Summary
Her beskriver vi en minimalt invasiv laparoskopisk teknik til seriel prøvetagning af leveren og mesenteriske lymfekirtler (MLN) i makakaber der giver mulighed for øget samplingsfrekvens, og reducerer risikoen for kirurgiske komplikationer i forhold til at udføre en laparotomi.
Abstract
De mesenteriske lymfeknuder (MLN) og leveren udsættes for mikrober og mikrobielle produkter fra den gastrointestinale (GI) kanal, hvilket gør dem immunologisk unik. Mavetarmkanalen og tilhørende MLN er steder for tidlig viral replikation i human immundefekt virus (HIV) infektion og MLN er sandsynligvis vigtige reservoir sites, der huser latent inficerede celler selv efter langvarig antiretroviral terapi (ART). Leveren har vist sig at spille en væsentlig rolle i immunreaktioner til lentivira og synes at spille en væsentlig rolle i clearance af virus fra cirkulation. Human primat (NHP) modeller for HIV og erhvervet immundefekt syndrom (AIDS) nøje efterligner disse aspekter af HIV-infektion og seriel langsgående prøvetagning af primære steder for viral replikation og de tilhørende immunreaktioner i denne model vil bidrage til at belyse kritiske hændelser i infektion og patogenese , og virkningen af forskellige interventionsstrategier på disse begivenheder. Current offentliggjort teknikker til at prøve leveren og MLN sammen involverer større operation og / eller obduktion, hvilket begrænser muligheden for at undersøge disse vigtige steder i en seriel måde i det samme dyr. Vi har tidligere beskrevet en laparoskopisk teknik til opsamling af MLN. Her beskriver vi en minimalt invasiv laparoskopisk teknik til seriel langsgående prøveudtagning af leveren og MLN gennem de samme to port steder er nødvendige for samling af MLN. Anvendelsen af de samme to porte minimerer virkningerne til dyrene som ingen yderligere indsnit er nødvendige. Denne teknik kan anvendes med øget samplingsfrekvens sammenlignet med større abdominal kirurgi og reducerer risikoen for kirurgiske komplikationer og tilhørende lokale og systemiske inflammatoriske reaktioner, der kunne komplicere fortolkningen af resultaterne. Denne fremgangsmåde har potentiale til at lette undersøgelser af NHP-modeller og samtidig forbedre dyrevelfærden.
Introduction
Mave (GI) kanal er kroppens største slimhindeoverflade og udsættes for et utal af antigener afledt af fødevarer, patogener, og endosymbiotiske bakterielle samfund almindeligvis benævnt microbiome 1, 2. Mesenteriske lymfekirtler (MLN) linje mavetarmkanalen og er en hovedsted af immunfunktion til fremme inflammatoriske eller tolerogeniske reaktioner over for disse forskellige antigener. Den fysiske organisation MLN skaber et rumopdelt system, der kan reagere på antigener lokalt uden at fremkalde systemiske reaktioner 3. Tilsvarende blod fra GI tract afløb til leveren via portåren de før returnering til cirkulation, og er således udsat for mikrober og mikrobielle produkter, der har translokerede fra mavetarmkanalen ind i lamina propria og opført i blodbanen 4. Leveren fungerer også som en sekundær lymfoid organ ennd har et stort antal af immunceller, herunder specialiserede makrofager, til fjernelse translokerede mikrober 5, 6. Således MLN og leveren er de primære immune organer udsat for kommensale og patogene bakterier fra GI-kanalen samt det miljø af antigener fra andre kilder, hvilket gør dem enestående og vigtig ud fra et immunologisk synspunkt.
