Summary
Ici, nous décrivons une technique laparoscopique minimalement invasive pour l'échantillonnage de série de ganglions lymphatiques mésentériques et le foie (MLN) chez des macaques qui permet une fréquence d'échantillonnage accrue, et réduit le risque de complications chirurgicales par rapport à la réalisation d'une laparotomie.
Abstract
Les ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) et le foie sont exposés à des micro-organismes et les produits microbiens à partir du tractus gastro-intestinal (GI), ce qui les rend immunologiquement unique. Le tractus gastro-intestinal et MLN associés sont des sites de réplication virale précoce dans l'infection par le virus de l'immunodéficience humaine (VIH) et le MLN sont des sites importants réservoirs probables qui abritent les cellules infectées par le même état latent après un traitement antirétroviral prolongé (ART). Le foie a été montré à jouer un rôle important dans les réponses immunitaires à lentivirus et semble jouer un rôle important dans l'élimination du virus de la circulation. modèles primates non humains (PSN) pour le VIH et syndrome d'immunodéficience acquise (SIDA) mimer étroitement ces aspects de l'infection par le VIH et l'échantillonnage longitudinale série des sites principaux de la réplication virale et les réponses immunitaires associées à ce modèle contribuera à élucider les événements critiques dans l'infection, la pathogenèse et l'impact des différentes stratégies d'intervention sur ces événements. currtechniques publiées ent à l'échantillon du foie et MLN ensemble impliquent une intervention chirurgicale majeure et / ou d'une nécropsie, ce qui limite la capacité d'enquêter sur ces sites importants d'une façon série dans le même animal. Nous avons déjà décrit une technique laparoscopique pour la collecte de MLN. Nous décrivons ici une technique laparoscopique mini-invasive pour l'échantillonnage longitudinale série du foie et MLN par les mêmes deux sites portuaires nécessaires à la collecte de MLN. L'utilisation des deux mêmes ports minimise l'impact sur les animaux sans incisions supplémentaires sont nécessaires. Cette technique peut être utilisée avec une fréquence d'échantillonnage accrue par rapport à une chirurgie abdominale majeure et réduit le risque de complications chirurgicales et les réponses inflammatoires associées locales et systémiques qui pourraient compliquer l'interprétation des résultats. Cette procédure a le potentiel pour faciliter les études portant sur des modèles de santé naturels tout en améliorant le bien-être des animaux.
Introduction
Le tractus gastro - intestinal (GI) est la plus grande surface de la muqueuse du corps et est exposée à une multitude d'antigènes dérivés de la nourriture, des agents pathogènes, et les communautés bactériennes endosymbiotiques communément appelé le microbiome 1, 2. ganglions lymphatiques mésentériques (MLN) bordent le tractus gastro-intestinal et sont un site principal de la fonction immunitaire pour la promotion de réponses inflammatoires ou tolérogènes vers ces antigènes différents. L'organisation physique du MLN crée un système compartimenté qui peut répondre aux antigènes localement sans induire des réponses systémiques 3. De même, le sang des drains du tractus gastro - intestinal au foie par la veine porte avant de revenir à la circulation, et est donc exposée aux microbes et les produits microbiens qui ont relocalisés du tractus gastro-intestinal dans la lamina propria et pénétré dans le sang 4. Le foie fonctionne également en tant que un des organes lymphoïdes secondairesnd dispose d' un grand nombre de cellules immunitaires, y compris les macrophages spécialisés, pour éliminer les microbes relocalisés 5, 6. Ainsi, le MLN et le foie sont les organes immunitaires primaires exposés à des bactéries commensales et pathogènes du tractus gastro-intestinal, ainsi que le milieu des antigènes provenant d'autres sources, ce qui les rend unique et important du point de vue immunologique.
Le MLN sont des sites critiques pour l'évaluation des effets virologiques et immunologiques du virus de l'immunodéficience humaine (VIH) ou pathogènes infection par le virus de l'immunodéficience simienne (SIV) et sont probablement impliqués dans la diffusion précoce des SIV après la provocation intrarectale. Tissu lymphoïde associé Gut-est connu pour être un site majeur de la réplication persistante du VIH, malgré un contrôle efficace de la virémie par les traitements antirétroviraux modernes (ART) 7. Dans les modèles d'infection SIV, MLN ont été révélés d'importants réservoirs de virus latent et peutle réservoir principal 8, 9. Le foie est également important dans l' infection lentivirus comme en témoigne l'accumulation de cellules SIV T CD8 + spécifiques dans les foies de macaques lors d'une infection aiguë SIV 10. En outre, il est le principal organe chargé de la compensation du virus de la circulation 11.
