dödlighet hos HIV-infekterade individer 14. I SIV infektion har translokerade bakterier observerats i MLN 15, medan ansamling av microbial produkter i levern har visats resultera i inflammation och skada på organ 16. Således, i samband med HIV och SIV-infektioner kan MLN och lever vara mycket informativ för att förstå de inflammatoriska processer som drivs av GI-bosatt bakterier.
Här presenterar vi en minimalinvasiv laparoskopisk teknik för seriell provtagning av MLN och lever i icke-mänskliga primater (NHP:). Vi visar framgångsrika resultat av denna teknik på två friska kvinnliga rhesusmakaker (RMS), provtagning varje djur två gånger, med 160 dagar mellan varje operation. Vi går på att använda dessa prover för att utvärdera och jämföra viktiga leukocyter och lymfocytpopulationer inom varje organ med användning av flödescytometri och visa mycket konsekvent data mellan de båda tidpunkterna.
Protocol
Djuren inhystes och vårdas i Föreningen för bedömning och ackreditering av Laboratory Animal Care International (AAALACi) ackrediterade anläggningar och alla djurförsök utfördes enligt protokoll som godkänts av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) vid University of Washington och Washington National Primate Research Center.
1. Kirurgisk förberedelse, Anaesthesia, and Analgesia
- Sedering och induktion
- Stillsam makak med en intramuskulär injektion av 10 mg / kg ketamin och 0,015 mg / kg dexmedetomidin (kombinerade i en spruta). Säkerställa frånvaro av abstinens reflexer före avlägsnandet från buren.
- Intuberas djuret och upprätthålla djuret i ett plan över allmän anestesi med användning av isofluran (1,0-2,5%) och 100% syre. Se referenser för ytterligare information om intubation och narkos i makaker 17,ref "> 18, 19.
- Anestesi Support and Monitoring
- Infoga en perifer venkateter och ge intravenösa isotona vätskor (såsom lakterad Ringers lösning) vid en hastighet av 5 ml / kg / timme under hela anestesi och kirurgi. Applicera steril ögon smörjmedel för att förhindra hornhinnan torrhet.
- Tillhandahålla analgesi, såsom en formulering med fördröjd frisättning av buprenorfin (0,2 mg / kg, subkutant).
OBS: En NSAID (såsom meloxikam eller ketoprofen) kan också tillhandahållas under anestesi återhämtning, under förutsättning att det experimentella protokollet tillåter NSAID administration och att djuret är normotensiva och väl hydrerad under anestesi. - Övervaka anestesidjup (t.ex. käftston), hjärtfrekvens, andningshastighet, EKG, blodtryck, puls syresättning, end tidal koldioxid 2, och kroppstemperatur genom hela anestesi och kirurgi.
OBS: När buken blåses kan djuret hypoventilate.Tillhandahålla mekanisk ventilation om andningsfrekvensen minskar, eller änd-tidal CO2 nivåer är över 45 mmHg. - Efter kirurgi, administrera atipamezol (0,15 mg / kg, intramuskulärt) för dexmedetomidin omkastning.
- kirurgisk förberedelse
- Utför flera varmt vatten lavemang för att minska volymen av avföring i tjocktarmen för att underlätta visualisering och tarm manipulation under förfarandet 20.
- Använd Clippers med nummer 40 blad för att ta bort hår från kirurgiska området. Raka från kust åsen till pubis och från vänster till höger flank.
- Aseptiskt förbereda det kirurgiska området med användning av lämpliga antiseptiska medel, såsom alternerande klorhexidin-alkohol eller povidon-jod-alkohol scrubs.
- Placera djuret på operationsbordet på dess dorsum, i en vinkel halvvägs mellan dorsala och högra laterala VILA. Knyt armar och ben med rep i en utsträckt position. Tillhandahålla en slutlig chlorhexiäta och alkohol prep gång djuret flyttar till operationsrummet och är positionerad för kirurgi.
2. kirurgi
Obs! För ytterligare information om laparoskopi i små djur, se referens 21.
- Laparoskopisk Instrument Framställning
- Drapera djuret med en steril operationsduk med fönster.
- Med hjälp av en icke-steril assistent, linda digitalkamera med den sterila kamera duk och ansluta kabeln till tornet. Fäst den styva möjligheter att kamerahuvudet.