Den MLN er kritiske steder for evaluering af de virologiske og immunologiske effekter af human immundefekt virus (HIV) eller patogene abeimmundefektvirus (SIV) infektion, og er sandsynligvis involveret i den tidlige udbredelse af SIV efter intrarektal udfordring. Tarm-associeret lymfoidt væv er kendt for at være en væsentlig site af vedvarende HIV-replikation, trods effektiv kontrol af viræmi ved moderne antiretrovirale behandlinger (ART) 7. I SIV infektionsmodeller har MLN vist sig at være vigtige reservoirer af latent virus og kanvære det primære reservoir 8, 9. Leveren er også vigtigt i lentiviral infektion som vist ved akkumulering af SIV specifikke CD8 + T-celler i lever fra makakaber under akut SIV-infektion 10. Det er endvidere den væsentligste organ til rensning af virus fra cirkulation 11.
HIV og SIV-infektion er forbundet med ændret GI mikrobiota, forstyrret GI epithelial integritet og øget translokation af mikrober og mikrobielle produkter fra tyktarmen i periferien og cirkulation 12, 13. Disse processer er forbundet med lokal og systemisk immunaktivering og forøget morbiditet og mortalitet hos HIV-inficerede individer 14. I SIV-infektion, har translokerede bakterier observeret i MLN 15, mens akkumulering af microbial produkter i leveren har vist sig at resultere i betændelse og skade på organet 16. Således i forbindelse med HIV og SIV-infektioner, kan MLN og leveren være meget informative for at forstå de inflammatoriske processer drives af GI-hjemmehørende bakterier.
Her præsenteres en minimalt invasiv laparoskopisk teknik til seriel prøvetagning af MLN og lever i ikke-humane primater (NHP'er). Vi demonstrerer vellykket udførelse af denne teknik på to raske kvindelige makakaber (RMS), prøveudtagning hvert dyr to gange, med 160 dage i mellem hver operation. Vi går på at bruge disse prøver til at vurdere og sammenligne nøgleleukocyttersubtyper og lymfocytpopulationer indenfor hvert organ anvendelse af flowcytometri, og demonstrere meget konsistente data mellem de to tidspunkter.
Protocol
Dyrene blev opstaldet og plejes i Foreningen for vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care internationale (AAALACi) akkrediterede faciliteter, og alle procedurer dyr blev udført i overensstemmelse med protokoller, der er godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af University of Washington og Washington National Primate Research Centre.
1. Kirurgisk Fremstilling, Anæstesi og Analgesi
- Sedation og induktion
- Adstadig makak med en intramuskulær injektion af 10 mg / kg ketamin og 0,015 mg / kg dexmedetomidin (samles i én sprøjte). Sikre fravær af tilbagetrækning reflekser forud for fjernelse fra buret.
- Intubere dyret og vedligeholde dyret i et plan af generel anæstesi under anvendelse af isofluran (1,0 - 2,5%) og 100% oxygen. Se referencer for yderligere oplysninger om intubation og generel anæstesi i makakaber 17,ref "> 18, 19.
- Anæstesi Support og Overvågning
- Indsætte et perifert venekateter og give intravenøse isotoniske væsker (såsom lacteret Ringers opløsning) ved en hastighed på 5 ml / kg / time i hele anæstesi og kirurgi. Anvende steril øje smøremiddel for at forhindre corneal tørhed.
- Analgesi, såsom en formulering med vedvarende frigivelse af buprenorphin (0,2 mg / kg, subkutant).
BEMÆRK: Et NSAID (såsom meloxicam eller ketoprofen) kan også være tilvejebragt under bedøvelsesmiddel genvinding, forudsat at den eksperimentelle protokol tillader NSAID administration, og at dyret er normotensive og godt hydreret under bedøvelse. - Overvåg anæstetisk dybde (f.eks kæbe tone), puls, respiration rate, EKG, blodtryk, puls iltning, ende tidevandsenergi CO 2, og legemstemperatur hele anæstesi og kirurgi.
BEMÆRK: Når maven er indblæses, kan dyret hypoventilate.Tilvejebringe mekanisk ventilation hvis respirationshastigheden falder, eller de endelige tidevandsenergi CO 2 niveauer er over 45 mmHg. - Efter kirurgi administrere atipamezol (0,15 mg / kg, intramuskulært) for dexmedetomidin vending.