VIH et l' infection SIV sont associés à la microflore gastro - intestinale altérée, GI perturbé l' intégrité de l' épithélium, et une augmentation de la translocation des microbes et des produits microbiens du côlon dans la périphérie et de la circulation 12, 13. Ces processus sont associés à l' activation immunitaire locale et systémique, et augmentation de la morbidité et de la mortalité chez les personnes infectées par le VIH 14. En cas d' infection SIV, les bactéries ont été observées relocalisés dans le MLN 15, alors que l' accumulation de microRobial produits dans le foie a été montré pour provoquer une inflammation et des lésions de l'organe 16. Ainsi, dans le contexte du VIH et des infections SIV, le MLN et le foie peut être très instructif pour comprendre les processus inflammatoires entraînés par les bactéries GI-résident.
Nous présentons ici une technique laparoscopique mini-invasive pour l'échantillonnage série du MLN et du foie chez les primates non humains (PNH). Nous démontrons la performance réussie de cette technique sur deux macaques rhésus femelles en bonne santé (rms), l'échantillonnage de chaque animal deux fois, avec 160 jours entre chaque opération. Nous continuons d'utiliser ces échantillons pour évaluer et comparer les populations leucocytaires et de lymphocytes clés au sein de chaque organe par cytométrie de flux, et de démontrer des données très cohérentes entre les deux points de temps.
Protocol
Les animaux ont été logés et soignés dans l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des laboratoires de protection des animaux établissements agréés international (AAALACi), et toutes les procédures d'animaux ont été effectuées selon des protocoles approuvés par le Comité de protection des animaux institutionnels et utilisation (IACUC) de l'Université de Washington et Washington national Primate Research Center.
1. Préparation chirurgicale, anesthésie et analgésie
- Sédation et induction
- Sedate le macaque avec une injection intramusculaire de 10 mg / kg de kétamine et de 0,015 mg / kg de dexmédétomidine (combinés dans une seringue). Assurer l'absence de réflexes de retrait avant le retrait de la cage.
- Intuber l'animal, et de maintenir l'animal dans un plan de l'anesthésie générale en utilisant de l'isoflurane (1,0 à 2,5%) et 100% d'oxygène. Voir les références pour de plus amples informations concernant l' intubation et l' anesthésie générale chez les macaques 17,ref "> 18, 19.
- Soutien et suivi d'anesthésie
- Insérer un cathéter veineux périphérique et fournir des fluides isotoniques par voie intraveineuse (comme solution de Ringer Lactate) à raison de 5 ml / kg / h pendant l'anesthésie et la chirurgie. Appliquer du lubrifiant oculaire stérile pour prévenir la sécheresse de la cornée.
- Fournir une analgésie, par exemple une formulation à libération prolongée de la buprénorphine (0,2 mg / kg, voie sous-cutanée).
REMARQUE: un AINS (tels que le méloxicam ou kétoprofène) peut également être prévu lors de la récupération anesthésique, à condition que le protocole expérimental permet l'administration d'AINS et que l'animal est normotendus et bien hydraté pendant l'anesthésie. - Surveiller la profondeur d' anesthésie (par exemple la tonalité de la mâchoire), la fréquence cardiaque, le rythme respiratoire, électrocardiogramme, la pression artérielle, l' oxygénation de l' impulsion, à la fin de la marée CO 2, et la température du corps tout au long de l' anesthésie et la chirurgie.
REMARQUE: Lorsque l'abdomen est insufflée, l'animal peut hypoventilate.Fournir une ventilation mécanique si le taux de respiration diminue, ou les 2 niveaux d'extrémité de marée de CO est supérieure à 45 mmHg. - Après la chirurgie, l'administration d'atipamézole (0,15 mg / kg, par voie intramusculaire) pour l'inversion de la dexmédétomidine.
- Préparation chirurgicale
- Effectuer des lavements multiples de l' eau chaude pour réduire le volume des matières fécales dans le côlon pour faciliter la visualisation et la manipulation intestinale au cours de la procédure 20.
- Utilisez un coupe avec un numéro 40 lame pour enlever les poils du champ chirurgical. Rasez de la crête costale à la symphyse et de gauche à flanc droit.
- Aseptiquement préparer le champ opératoire à l'aide d'antiseptiques appropriés, tels que l'alternance des gommages chlorhexidine-alcool ou de povidone-iode à l'alcool.
- Placez l'animal sur la table d'opération sur son dos, à un angle à mi-chemin entre dorsal et décubitus latéral droit. Attacher les bras et les jambes avec une corde dans une position étendue. Fournir une chlorhexi finaledîner et préparation de l'alcool une fois l'animal se déplace vers la salle d'opération et est positionné pour la chirurgie.
2. Chirurgie
Note: Pour plus d' informations de la coelioscopie chez les petits animaux, voir la référence 21.
- Laparoscopic Préparation de l'instrument
- Drapé l'animal avec un champ stérile fenêtré.
- Avec l'aide d'un assistant non stérile, envelopper l'appareil photo numérique avec le champ de la caméra stérile et fixer le câble à la tour. Attacher le cadre rigide à la tête de caméra.