- Fästa den sterila ljuskabeln till den styva ramen och anslut kabeln till ljuskällan. Vitbalans kameran enligt tillverkarens anvisningar.
- Fäst den sterila insufflatorn slangen insufflatorn.
- laparoscopic Entry
- Med hjälp av en # 15 skalpell, gör en ~ 5 mm stab snitt genom huden till djupet av bukmuskulaturen, approximately 1 - 2 cm till vänster av naveln.
- Med hjälp av icke-dominanta handen, lyft upp bukväggen skall till platsen för den stab snittet. Med den dominerande handen, placera spetsen på Veress nålen genom snittet och vinkla spetsen cranially.
OBS! Penetration vinkeln på Veress nålen varierar beroende på kondition hos djuret. Till exempel i ett fett djur, kommer Veress nålen måste införas nästan vinkelrät mot bukväggen. I en tunn djur bör Veress nålen vara vinklade kranialt för att minska risken för kontakt med inälvorna.- Håller axel (inte i navet) av Veress nålen, tryck ordentligt nålen att penetrera bukväggen in i bukhålan. En distinkt "klick" och minskning av motståndet kommer att märkas som vass spets penetrerar bukhinnan och trubbig spets av Veress nål fjädrar framåt in i bukhålan.
OBS: Om nålen passerar lämpligt i the bukhålan, kommer det att finnas lite motstånd när det är avancerad och dras tillbaka 1 - 2 cm.
- Håller axel (inte i navet) av Veress nålen, tryck ordentligt nålen att penetrera bukväggen in i bukhålan. En distinkt "klick" och minskning av motståndet kommer att märkas som vass spets penetrerar bukhinnan och trubbig spets av Veress nål fjädrar framåt in i bukhålan.
- Anslut CO2 insufflator slangen till nålen och öppna kranen. Tryck buken till högst 10-12 mmHg för att skapa en pneumoperitoneum.
OBS: Buken har uppnått ideal insufflation när det har expanderat symmetriskt och det är en förlust av den normala skarp kontur kust marginaler. Trycket bör ge tillräckligt utrymme för införande av kanylen / troakaren utan risk för kontakt med inälvorna.
- kanyl Placering
- Gång buken är helt insuffleras, göra en ~ 5 - 7 mm snitt med en # 15 skalpell blad genom huden på den vänstra kraniala buken till den abdominala muskulaturen ~ till 2 - 4 cm kaudalt om sista revbenet.
- Placera en 5 mm trokar-kanylenheten genom snittet och vinkel it ~ 45 huden - 60 grader caudomedially. Penetrera bukhålan till ett djup av 1-2 cm. SCREw den gängade kanylen in i buken genom att rotera kanylen (~ 0,5 - 1 cm ytterligare) till ett djup av 1,5 - 3 cm, och ta bort trokar.
- Avlägsna insufflatorn slangen från Veress nålen stänger kranen och ta bort nålen. Anslut insufflatorn slang till kanylen och öppna kranen för att upprätthålla en pneumoperitoneum på högst 10-12 mmHg.
- Infoga den stela ramen genom kanylen och in i bukhålan.
- Under kamera visualisering, fortsätter att göra ett litet snitt med en # 15 skalpell blad genom bukmuskulaturen och bukhinnan vid föregående huden snitt används för Veress nål insättning. Kameran används för att visualisera den abdominala sidan av snittet för att undvika fartyg och minimera blödning.
Anmärkning: Se till snittet genom muskeln och bukhinnan är tillräckligt stor för att underlätta inträde av sonden och exteriorisering av tarmkäxet (~ 0,5 cm). En större snitt kan krävas för att exteriorize mesentsen hos djur med alltför mesenteriska fett. - Placera djuret i chockläge 21 med fötterna förhöjda vid ca 15 - 30 grader över huvudet. Detta är valfritt, men kan tillåta lättare tillgång till mesenteriska lymfkörtlar i tjocktarmen, som den lilla tarmkanalen kommer att flytta till en mer skall position.
- Kröslymfknutor node biopsi
- Enligt kamera visualisering, infoga en fast sond genom buksnitt görs i steg 2.3.5.