- kirurgisk Fremstilling
- Udfør flere varme vand lavement at nedbringe mængden af afføring i tyktarmen for at hjælpe visualisering og intestinal manipulation under proceduren 20.
- Brug neglesaks med en nummer 40 klinge til at fjerne hår fra kirurgiske område. Barber fra kystby højderyg til pubis og fra venstre mod højre flanke.
- Aseptisk fremstilling af den kirurgiske område ved anvendelse af passende antiseptiske midler, såsom skiftevis chlorhexidin-alkohol- eller povidon-iod-alkohol krat.
- Placer dyret på operationsbordet på dorsum, i en vinkel halvvejs mellem dorsale og højre sideleje. Bind arme og ben med reb i en udstrakt position. Giv en endelig chlorhexispise og alkohol prep når dyret bevæger sig til operationsstuen og er placeret til kirurgi.
2. Kirurgi
Bemærk: For yderligere information om laparoskopi i små dyr, se referere 21.
- Laparoskopisk Instrument Fremstilling
- Drapere dyr med en steril fenestreret afdækningsstykke.
- Med hjælp fra en ikke-steril assistent, wrap det digitale kamera med den sterile kamera drapere og fastgør kablet til tårnet. Fastgør den stive rammer til kameraet hovedet.
- Fastgør sterile lys kablet til den stive anvendelsesområde og tilslutte kablet til lyskilden. Hvidbalance kameraet i overensstemmelse med producentens anvisninger.
- Vedhæfte den sterile insufflatoren slangen til insufflatoren.
- laparoskopisk indtastning
- Ved hjælp af en # 15 skalpel, lave en ~ 5 mm stikincision gennem huden til dybden af den abdominale muskulatur, approximately 1 - 2 cm til venstre for navlen.
- Brug af ikke-dominerende hånd, løft bugvæggen kranie til stedet for den stikincision. Med den dominerende hånd, placere spidsen af Veress nålen gennem snittet og vinkel spidsen kranialt.
BEMÆRK: penetration vinkel Veress nålen vil variere baseret på kroppen tilstand af dyret. For eksempel i en fed dyr, vil Veress nålen skal indsættes næsten vinkelret på bugvæggen. I en tynd dyr bør Veress nålen være vinklet kranialt at reducere risikoen for at bringe indvoldene.- Holder aksel (ikke navet) af Veress nål, skub nålen at trænge bugvæggen i bughulen. En distinkt "klik" og fald i resistens vil kunne mærkes som den skarpe spids trænger bughinden og den stumpe spids af Veress nålefjedre fremad ind i bughulen.
BEMÆRK: Hvis nålen passerer hensigtsmæssigt i the bughulen, vil der være ringe modstand, når det fremføres og trækkes 1 - 2 cm.
- Holder aksel (ikke navet) af Veress nål, skub nålen at trænge bugvæggen i bughulen. En distinkt "klik" og fald i resistens vil kunne mærkes som den skarpe spids trænger bughinden og den stumpe spids af Veress nålefjedre fremad ind i bughulen.
- Tilslut CO 2 insufflatoren slange til nålen og åbne stophane. Under tryk maven til ikke mere end 10-12 mmHg for at skabe en pneumoperitoneum.
BEMÆRK: Underlivet har opnået ideel indblæsning, når det har udvidet symmetrisk, og der er et tab af den normale skarpe kontur af de kystnære marginer. Trykket bør give tilstrækkelig plads til indføring af kanylen / trokaren uden risiko for kontakt mellem indvoldene.
- kanyle Placering
- Når maven er fuldt insuffleres, lave en -5 - 7 mm indsnit med en # 15 skalpel klinge gennem huden af den venstre kraniale abdomen til den abdominale muskulatur ~ 2 - 4 cm kaudalt for ribben.