- Attacher le câble de lumière stérile à la portée rigide et connecter le câble à la source lumineuse. Balance des blancs de l'appareil photo selon les instructions du fabricant.
- Fixer le tube de insufflateur stérile à l'insufflateur.
- Laparoscopic Entrée
- L'utilisation d'un scalpel # 15, faire une incision ~ poignarder 5 mm à travers la peau à la profondeur de la musculature abdominale, appenvi ron 1 - 2 cm à gauche de l'ombilic.
- Utilisation de la main non dominante, soulever le crâne de la paroi abdominale sur le site de l'incision. Avec la main dominante, placer la pointe de l'aiguille de Veress à travers l'incision et l'angle de la pointe crâniale.
Remarque: L'angle de pénétration de l'aiguille de Veress varie en fonction de la condition corporelle de l'animal. Par exemple, chez un animal gras, l'aiguille Veress devra être inséré presque perpendiculaire à la paroi abdominale. Chez un animal mince, l'aiguille de Veress devrait être incliné crâniale pour réduire les risques de mise en contact des viscères.- Maintenir l'arbre (non moyeu) de l'aiguille de Veress, pousser fermement l'aiguille pour pénétrer dans la paroi abdominale dans la cavité abdominale. A distinct « clic » et diminution de la résistance se fera sentir que la pointe acérée pénètre dans le péritoine et la pointe arrondie des ressorts à aiguille de Veress en avant dans la cavité abdominale.
REMARQUE: Si l'aiguille passe correctement dans ee cavité abdominale, il y aura peu de résistance quand il est avancé et retiré 1 - 2 cm.
- Maintenir l'arbre (non moyeu) de l'aiguille de Veress, pousser fermement l'aiguille pour pénétrer dans la paroi abdominale dans la cavité abdominale. A distinct « clic » et diminution de la résistance se fera sentir que la pointe acérée pénètre dans le péritoine et la pointe arrondie des ressorts à aiguille de Veress en avant dans la cavité abdominale.
- Raccorder le tuyau d'insufflation CO 2 à l'aiguille et ouvrir le robinet d' arrêt. L'abdomen pour Pressuriser pas plus de 10 à 12 mmHg pour créer un pneumopéritoine.
NOTE: L'abdomen a atteint idéal quand il insufflation a étendu de manière symétrique et il y a une perte du contour net normal des marges costaux. La pression devrait fournir un espace suffisant pour l'insertion de la canule / trocart sans risque de contact avec les viscères.
- placement canules
- Une fois que l'abdomen est complètement insufflée, faire une ~ 5 - incision 7 mm avec un n ° 15 lame de scalpel à travers la peau de l'abdomen gauche crânienne à la musculature abdominale ~ 2 - 4 cm caudal à la dernière côte.
- Placer un ensemble trocart-canule 5 mm à travers l'incision de la peau et de l'angle it ~ 45 - 60 degrés caudomedially. Pénétrer dans la cavité abdominale à une profondeur de 1-2 cm. Screw la canule filetée dans l'abdomen en faisant tourner la canule (~ 0,5 - 1 cm plus loin) à une profondeur de 1,5 - 3 cm, et retirer le trocart.
- Retirer le tube d'insufflation de l'aiguille de Veress, éteindre le robinet d'arrêt, et retirer l'aiguille. Raccorder le tuyau d'insufflation à la canule et ouvrir le robinet d'arrêt pour maintenir un pneumopéritoine à pas plus de 10 - 12 mm de Hg.
- Insérez le champ d'application rigide à travers la canule et dans la cavité abdominale.
- Sous la visualisation de la caméra, continuer à faire une petite incision avec un # 15 lame de scalpel à travers la musculature abdominale et du péritoine à l'incision cutanée précédente utilisée pour l'insertion de l'aiguille Veress. L'appareil est utilisé pour visualiser le côté de l'incision abdominale pour éviter les vaisseaux et minimiser les saignements.
REMARQUE: Assurez-vous de l'incision dans le muscle et le péritoine est assez grand pour faciliter l'entrée de la sonde et extériorisation du mésentère (~ 0,5 cm). Une plus grande incision peut être nécessaire pour extérioriser mesentrès chez les animaux avec de la graisse mésentérique excessive. - Placez l'animal dans la position déclive 21 avec les pieds surélevés à environ 15 - 30 degrés au- dessus de la tête. Cette option est facultative mais peut permettre un accès plus facile aux ganglions lymphatiques mésentériques du côlon, comme le petit tractus intestinal se déplace à une position plus crânienne.
- Mésentérique des ganglions lymphatiques Biopsie
- Dans le cadre de visualisation de la caméra, insérer une sonde solide à travers l'incision abdominale faite à l'étape 2.3.5.
- Placer la sonde entre l'épiploon et de l'intestin et en utilisant un mouvement de balayage pour balayer doucement l'épiploon de l'intestin pour permettre la visualisation du mésentère sous-jacent. En continuant d'utiliser le mouvement de balayage de la caudale à l'abdomen crânien. Le épiploon peut être placé dans l'abdomen crânienne droite de sorte qu'il est hors du champ opératoire.