- Placera sonden mellan omentum och tarm och använda en svepande rörelse för att försiktigt svepa omentum utanför tarmen för att tillåta visualisering av den underliggande tarmkäxet. Fortsätter att använda svepande rörelse från kaudala till kraniella buken. Omentum kan placeras i den högra hjärn buken så det är ur operationsfältet.
- Använd sonden att flytta fallande kolon mot vänster eller höger bukväggen. Detta kommer att möjliggöra bättre visualisering av tHan tarmkäx för att underlätta sökandet efter mesenteriska lymfkörtlar.
- Använd sonden att sopa genom tarmkäxet att lokalisera kröslymfknutor längs kolon och mesenteriska fartyg.
OBS: Kolon noder löper längs mesenteriska gränsen i tjocktarmen, kan vänstra kolik noder finns nära förgreningspunkterna i kärlen och sämre mesenteriala noder kan hittas längs sämre mesenteriala fartyg. Kröslymfknutor är väl synlig i magra djur. När begravdes i mesenteriska fett de kommer ofta ge en något upphöjd, glittrande utseende till det överliggande tarmkäxet och kan vara mer en mer gråaktig brun färg då omgivande mesenteriska fett. Dessutom, mesenteriska lymfkörtlar tenderar att ligga utmed lymphatics och mesenteriska kärlsystemet. - Gång en lymfkörtel är identifierad, ta bort proben och sätt de Maryland tandade pincett in i bukhålan. Använd pincett för att ta tag i tarmkäxet intill målnoden. Dra tarmkäxet mot inciSion och ta bort ramen från kanylen.
- Stäng av insufflatorn och lämna kanylen kranen öppen tryckavlasta buken för att underlätta exteriorisering av tarmkäxet. Dra tarmkäx utanför kroppen genom snittet. När exterioriserades, ta tag i tarmkäxet med böjda mygga peanger eller tummen pincett för att säkerställa tillgång genom snittet.
- Identifiera lymfkörteln (er) inom det exterioriserad tarmkäxet genom att palpera för fastare lymfkörteln och / eller direkt visualisering av gråare färg eller nodulär utseende av lymfkörteln.
- En gång identifierats, göra en liten öppning (~ 3 - 5 mm) i tarmkäxet nära noden med användning av krökta hemostater. Fria bilagor till tarmkäxet hjälp dissektion med böjda peanger. Ligate kärl med 4-0 icke absorberbara monofilament sutur vid behov. Använd skarp dissektion med en skalpell att avlägsna lymfkörteln. Placera noderna i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 mediumis.
- Undersök exterioriserad tarmkäxet för blödning. Om blödningen noteras ge lämplig hemostas genom att täppa till kärlen med peanger eller ligaturer (4-0 icke absorberbara monofilament sutur), eller genom användning av diatermi. Släpp tarmkäxet och insufflera buken tillbaka till 10 - 12 mm Hg för att låta krös att återgå till bukhålan.
- Upprepa steg 2.4.1 genom 2.4.8 för att erhålla ytterligare lymfkörtel biopsier.
- leverbiopsi
- Återgå bordet till ett horisontellt läge.
- Placera en gängad kanyl i buken genom snittet som tidigare använts för lymfkörtelbiopsi samling (snitt i steg 2.3.5). Säkerställa snittet är tillräckligt stor (~ 5 - 7 mm) för att möjliggöra kanylplacering utan troakar införing. Infoga den stela ramen genom denna kanyl mot den kraniala bukhålan och visualisera kraniala buken och levern.
- Under kamera visualisering sätter biopsi forceps genom kanylen som tidigare placerats i den vänstra hjärn buken (snitt i steg 2.3.1).
- För att erhålla leverbiopsier, placera biopsi pincett under den valda levern lob marginal med den rörliga delen av käken mot levern, öppna pincett och låt marginalen att falla i de öppna käftarna. Se till att inga omentum är mellan levern och biopsi pincett. Justera positionen av tången och stänga instrumentet över den önskade provområdet.
- Upprätthålla trycket under ca 20 - 30 s för att säkerställa hemostas. Med tången stängt, ta bort provet genom att försiktigt dra pincetten upp genom kanylen. Detta kommer att försiktigt riva biopsi från levern. Placera leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
OBS: leverbiopsi storlek är ca 5 mm x 2 mm x 2 mm med användning 5 mm biopsitänger.