- Placer en 5 mm trokar-kanyleenheden gennem huden indsnit og vinkel it ~ 45 - 60 grader caudomedially. Trænge ind i bughulen til en dybde på 1-2 cm. SCREw gevind kanyle i maven ved at dreje kanylen (~ 0,5 - 1 cm yderligere) til en dybde på 1,5 - 3 cm, og fjern trokar.
- Fjern insufflatoren slangen fra Veress nål, slukke stophane, og fjern nålen. Forbinde insufflatoren slangen til kanylen og åbne stophanen at opretholde en pneumoperitonæum ved ikke mere end 10 - 12 mmHg.
- Sæt den stive anvendelsesområde gennem kanylen og ind i bughulen.
- Under kamera visualisering, fortsætte med at lave et lille snit med en # 15 skalpel klinge gennem den abdominale muskulatur og bughinden på det foregående hud indsnit bruges til Veress nål indsættelse. Kameraet bruges til at visualisere den abdominale side af snittet for at undgå fartøjer og minimere blødning.
BEMÆRK: Sørg snittet gennem musklen og bughinden er stor nok til at lette indføring af sonden og eksteriorisering af mesenteriet (~ 0,5 cm). En større indsnit kan være nødvendigt at blotlægge mesentery i dyr med overdreven mesenterisk fedt. - Dyret i Trendelenburg-position 21 med fødderne hævet med ca. 15 - 30 grader over hovedet. Dette er valgfrit, men kan tillade lettere adgang til mesenteriallymfeknuder i colon, som den lille tarmkanalen vil flytte til en mere kraniel position.
- Mesenterisk lymfeknudebiopsi
- Under kamera visualisering, indsætte en solid sonde gennem den abdominale indsnit i trin 2.3.5.
- Placer sonden mellem omentum og tarm og bruge en fejende bevægelse til forsigtigt feje omentum off tarmen for at tillade visualisering af det underliggende mesenterium. Fortsat brug den fejende bevægelse fra den caudale til craniale maven. Omentum kan placeres i den rigtige kraniale maven, så det er ude af operationsfeltet.
- Brug sonden til at flytte nedadgående tyktarm mod venstre eller højre bugvæggen. Dette vil give en bedre visualisering af than mesenterium at hjælpe i eftersøgningen af mesenteriske lymfeknuder.
- Brug sonden til at feje gennem mesenterium at lokalisere mesenteriallymfeknuder langs kolon og mesenteriallymfeknuderne fartøjer.
BEMÆRK: Colon knuder løber langs mesenteriske grænse i tyktarmen, kan venstre kolik knuder findes nær branche punkter i karrene, og de ringere mesenteriske noder kan findes langs de ringere mesenteriske fartøjer. Mesenteriallymfeknuder er let synlige i magre dyr. Når begravet i mesenteriske fedt vil de ofte give en let hævet, glinsende udseende til den overliggende mesenterium og kan være mere en mere grålig gulbrun farve derefter omgivende mesenteriske fedt. Derudover mesenteriske lymfekirtler tendens til at ligge langs lymfekar og mesenteriske vaskulatur. - Når en lymfeknude er identificeret, fjernes sonden og indsætte Maryland skraldetænder pincet i bughulen. Brug pincet til at gribe mesenterium tilgrænsende målet node. Træk mesenterium mod incisionen, og fjern rækkevidden fra kanylen.
- Sluk insufflatoren og lad kanylen stophane åben for trykket maven for at lette eksteriorisering af mesenteriet. Træk mesenterium uden for kroppen gennem snittet. Når eksterioriseret, tage fat i mesenterium med buede myg hemostats eller tommelfinger pincet til at sikre adgang gennem snittet.
- Identificere lymfeknuderne (r) inden for eksterioriseret mesenterium ved palpating for fastere lymfeknude og / eller direkte visualisering af mere grå farve eller nodulær udseende lymfeknuden.