- Utiliser la sonde pour déplacer le côlon descendant vers la paroi abdominale gauche ou à droite. Cela permettra une meilleure visualisation de til Mesentery pour aider à la recherche des ganglions lymphatiques mésentériques.
- Utiliser la sonde pour balayer à travers le mésentère pour localiser les ganglions lymphatiques mésentériques le long des vaisseaux du côlon et mésentériques.
REMARQUE: les nœuds Côlon courent le long de la frontière mésentérique du côlon, des ganglions coliques gauche se trouve à proximité des points de branchement des vaisseaux et les ganglions mésentériques inférieurs se trouve le long des vaisseaux mésentériques inférieurs. ganglions lymphatiques mésentériques sont facilement visibles chez les animaux maigres. Enterré dans la graisse mésentérique ils prêtent souvent un peu élevé, l'apparence scintillante à la méso sus-jacente et peut-être plus une couleur tan plus grisâtres puis entourant la graisse mésentérique. En outre, les ganglions lymphatiques mésentériques ont tendance à se trouver le long des vaisseaux lymphatiques mésentériques et vascularisation. - Une fois qu'un ganglion lymphatique est identifié, retirer la sonde et insérer la pince à cliquet Maryland dans la cavité abdominale. Utiliser la pince pour saisir le mésentère adjacent au noeud cible. Tirez le mésentère vers l'INCIsion, et supprimer le champ d'application de la canule.
- Éteignez l'insufflateur et laisser la canule ouverte pour dépressuriser robinet d'arrêt de l'abdomen pour faciliter extériorisation du mésentère. Tirez le mésentère extérieur du corps à travers l'incision. Une fois extériorisé, saisissez le mésentère avec hémostatiques anti-moustiques ou courbes pince pouce pour assurer l'accès à travers l'incision.
- Identifier le nœud lymphatique (s) dans le mésentère extériorisée par palpation pour le nœud lymphatique plus ferme et / ou la visualisation directe de la couleur grise ou l'aspect nodulaire du noeud lymphatique.
- Une fois identifié, effectuer une petite ouverture (~ 3 - 5 mm) dans le mésentère près du nœud à l'aide des pinces hémostatiques courbes. pièces jointes gratuites au mésentère en utilisant la dissection émoussé avec les hémostatiques courbes. Ligaturer la vasculature avec 4-0 suture monofilament non résorbable au besoin. Utilisation dissection avec un scalpel pour enlever les ganglions lymphatiques. Placez les noeuds dans Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 surla glace.
- Examinez le mésentère extériorisé pour des saignements. Si le saignement est noté, fournir hémostatique approprié en bouchant les vaisseaux avec hémostatiques ou ligatures (4-0 de suture monofilament non résorbable), ou par l'utilisation de cautérisation. Relâchez le mésentère et insufflera l'abdomen retour à 10 - 12 mm Hg pour permettre au mésentère de revenir à la cavité abdominale.
- Répéter les étapes 2.4.1 à travers 2.4.8 pour obtenir des biopsies de ganglions lymphatiques supplémentaires.
- biopsie du foie
- Retour à la table en position horizontale.
- Placer une canule filetée dans l'abdomen à travers l'incision précédemment utilisé pour la collecte de biopsie des ganglions lymphatiques (incision faite dans l'étape 2.3.5). Assurez-vous de l'incision est assez grand (~ 5 - 7 mm) pour permettre le placement de la canule sans insertion de trocart. Insérez le champ d'application rigide à travers cette canule vers la cavité abdominale du crâne et de visualiser l'abdomen du crâne et du foie.
- Dans le cadre de visualisation de la caméra, insérer la biopsie forceps à travers la canule précédemment placés dans l'abdomen cranial gauche (incision faite dans l'étape 2.3.1).
- Pour obtenir des biopsies du foie, placer les pinces à biopsie sous la marge de lobe du foie sélectionné avec la partie mobile de la mâchoire tournée vers le foie, ouvrir la pince, et de permettre la marge de tomber entre les mâchoires ouvertes. Veiller à ce qu'aucun épiploon est entre le foie et une pince à biopsie. Ajuster la position de la pince et fermer l'instrument au-dessus de la zone d'échantillon souhaitée.
- Maintenir la pression pendant environ 20 - 30 s pour assurer hémostatique. Avec la pince fermée, retirer l'échantillon en tirant doucement sur la pince à travers la canule. Ceci doucement déchirer la biopsie du foie. Placer des biopsies du foie dans du milieu RPMI 1640 sur de la glace.
REMARQUE: La taille de la biopsie du foie est d'environ 5 mm x 2 mm x 2 mm à l'aide de 5 mm de forceps de biopsie.