- Upprätthålla trycket under ca 20 - 30 s för att säkerställa hemostas. Med tången stängt, ta bort provet genom att försiktigt dra pincetten upp genom kanylen. Detta kommer att försiktigt riva biopsi från levern. Placera leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
- Undersök biopsi platsen för blödning med hjälp av kamera visualisering. Om blödning observeras, placera en saltlösning moistened steril bomullspinne genom kanylen och applicera tryck på biopsi platsen. Alternativt packa biopsiplatser med steril gel skum för att underlätta hemostas.
- Upprepa steg 2.5.3 till 2.5.5 för att få ytterligare leverbiopsier.
OBS: Här, var 3 biopsier per djur per procedur uppsamlades, vilket är tillräckligt för alla nedströms analyser.
- kirurgisk Stängning
- Undersök bukhålan för blödning.
OBS: Detta har inte skett hittills. Emellertid, om kraftig blödning noteras, bestämma platsen för blödning och tillhandahålla lämplig hemostas via tryck med sterila bomullstoppar eller användningen av gel skum. - Stäng av insufflatorn och öppna kanyl kranar. Applicera mild manuellt tryck på buken för att helt tryckavlasta bukhålan. Ta bort kanyler.
- Stänga varje av bukväggen snitt med en till två enkla avbrutna suturer per plats. 4-0 absorberbara suturer rekommenderas.
- Utföra en stänkblocket genom att placera 0,1-0,3 cc bupivakain i varje incision för lokal smärtlindring före huden stängning.
- Stäng huden med 1 - 2 begravda avbrutna suturer (4-0 absorber sutur rekommenderas) per plats. Vävnadslim kan appliceras.
- Undersök bukhålan för blödning.
3. Leverbiopsi Bearbetning och Lymphocyte Analys
- Lagra flera bitar av levervävnad (ungefär 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm i storlek) i frysförvaring rör, i en föredragen RNA-lagringslösning, och 10% formalin för framtida molekylär och histologisk analys.
- Placera de återstående leverbiopsier i 50 ml RPMI 1640-medium kompletterat med 1x penicillin / streptomycin, 40 | ig / ml av en kommersiellt tillgänglig kollagenaslösning, och 4 ^ g / ml DNAse i en steril 250 ml plastkopp med ett lock. Rör om kraftigt med användning av en magnetisk omrörarstav och en omrörningsplatta under 1 h vid 37 ° C.
- Jämnt fördela genom att hälla den digere vävnaden. Grind den digere vävnad (från steg 3.1.1) över två 70 ^ m filter passar in i två 50 ml koniska rör in i en enkelcellsuspension med användning av i slutet av en steril 5 ml spruta. Ta volymen av båda rören till 50 ml i RPMI 1640-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1x penicillin / streptomycin (R10).
- Centrifugera cellerna vid 840 xg under 6 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten. Koncentrera cellerna till en enda 50 ml koniskt rör genom att suspendera celler från båda rören i 5 ml R10 och kombinera till ett 50 ml koniskt rör. Bringa volymen till 50 ml med hjälp av R10. Räkna celler med användning av en hemocytometer för att bestämma cellulär utbyte.
- Centrifugera cellerna vid 840 xg under 6 min vid 4 ° C. Resuspendera cellerna i 1 ml R10, fördela jämnt i två 5 ml rundbottnad polystyrenrör och föra volymen av varje rör till 4 ml med R10, inriktning för> 500.000 celler i varje rör.
- Centrifugera cellerna vid 840 xg under 6 min vid 4 ° C. Dekantera de supernatant och återsuspendera cellpelleten i 4 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Centrifugera vid 840 xg under 6 min vid 4 ° C.
- Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i 100 mikroliter PBS genom vortexning försiktigt. Tillsätt 1,5 mikroliter av en fastställbara död cell fläck. Inkubera vid rumstemperatur under 5 min.
- Lägga till följande outspätt ytfärgning antikroppar i titrar som rekommenderas av tillverkaren: CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 ( klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8), och CD14-BV785 (klon M5E2). Inkubera vid 4 ° C under 20 min.
- Lägg 4 ml PBS och centrifugera vid 840 xg under 6 min vid 4 ° C. Dekantera supernatanten och återsuspendera cellerna i 250 mikroliter av en% paraformaldehyd i PBS.