- Når identificeret, lave en lille åbning (~ 3 - 5 mm) i mesenteriet nær node ved hjælp krumme hemostats. Gratis vedhæftede filer til mesenterium ved stump dissektion med de buede hemostats. Ligere vaskulaturen med 4-0 ikke-absorberbar monofilament sutur efter behov. Brug skarp dissektion med en skalpel til at fjerne lymfeknude. Placer knuder i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium påis.
- Undersøg eksterioriseret mesenterium for blødning. Hvis blødningen bemærkes, yde passende hæmostase ved at okkludere de fartøjer med hemostats eller ligaturer (4-0 ikke-absorberbar monofilament suturer), eller ved anvendelse af cautery. Slip mesenterium og insufflat maven tilbage til 10 - 12 mmHg for at tillade mesenteriet at vende tilbage til bughulen.
- Gentage trin 2.4.1 gennem 2.4.8 at opnå yderligere lymfeknudebiopsier.
- leverbiopsi
- Retur bordet til en vandret position.
- Placer en gevindskåret kanyle i maven gennem snittet tidligere blev brugt til lymfeknudebiopsi samling (snit i trin 2.3.5). Sikre snittet er stor nok (-5 - 7 mm) for at tillade kanylen anbringelse uden trokar indsættelse. Sæt den stive anvendelsesområde gennem denne kanyle mod den kraniale bughulen og visualisere den kraniale maven og leveren.
- Under kamera visualisering, indsætte biopsi forceps gennem kanylen tidligere placeret i venstre kraniale maven (snit i trin 2.3.1).
- At opnå leverbiopsier, placere biopsitang beneath valgte leverlap margin med den bevægelige del af kæben vender leveren, åbne pincet og lade margen at falde i de åbne kæberne. Sikre, at ingen omentum er mellem leveren og biopsitang. Justere placeringen af pincet og lukke instrumentet over det ønskede prøve region.
- Opretholde presset i ca. 20 - 30 s for at sikre hæmostase. Med tangen lukket, fjernes prøven ved forsigtigt at trække tangen op gennem kanylen. Dette vil forsigtigt rive biopsi fra leveren. Placere leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
BEMÆRK: leverbiopsi størrelse er ca. 5 mm x 2 mm x 2 mm ved anvendelse af 5 mm biopsi tang.
- Opretholde presset i ca. 20 - 30 s for at sikre hæmostase. Med tangen lukket, fjernes prøven ved forsigtigt at trække tangen op gennem kanylen. Dette vil forsigtigt rive biopsi fra leveren. Placere leverbiopsier i RPMI 1640 medium på is.
- Undersøg biopsi site for blødning ved hjælp kamera visualisering. Hvis der observeres blødning, placere en saltvand moistened steril vatpind gennem kanylen og pres biopsistedet. Alternativt pakke biopsi sites med steril gel skum til støtte hæmostase.
- Gentage trin 2.5.3 gennem 2.5.5 at opnå yderligere leverbiopsier.
BEMÆRK: Her blev 3 biopsier per dyr per procedure opsamlet, hvilket er tilstrækkeligt til alle efterfølgende analyser.
- Kirurgisk Lukning
- Undersøge bughulen for blødning.
BEMÆRK: Dette er ikke sket til dato. Men hvis voldsom blødning bemærkes, fastlægge stedet for blødning og yde passende hæmostase via tryk med sterile vatpinde eller anvendelse af gel skum. - Sluk insufflatoren og åbne kanylen stophaner. Forsigtigt manuelt tryk til maven til fuldt ud at trykket bughulen. Fjern kanyler.
- Luk hver af bugvæggen indsnit med 1 til 2 simple afbrudte suturer per site. 4-0 absorberbar sutur anbefales.
- Udføre en splash blok ved at anbringe 0,1-0,3 cc bupivacain i hvert indsnit til lokal analgesi før hudlukning.