- Maintenir la pression pendant environ 20 - 30 s pour assurer hémostatique. Avec la pince fermée, retirer l'échantillon en tirant doucement sur la pince à travers la canule. Ceci doucement déchirer la biopsie du foie. Placer des biopsies du foie dans du milieu RPMI 1640 sur de la glace.
- Examinez le site de biopsie pour une hémorragie en utilisant la visualisation de la caméra. Si l'hémorragie est observée, placez une moistene salined coton-tige stérile à travers la canule et appliquer une pression sur le site de biopsie. En variante, emballer les sites de biopsie avec la mousse de gel stérile pour faciliter l'hémostase.
- Répétez les étapes 2.5.3 à travers 2.5.5 pour obtenir des biopsies hépatiques supplémentaires.
REMARQUE: Ici, 3 biopsies par animal et par procédure ont été recueillies, ce qui est suffisant pour toutes les analyses en aval.
- Fermeture chirurgicale
- Examinez la cavité abdominale pour des saignements.
NOTE: Cela n'a pas eu lieu à ce jour. Cependant, si le saignement excessif est noté, déterminer le site de l'hémorragie et de fournir une hémostase appropriée par l'intermédiaire d'une pression avec des tampons de coton stériles ou l'utilisation d'une mousse de gel. - Éteignez l'insufflateur et ouvrez la canule robinets d'arrêt. Appliquer une légère pression manuelle sur l'abdomen pour dépressuriser complètement la cavité péritonéale. Retirez les canules.
- Fermez chacune des incisions de la paroi abdominale avec 1 à 2 simples sutures interrompues par site. 4-0 suture absorbable est recommandé.
- Effectuer un bloc de démarrage en plaçant bupivacaïne 0,1-0,3 cc dans chaque incision pour l'analgésie locale avant la fermeture de la peau.
- Fermez la peau avec 1 - 2 enterrées sutures interrompues (4-0 suture absorbable est recommandé) par site. colle tissulaire peut être appliquée.
- Examinez la cavité abdominale pour des saignements.
3. Traitement et biopsie du foie lymphocytaire Analyse
- Magasin plusieurs morceaux de tissu de foie (environ 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm de diamètre) dans des tubes de cryoconservation, dans une solution de stockage de l'ARN préféré, et 10% de formaline pour l'avenir moléculaire et l'analyse histologique.
- Placer les biopsies du foie restant dans 50 ml de milieu RPMI 1640 additionné de 1 x pénicilline / streptomycine, 40 pg / ml d'une solution de collagénase disponible dans le commerce, et 4 pg / ml de DNase dans une tasse de 250 ml en plastique stérile avec un couvercle. On agite vigoureusement en utilisant un barreau d'agitation magnétique et d'une plaque d'agitation pendant 1 h à 37 ° C.
- répartir en versant le tissu digéré. Grind le tissu digéré (étape 3.1.1) sur deux filtres de 70 pm insèrent dans deux tubes coniques de 50 ml dans une suspension de cellules individuelles en utilisant l'extrémité d'une seringue stérile de 5 ml. Amener le volume des deux tubes de 50 ml dans du milieu RPMI 1640 additionné de 10% de sérum bovin fœtal et 1 x pénicilline / streptomycine (R10).
- Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter le surnageant. Concentrer les cellules dans un tube conique de 50 ml en mettant en suspension les cellules à partir des deux tubes dans 5 ml de R10 et de combinaison dans un tube conique de 50 ml. Amener le volume à 50 ml en utilisant R10. Nombre de cellules en utilisant un hémocytomètre pour déterminer le rendement cellulaire.
- Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Remettre en suspension les cellules dans 1 ml de R10, répartir en deux tubes de 5 ml en polystyrène à fond rond et à amener le volume de chaque tube de 4 ml avec R10, pour le ciblage> 500.000 cellules dans chaque tube.
- Centrifuger les cellules à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter les supernatant et remettre en suspension le culot de cellules dans 4 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Centrifuger à 840 g pendant 6 min à 4 ° C.
- Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 100 ul de PBS par agitation par tourbillonnement doucement. Ajouter 1,5 ul d'une tache de cellules mortes réparable. Incuber à température ambiante pendant 5 min.
- Ajouter les anticorps de coloration de surface non dilué suivants dans les titres recommandés par le fabricant: CD45-PerCP (de D058-1283 clone), CD3-PE-CF594 (clone SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (clone 2H7), CD4-BV605 ( OKT4 clone), CD8-BV570 (clone RPA-T8), et CD14-BV785 (clone M5E2). Incuber à 4 ° C pendant 20 min.
- Ajouter 4 ml de PBS et centrifuger à 840 g pendant 6 min à 4 ° C. Décanter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans 250 ul de 1% de paraformaldehyde dans du PBS.
Attention: paraformaldéhyde est toxique. Porter un équipement de protection individuelle approprié. - Analyser les populations cellulaires en utilisant un cytomètre de flux comme décrit en référence 22.