Varning: Paraformaldehyd är giftigt. Bär lämplig personlig skyddsutrustning. - Analysera cellpopulationer med användning av en flödescytometer såsom beskrives i referens 22.
Representative Results
Detaljerade metoder för bearbetning av laparoskopiskt uppsamlades MLN, såväl som cellulära utbyten och leukocyt frekvenser i dessa organ har tidigare rapporterats 13. Figur 1 visar cellulär yield och lönsamhets data som jämför MLN och leverbiopsier som samlats vid två tidpunkter 160 dagars mellanrum från två friska kvinnliga RMs använder denna laparoskopisk teknik. Vi funnit att cellulärt utbyte från MLN var signifikant högre än från levern (P = 0,0021), med ett genomsnitt på 33,5 x 10 6 och 6,74 x 10 6 celler erhållna, respektive. Döda cellfärgning och analys med flödescytometri tydde på att> 90% av cellerna som isolerats från båda organen var viabla.
Med hjälp av flödescytometri, vi utvärderade och jämförde förekomsten av leukocyter och lymfocyter i MLN och levern. Ett representativt gating system för levern visas i
Figur 1. Totalt cellulärt Utbyte (överst) och cellviabilitet (botten) från Seriellt Collected MLN och leverbiopsier. Den MLN visade signifikant högre cellutbyten än vad levern. Emellertid båda provtyper förutsatt riklig celler för analyser nedströms. Cellviabiliteten, mätt genom flödes cytometrically användning av en fixerbar död cell amin fläck, visade att båda provtyper gav typiskt> 90% cellviabilitet efter vävnads dissociation. Felstaplar representerar standardavvikelse mellan proven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Representant flödescytometri Gating strategi. Först, var aggregerade celler exkluderas, följt av selektion av endast viabla celler efter färgning med användning av en fixerbar död cell aminfärgning. Därefter tillsattes CD45 + leukocyter valts, följt av selektion av CD3 + T-celler. Från CD3 + befolkningen, var CD4 + och CD8 + T-celler analyserades. Från CD3 - befolkningen, var CD14 + och CD20 + celler analyseras. Thi s gating strategi användes också för MLN. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Flödescytometri tomter från MLN och lever av Två djur i längdled. MLN och leverprover samlades 160 dagars mellanrum för båda djuren. (A). MLN CD45 + celler (leukocyter); (B) Lever CD45 + celler (leukocyter); (C) MLN + CD3 + celler (T-celler); (D) Lever CD3 + celler (T-celler). För båda djuren, MLN visade högre andelar av CD45 + och CD3 + celler jämfört med levern. Över tid, frekvensen av dessa populationer var liknande för båda djuren.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Frekvenserna av CD45 + celler (vänster) och Olika Leukocyte och lymfocytsubpopulationer (höger) Across 23 Individuella Provtagning. De MLNs visas signifikant större frekvenser av CD45 +, CD3 + och CD4 + celler, medan levern uppvisade signifikant större frekvenser av CD14 + leukocyter, vilket demonstrerar de unika funktionerna för varje organ. Felstaplar representerar standardavvikelse mellan proven. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Här visar vi en minimalinvasiv teknik för seriell insamling av MLN och leverbiopsier som hade en 100% framgång i dessa och andra djur som inte beskrivs i denna studie. Dessutom har användningen av denna teknik på samma djur över tiden inte gett upphov till några biverkningar. I själva verket har det inte funnits några komplikationer till följd av användningen av denna teknik i andra grupper av djur som var infekterade med SIV, simian / humant immunbristvirus (SHIV) eller Zika virus (opublicerade data). På samma sätt har denna operation visat sig vara framgångsrik även i djur som tidigare genomgått större bukkirurgi, och trombocytopeni djur (opublicerade data). Vi har visat att dessa prover kan samlas in genom samma två portar genom att vända kameran plats vid växling från MLN till levern undvika behovet av ytterligare snitt. Faktorer som påverkar insamlingen av MLN har tidigare rapporterats 13.