- Luk huden med 1 - 2 nedgravede afbrudte suturer (anbefales 4-0 absorberbar sutur) per site. Vævslim kan påføres.
- Undersøge bughulen for blødning.
3. Lever biopsi Forarbejdning og lymfocyt Analyse
- Gemme flere stykker levervæv (ca. 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm i størrelse) i kryokonservering rør, i en foretrukken RNA opbevaring opløsning og 10% formalin til fremtidig molekylær og histologiske analyser.
- Placer de resterende leverbiopsier i 50 ml RPMI 1640 medium suppleret med 1 x penicillin / streptomycin, 40 ug / ml af en kommercielt tilgængelig collagenaseopløsning, og 4 ug / ml DNAse i en steril 250 ml plastbæger med låg. Der omrøres kraftigt under anvendelse af en magnetisk omrører og en omrøringsplade i 1 time ved 37 ° C.
- Fordeler ved at hælde det fordøjede væv. grIND det fordøjede væv (fra trin 3.1.1) over to 70 um filtre passer i to 50 ml koniske rør i en enkelt cellesuspension ved hjælp af spidsen af en steril 5 ml sprøjte. Bringe volumenet af begge rør til 50 ml i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovinserum og 1 x penicillin / streptomycin (R10).
- Centrifuger cellerne ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C. Dekanter supernatanten. Koncentrer cellerne i et enkelt 50 ml konisk rør ved at suspendere celler fra begge rør i 5 ml R10 og kombinere i et 50 ml konisk rør. Der fortyndes til 50 ml under anvendelse af R10. Tæl celler under anvendelse af et hæmocytometer at bestemme cellulær udbytte.
- Centrifuger cellerne ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C. Resuspendere cellerne i 1 ml R10, fordele sig jævnt i to 5 ml rundbundet polystyrenrør og bringe volumenet af hvert rør til 4 ml med R10, målretning for> 500.000 celler i hvert rør.
- Centrifuger cellerne ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C. Dekanteres supernatant og resuspender cellepelleten i 4 ml phosphatbufret saltvand (PBS). Centrifuger ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C.
- Supernatanten dekanteres, og cellerne resuspenderes i 100 pi PBS ved vortex forsigtigt. Tilføj 1,5 uL af en fixable død celle pletten. Inkubere ved stuetemperatur i 5 minutter.
- Tilføje følgende ufortyndet overfladefarvning antistoffer i titere anbefalet af producenten: CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 ( klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8), og CD14-BV785 (klon M5E2). Inkuber ved 4 ° C i 20 minutter.
- Tilsæt 4 ml PBS og centrifuger ved 840 xg i 6 min ved 4 ° C. Supernatanten dekanteres, og cellerne resuspenderes i 250 pi af 1% paraformaldehyd i PBS.
Forsigtig: Paraformaldehyd er toksisk. Bær egnede personlige værnemidler. - Analyser cellepopulationerne bruger flowcytometer som beskrevet i reference 22.
Representative Results
Detaljerede metoder til behandling af laparoskopisk indsamlet MLN samt cellulære udbytter og leukocyt frekvenser i disse organer er tidligere blevet beskrevet 13. Figur 1 viser cellulær udbytte og levedygtighed data, der sammenligner den MLN og leverbiopsier indsamlet på to tidspunkter 160 dage bortset fra to raske kvindelige RM'er anvender denne laparoskopisk teknik. Vi fandt, at cellulær udbytte fra MLN var signifikant højere end fra leveren (P = 0,0021), med et gennemsnit på 33,5 x 10 6 og 6,74 x 10 6 celler opnået henholdsvis. Dead cellefarvning og analyse ved hjælp af flowcytometri viste, at> 90% af cellerne isoleret fra begge organer var levedygtige.