Representative Results
Des méthodes détaillées pour le traitement des MLN collectés par voie laparoscopique, ainsi que des rendements cellulaires, et les fréquences leucocytaires dans ces organes ont été rapportés 13. La figure 1 montre les données de rendement cellulaire et la viabilité comparant le MLN et les biopsies du foie recueillies à deux points de temps 160 jours en dehors de deux RMs femelles en bonne santé en utilisant cette technique laparoscopique. Nous avons trouvé que le rendement cellulaire du MLN était significativement plus élevée que dans le foie (P = 0,0021), avec une moyenne de 33,5 x 10 6 et 6,74 x 10 6 cellules obtenues, respectivement. coloration et l'analyse des cellules mortes par cytométrie de flux indiqué que> 90% des cellules isolées des deux organes étaient viables.
, Nous avons évalué par cytométrie en flux et comparé l'abondance des leucocytes et des lymphocytes dans le MLN et le foie. Un système de déclenchement représentatif pour le foie est représenté dans
Figure 1. Rendement total cellulaire ( en haut) et la viabilité cellulaire (en bas) à partir accumulés en série MLN et du foie Les biopsies. Le MLN a montré des rendements des cellules significativement plus élevé que le foie. Cependant, les deux types d'échantillons fournis cellules suffisantes pour les analyses en aval. La viabilité cellulaire, mesurée par le débit cytomen utilisant une tache de etrically amine de cellules mortes peut être fixé, a montré que les deux types d'échantillons ont donné typiquement> viabilité cellulaire de 90% après dissociation des tissus. Les barres d'erreur représentent l'écart-type entre les échantillons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2. Débit représentant Cytométrie Gating Stratégie. Tout d'abord, les cellules agrégées ont été exclues, suivie par la sélection de cellules viables seulement après coloration à l'aide d'une tache d'amine de cellules mortes réparable. Ensuite, les leucocytes CD45 + ont été sélectionnés, suivis par la sélection des cellules T CD3 +. De la population CD3 +, CD4 + et CD8 + lymphocytes T ont été analysées. De la CD3 - population, CD14 + et les cellules CD20 + ont été analysées. Thi s stratégie de gating a également été utilisé pour le MLN. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3. cytométrie de flux Parcelles de MLN et du foie de deux animaux. Longitudinalement MLN et des échantillons de foie ont été prélevés 160 jours d'intervalle pour les animaux. (A). MLN CD45 + cellules (leucocytes); (B) de foie de cellules CD45 + (leucocytes); (C) + MLN cellules CD3 + (cellules T); (D) de foie de cellules CD3 + (cellules T). Pour les animaux, le MLN a montré des proportions plus élevées de CD45 + et les cellules CD3 + par rapport au foie. À travers le temps, les fréquences de ces populations étaient similaires pour les deux animaux.s / ftp_upload / 55617 / 55617fig3large.jpg » target = "_ blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4. Fréquences de cellules CD45 + ( à gauche) et Divers leucocytaire et lymphocytaire sous - populations ( à droite) dans 23 Prélèvements individuels. Les MLN affichés significativement plus grandes fréquences de CD45 +, CD3 +, CD4 + et les cellules, alors que le foie a montré des fréquences significativement plus importantes de leucocytes CD14 +, ce qui démontre les fonctions uniques de chaque organe. Les barres d'erreur représentent l'écart-type entre les échantillons. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Discussion
Ici, nous démontrons une technique mini-invasive pour la collecte série de MLN et des biopsies hépatiques qui a eu un taux de réussite de 100% dans ces et d'autres animaux ne sont pas décrits dans cette étude. De plus, l'utilisation de cette technique sur les mêmes animaux à travers le temps n'a pas été associé à aucun événement indésirable. En effet, il n'y a pas eu de complications résultant de l'utilisation de cette technique dans d'autres cohortes d'animaux qui ont été infectés par le SIV, le virus de l'immunodéficience simienne / humain (SHIV), ou d'un virus Zika (données non publiées). De même, cette chirurgie a même fait ses preuves chez les animaux qui avaient subi une chirurgie abdominale majeure, et chez les animaux thrombocytopénie (données non publiées). Nous avons démontré que ces échantillons peuvent être prélevés dans les deux mêmes ports en inversant la position de la caméra lors du passage du MLN au foie en évitant la nécessité d'incisions supplémentaires. Facteurs influant sur la collecte de MLN ont été rapportés 13.
Toute la procédure prend généralement 30 - 45 min à remplir et est réalisé par deux incisions ~ 0,5 cm. Chez les animaux obèses, il peut être nécessaire de faire une plus grande incision (~ 1 à 1,5 cm) pour récupérer MLN à travers et peut nécessiter plus de temps pour terminer. Les animaux ayant une grande graisse mésentérique exigent souvent une expérience significative à differentiate MLN de la graisse environnante. MLN sont souvent trouvés le long de la vasculature mésentérique et semblent être plus fréquentes près des points de branchement des navires. Un aspect essentiel de cette technique est qu'elle nécessite le MLN choisi pour avoir une mobilité suffisante dans le mésentère être extériorisée par l'incision abdominale. En conséquence, cette technique ne peut pas être utilisé pour recueillir MLN près de la racine du mésentère. En raison de grossissement, il est parfois plus facile d'identifier MLN avec la caméra, et de saisir à proximité du MLN peut aider à localiser et identifier le noeud une fois qu'il est extériorisé.