Hela proceduren tar normalt 30 - 45 minuter att slutföra och åstadkommes genom två ~ 0,5 cm snitt. I feta djur, kan det vara nödvändigt att göra en större incision (~ 1-1,5 cm) för att hämta MLN genom och kan kräva ytterligare tid att slutföra. Djur med omfattande mesenteriska fett kräver ofta betydande erfarenhet till differentiate MLN från den omgivande fett. MLN finns ofta längs mesenteriska kärl och verkar vara vanligare nära förgreningspunkterna i kärlen. En kritisk aspekt av denna teknik är att den kräver den valda MLN att ha tillräcklig rörlighet i tarmkäxet som skall exterioriserades genom buksnitt. Som ett resultat kan denna teknik inte användas för att samla MLN nära roten av tarmkäxet. På grund av förstoringen är det ibland lättare att identifiera MLN med kameran och gripa in närhet till MLN kan hjälpa till med att lokalisera och identifiera noden när den är exterioriserades.
kanske inte alltid krävas användning av chockläge för MLN samling, och om MLN kan enkelt hämtas utan användning av chockläge det kan göra leverbiopsier lättare eftersom det kommer att förhindra organen från att flytta cranially. Ibland efter placering i chockläge, är levern flyttas upp mot membranet och måste försiktigt manipuleras tillbaka till sin position före biopsi samling. Som portplacering för MLN samlingen är till vänster, är leverbiopsier typiskt tas från de vänstra laterala och vänstra mediala leverlober som de är närmare till kanylen.
Uppsamlades MLN och leverbiopsier tillhandahålls riklig cellutbyten för en mängd olika analyser nedströms och uppvisade hög viabilitet av de uppsamlade cellerna. Här cellerna färgades för flödescytometrisk analys av leukocyter och lymfocytpopulationer och viktiga skillnader mellan dessa två viktiga immun organen klargjordes. Till exempel, var MLN kraftigt anrikad för CD4 + T-celler jämfört med levern, på grund av betydelsen av den MLN som centrala punkter för insamling och spridning adaptiva immunsvar, liksom till betydelsen av CD4 + T för hantering inflammatoriska och tolerogena svar på milieu antigener härrörande från kostintag och GI-resident mikroorganismers = "xref"> 24. Emellertid var levern signifikant berikade för CD14 + leukocyter jämfört med MLN. CD14 uttrycks huvudsakligen på monocyter och makrofager och är en viktig komponent av receptorkomplexet för bakteriell lipopolysackarid (LPS) 25. I själva verket är ökade plasmakoncentrationer av lösligt CD14 associeras med mikrobiell translokation och immunaktivering i HIV och patogena SIV-infektioner 26. Sålunda, högre frekvenser av CD14 + leukocyter i levern troligen resultatet av en större bakteriella belastningen i detta organ jämfört med MLN.
Här visar vi en snabb och minimalinvasiv kirurgisk teknik för seriell insamling av MLN och leverbiopsier som endast använder två små snitt för laparoskopisk post som inte har lett till några negativa resultat. Dessa prover ger en användbar väg för att utvärdera viktiga immunologiska, virologiska och mikrobiologiska processer som tar place i MLN och levern, som är separata och unika från systemisk immunitet. På liknande sätt, leverbiopsier är kritiska för den långsiktiga utvärdering av effekterna av HIV / SIV, läkemedelsbehandlingar, och translokerade mikrober, som ofta kombineras för att inducera signifikant leverskada 16. Vidare eftersom MLN och levern är immuna organ som utsätts för GI mikroorganismer, förmågan att bedöma immunitet i dessa organ över tid ger en utmärkt plattform för att förstå den roll som microbiome spelar upprätthålla värdens immun homeostas. Sammantaget utvärdering av levern och MLN är av stor betydelse när det gäller vaccin och terapeutiska effektivitet, SIV viral reservoar clearance och allmän mucosal immunitet. Förmågan att samla dessa prover genom en minimalinvasiv metod innebär att det finns mindre risk för inflammation i samband med förfarandet än finns med för närvarande publicerade tekniker och mindre påverkan på djurens fysiologi. I fuTure, kommer vi att utvärdera möjligheterna att kombinera insamlingen av MLN och lever med insamling av mjälten genom samma två port platser för att möjliggöra provtagning av en annan viktig och tydlig del av immunsystemet som har visat sig spela en viktig roll i ett antal sjukdomsmodeller.
Disclosures
Författarna förklarar inga konkurrerande ekonomiska intressen.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH licensnummer P51OD010425.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