Under anvendelse af flowcytometri, vi vurderet og sammenlignet overflod af leukocytter og lymfocytter i MLN og leveren. Et repræsentativt gating ordning for leveren er vist i
Figur 1. Samlet Cellular Udbytte (øverst) og cellelevedygtighed (nederst) fra Serielt Samlede MLN og leverbiopsierne. MLN viste signifikant højere celleudbytter end gjorde leveren. Men begge prøvetyper billede rigelig celler for downstream analyser. Cellelevedygtighed, målt ved flow cytometrically anvendelse af en fixable døde celle amin pletten, viste, at begge prøvetyper gav typisk> 90% cellelevedygtighed efter væv dissociation. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen mellem prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Repræsentative flowcytometri gating strategien. Først blev aggregerede celler udelukket, efterfulgt af selektion af kun levedygtige celler efter farvning ved anvendelse af en fixable døde celle amin pletten. Dernæst blev CD45 + leukocytter valgt, efterfulgt af selektion af CD3 + T-celler. Fra CD3 + population, blev analyseret CD4 + og CD8 + T-celler. Fra CD3 - befolkning, blev CD14 + og CD20 + celler analyseret. Thi s gating strategi blev også brugt til MLN. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3. Flowcytometri Plots fra MLN og Lever af to dyr langs. MLN og leverprøver blev opsamlet 160 dage fra hinanden for begge dyr. (A). MLN CD45 + celler (leukocytter); (B) Lever CD45 + celler (leukocytter); (C) MLN + CD3 + celler (T-celler); (D) Lever CD3 + celler (T-celler). Både for dyr, viste MLN højere andele af CD45 + og CD3 + celler sammenlignet med leveren. På tværs af tid, hyppigheden af disse populationer var ens for begge dyr.s / ftp_upload / 55.617 / 55617fig3large.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4. Frekvensen af CD45 + celler (venstre) og forskellige leukocyt og lymfocytsubpopulationer (højre) Across 23 Individuelle prøvetagninger. De MLNs viste signifikant større frekvenser af CD45 +, CD3 + og CD4 + -celler, mens leveren viste signifikant større frekvenser af CD14 + leukocytter, hvilket viser de unikke funktioner af hvert organ. Fejlsøjlerne repræsenterer standardafvigelsen mellem prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.
Discussion
Her demonstrerer vi en minimalt invasiv teknik til seriel samling af MLN og leverbiopsier, der havde en 100% succesrate i disse og andre dyr ikke er beskrevet i denne undersøgelse. Endvidere har brugen af denne teknik på de samme dyr på tværs af tid ikke været forbundet med nogen bivirkninger. Faktisk har der ikke været nogen komplikationer som følge af brug af denne teknik i andre grupper af dyr, der blev inficeret med SIV, simian / human immundefekt virus (SHIV), eller Zika virus (upublicerede data). På samme måde har denne operation vist sig gode, selv i dyr, der tidligere havde gennemgået større abdominal kirurgi, og i trombocytopeni dyr (upublicerede data). Vi vist, at disse prøver kan opsamles gennem de samme to porte ved at vende kameraets placering, når der skiftes fra MLN til leveren undgå behovet for yderligere indsnit. Faktorer, der påvirker indsamlingen af MLN har tidligere været rapporteret 13.
Hele proceduren tager typisk 30 - 45 min at udfylde og opnås gennem to ~ 0,5 cm indsnit. Hos overvægtige dyr, kan det være nødvendigt at foretage en større indsnit (-1 - 1,5 cm) til at hente MLN gennem og kan kræve yderligere tid at gennemføre. Dyr med omfattende mesenteriske fedt kræver ofte betydelig erfaring til differentiate MLN fra det omgivende fedt. MLN findes ofte langs mesenteriske kar og synes at være mere udbredt nær filial punkter i karrene. Et kritisk aspekt ved denne teknik er, at det kræver den valgte MLN at have tilstrækkelig mobilitet i mesenteriet at blive blotlagt gennem den abdominale incision. Som et resultat kan denne teknik ikke anvendes til at indsamle MLN tæt på roden af mesenteriet. På grund af forstørrelse, det er til tider lettere at identificere MLN med kameraet, og gribe i nærheden af MLN kan hjælpe med at finde og identificere knuden, når den er eksterioriseret.