L'utilisation de la position déclive ne peut pas toujours être nécessaire pour la collecte MLN, et si MLN peut être facilement récupéré sans l'utilisation de la position déclive il peut faire des biopsies du foie plus facile, car elle empêche les organes de se déplacer céphalique. Parfois, après le placement en position de Trendelenburg, le foie est déplacé vers le haut contre le diaphragme et le moût manipuler doucement dans sa position avant la collecte de biopsie. Comme le placement de port pour la collection MLN se trouve à gauche, des biopsies du foie sont généralement prélevés sur les lobes du foie médiales latérales gauche et droite comme ils sont plus proches de la canule.
Recueillies MLN et des biopsies du foie fourni des rendements de cellules suffisant pour diverses analyses en aval et ont montré une viabilité élevée des cellules recueillies. Ici, les cellules ont été colorées pour l'analyse cytométrique des populations de leucocytes et de lymphocytes, et les principales différences entre ces deux importants organes immunitaires ont été élucidées. Par exemple, le MLN ont été fortement enrichi pour les cellules T CD4 + par rapport au foie, en raison de l'importance du MLN en tant que points centraux pour la collecte et la diffusion des réponses immunitaires adaptatives, ainsi que l'importance des CD4 + T pour la gestion inflammatoire et Réponses tolérogènes au milieu des antigènes dérivés de l'apport alimentaire et des micro-organismes GI-résidents = "xref"> 24. Cependant, le foie a été considérablement enrichie CD14 + leucocytes par rapport au MLN. CD14 est exprimé de manière prédominante sur les monocytes et les macrophages et constitue un élément clé du complexe récepteur de lipopolysaccharide bactérien (LPS) 25. En effet, les concentrations plasmatiques accrus de CD14 soluble sont associés à une translocation microbienne et l' activation immunitaire dans le VIH et infections pathogènes 26 SIV. Ainsi, des fréquences plus élevées de CD14 + leucocytes dans le foie résultent probablement d'une plus grande charge bactérienne dans cet organe par rapport au MLN.
Ici, nous démontrons une technique chirurgicale rapide et peu invasive pour la collecte série de MLN et des biopsies du foie en utilisant seulement deux petites incisions pour l'entrée laparoscopique qui n'a pas donné lieu à des résultats défavorables. Ces échantillons fournissent une voie utile pour évaluer les processus immunologiques, virologiques et microbiologiques clés qui prennent DLMMCE dans le MLN et le foie, qui sont séparés et unique de l'immunité systémique. De même, les biopsies du foie sont essentielles pour l'évaluation à long terme des effets du VIH / SIV, des traitements médicamenteux et les microbes qui se combinent, relocalisés souvent pour induire des lésions hépatiques importantes 16. De plus, parce que le MLN et le foie sont des organes immunitaires exposés à GI microbiote, la capacité d'évaluer l'immunité dans ces organes à travers le temps fournit une excellente plate-forme pour comprendre le rôle que joue le microbiome dans le maintien de l'homéostasie hôte immunitaire. Dans l'ensemble, l'évaluation du foie et MLN est d'une grande importance dans le contexte du vaccin et des efficacités thérapeutiques, la clairance du réservoir viral SIV, et l'immunité de la muqueuse générale. La capacité de recueillir ces échantillons grâce à une approche mini-invasive signifie qu'il ya moins de risque d'inflammation liée à la procédure que celle qui existe actuellement des techniques publiées et moins d'impact sur la physiologie des animaux. Dans le future, nous allons évaluer le potentiel de combiner la collecte de MLN et le foie avec la collection de la rate à travers les deux mêmes endroits du port pour permettre l'échantillonnage d'une autre partie importante et distincte du système immunitaire qui a été montré à jouer un rôle important dans un certain nombre de modèles de la maladie.