Anvendelse af Trendelenburg stillingen kan ikke altid være behov for MLN kollektion, og hvis MLN kan nemt hentes uden brug af Trendelenburg position det kan gøre leverbiopsier nemmere, da det vil forhindre, at organer fra skiftende kraniet. Til tider efter anbringelse i Trendelenburg position, er leveren forskydes op imod membranen og most forsigtigt manipuleres tilbage i stilling før biopsi samling. Som port placering for MLN samling er til venstre, er leverbiopsier typisk taget fra den venstre laterale og venstre mediale lever lapper som de er tættere på kanylen.
Opsamlet MLN og leverbiopsier billede rigelig celleudbytter for en række downstream analyser og viste høj levedygtighed af de indsamlede celler. Her blev cellerne farvet for flowcytometrisk analyse af leukocyt- og lymfocytpopulationer, og de vigtigste forskelle mellem disse to vigtige immune organer blev belyst. For eksempel blev den MLN højt beriget for CD4 + -T-celler sammenlignet med leveren på grund af betydningen af MLN som centrale punkter for indsamling og formidling adaptive immunresponser samt til betydningen af CD4 + T til styring inflammatoriske og tolerogeniske reaktioner på det miljø antigener afledt af kostindtag og GI-hjemmehørende mikroorganismers = "xref"> 24. Imidlertid blev leveren signifikant beriget med CD14 + leukocytter forhold til MLN. CD14 udtrykkes overvejende på monocytter og makrofager og er et nøgleelement i receptorkomplekset for bakterielt lipopolysaccharid (LPS) 25. Faktisk er forhøjede plasmakoncentrationer af opløseligt CD14 i forbindelse med mikrobiel translokation og immunaktivering i HIV og patogene SIV infektioner 26. Således højere frekvenser af CD14 + leukocytter i leveren sandsynligvis resultere fra en større bakteriebyrden i dette organ sammenlignet med MLN.
Her demonstrerer vi en hurtig og minimalt invasiv kirurgisk teknik til seriel samling af MLN og leverbiopsier kun bruger to små snit til laparoskopisk post, der ikke har ført til nogen negative resultater. Disse prøver et nyttigt vej til vurdere centrale immunologiske, virologiske og mikrobiologiske processer, der finder place i MLN og leveren, som er adskilt og unikt fra systemisk immunitet. Tilsvarende leverbiopsier er kritiske for den langsigtede evaluering af virkningerne af HIV / SIV, lægemiddelbehandlinger, og translokerede mikrober, der ofte tilsammen inducere signifikant leverskade 16. Da endvidere MLN og leveren er immune organer udsat for GI mikrobiota, evnen til at vurdere immunitet i disse organer på tværs af tid giver en fremragende platform for at forstå den rolle, som microbiome spiller i opretholdelsen vært immun homøostase. Tilsammen evaluering af leveren og MLN er af stor betydning i forbindelse med vaccine og terapeutiske effektiviteter, SIV viral reservoir clearance og generel slimhindeimmunitet. Evnen til at indsamle disse prøver gennem en minimalt invasiv fremgangsmåde betyder, at der er mindre risiko for inflammation relateret til proceduren end eksisterer med for tiden offentliggjorte teknikker og mindre indvirkning på dyrenes fysiologi. I fuTure, vil vi evaluere potentialet til at kombinere indsamling af MLN og lever med indsamlingen af milten gennem de samme to port steder at give mulighed for prøvetagning af en anden vigtig og særskilt del af immunsystemet, der har vist sig at spille en væsentlig rolle i en række sygdomsmodeller.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen konkurrerende økonomiske interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af NIH tilskud nummer P51OD010425.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al. Adaptive immunity in the liver. Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