Disclosures
Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le numéro de subvention du NIH P51OD010425.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Artficial Tears Lubricant Ophthalmic Ointment | Patterson Veterinary | 97-890-8152 | |
| Priority Care Chlorhexidine 2% Scrub | Patterson Veterinary | 07-842-6153 | |
| Vedco Alcohol, Isopropyl 70% | Patterson Veterinary | 07-869-6434 | |
| Vedco Vetadine Scrub | Patterson Veterinary | 07-869-6772 | |
| Hospira Lactated Ringer's 250 mL | Patterson Veterinary | 07-800-9325 | |
| Adolescent Laparotomy Surgical Drape | Medline | DYNJP3004 | |
| Access 40 L Insufflator | Dyonics | 7205832 | |
| 300XL Xenon Light Source | Dyonics | 7206084 | |
| 460P 3 – CCD Digital Camera with Head | Dyonics | 72200086 | |
| Universal Camera Drape, 7” x 96” | Endoscopy Support Services | ESS-6920 | |
| Universal Light Guide, 7.5 Ft | Endoscopy Support Services | US.OU225 | |
| Insufflator Tubing | Endoscopy Support Services | TM-102 | |
| Multipurpose Rigid Scope, 2.7 mm x 187.5 mm, 0 degree | Endoscopy Support Services | B30-0007-00 | |
| Exam and Protective Sheath for 2.7 mm x 187.5 mm scope with one fixed stopcock | Endoscopy Support Services | B10-0025-00 | |
| Rigid scope, 5 mm x 300 mm | Endoscopy Support Services | B30-0071-00 | |
| Veress Needle, 2 mm x 80 mm | Endoscopy Support Services | 8302.08 | |
| Solid Probe with Markings, 5 mm x 320 mm | Endoscopy Support Services | 8383.661 | |
| Maryland Grasping and Dissecting Forceps with Double Action Ratchet Handle, 3.5 mm x 240 mm | Endoscopy Support Services | 8390.2054 | |
| Biopsy Forceps, 3.5 mm x 310 mm | R. Wolf | 8391.4063 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 3.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8903.072 | |
| Plastic Threaded Cannula with Insufflator Port, 5.5 mm x 60 mm | Endoscopy Support Services | 8919.333 | |
| Blunt Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.101 | |
| Pyramidal Tip Trocar | Endoscopy Support Services | 8903.121 | |
| CO2 | Airgas | CD USPE | |
| RPMI 1640 | Fisher Scientific | SH30027FS | with L-Glutamine |
| RNAlater Stabilization Solution | ThermoFisher Scientific | AM7021 | |
| Penicillin-Streptomycin | Sigma Aldrich | P4333 | |
| Liberase TM Research Grade | Sigma Aldrich | 5401119001 | Commercially available colleganse solution |
| Dnase I from bovine pancrease | Sigma Aldrich | D5025 | |
| 70 µm cell strainers | Morganville Scientific | CSS0200 | |
| 5 mL Syringe | BD | 309646 | |
| 50 mL Conical Centrifuge Tubes | ThermoFisher Scientific | 339652 | |
| Fetal Bovine Serum | Fisher Scientific | SH3007003 | |
| 5 mL Round-Bottom polystyrene tubes | Fisher Scientific | 14-959A | |
| PBS | Fisher Scientific | SH3025601 | |
| LIVE/DEAD Aqua Fixable Dead Cell Stain Kit | ThermoFisher Scientific | L34957 | Amine dead cell stain |
| CD45-PerCP (clone D058-1283) | BD Biosciences | 558411 | |
| PE-CF594 Mouse anti-Hu CD3 (clone SP34-2) | BD Biosciences | 562406 | |
| BV605 Mouse Anti-Hu CD4 (clone OKT4) | Biolegend | 317438 | |
| APC-H7 Mouse anti-Hu CD8 (clone SK1) | BD Biosciences | 560179 | |
| PE-Cy5 Mouse Anti-Hu CD20 (clone 2H7) | BD Biosciences | 555624 | |
| BV786 Mouse Anti-Hu CD14 (clone M5E2) | BD Biosciences | 563698 | |
| 16% PARAFORMALDEHYDE AQ SOLUTN | Fisher Scientific | 50-980-487 | |
| LSR II Flow Cytometer | BD | NA |
References
- Peterson, L. W., Artis, D. Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis. Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).
- Jacobs, J. P., Braun, J. Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome. FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).
- Macpherson, A. J., Smith, K. Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy. J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).
- Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. Microbiota, immunity and the liver. Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).
- Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions. Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).
- Shuai, Z., et al.
- Chun, T. W., et al. Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy. J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).
- Horiike, M., et al. Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy. Virology. 423 (2), 107-118 (2012).
- North, T. W., et al. Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS. J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).
- Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection. J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).
- Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys. Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).
- Dillon, S. M., et al. An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia. Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).
- Jiang, W., et al. Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection. J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).
- Sandler, N. G., et al. Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection. J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).
- Klase, Z., et al. Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection. Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).
- Evans, T. I., et al. SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage. J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).
- Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn. , Elsevier. (2011).
- Flecknell, P. A. Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn. , Academic Press. (2009).
- Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia. , Blackwell Publishing. (2007).
- Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn. , Elsevier. (2012).
- Fransson, B. A., Mayhew, P. D. Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy. , Wiley Blackwell. (2015).
- Hensley-McBain, T., et al. Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques. J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).
- Smedley, J., et al. Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques. PLoS One. 11 (6), 0157535 (2016).
- Park, J., et al. Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway. Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).
- Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. CD14: cell surface receptor and differentiation marker. Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).
- Brenchley, J. M., et al. Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection. Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).
