Summary
نحن تصف تقنية لاستخدام الخلايا الجذعية الجنينية في الفئران لتوليد اثنين أو ثلاث جثث مضغي الأبعاد. نحن ثم شرح كيف للحث على تمايز العصبي من خلايا الجسم مضغي من حمض الريتينويك، وكيفية تحليل حالتهم التمايز عن طريق خلية سلفية المناعي علامة وimmunoblotting.
Abstract
الخلايا الجذعية الجنينية (المجالس الاقتصادية والاجتماعية) معزولة عن الكتلة الداخلية من الكيسة الأريمية (عادة في E3.5 اليوم)، ويمكن أن تستخدم في المختبر نظام نموذجي لدراسة التطور الجنيني المبكر. في حالة عدم وجود عامل مثبط سرطان الدم (LIF)، المجالس الاقتصادية والاجتماعية تفرق افتراضيا في الخلايا العصبية السلائف. ويمكن جمع إلى ثلاثي الأبعاد (3D) ووصف مجموع كروية الجسم مضغي (EB) نظرا لتشابهه مع الجنين مرحلة مبكرة. EBS يمكن المصنف coverslips على فبرونيكتين المغلفة، حيث أنها توسع من خلال زراعة اثنين الأبعاد (2D) التمديدات، أو زرع في مصفوفات الكولاجين 3D حيث تواصل نموها كما الكروية، وتفرق في الطبقات الجرثومية الثلاث: الأديم الباطن، أرومية متوسطة، والأدمة. ثقافة الكولاجين 3D يحاكي البيئة في الجسم الحي بشكل وثيق من 2D EBS. ثقافة 2D EB تسهل التحليل المناعي وimmunoblotting لتتبع التمايز. لقد قمنا بتطوير من خطوتين فارق العصبيبروتوكول نشوئها. في الخطوة الأولى، يتم إنشاء EBS بواسطة تقنية شنقا الإفلات، و، في وقت واحد، والتي يسببها للتمييز عن التعرض لحمض الريتينويك (RA). في الخطوة الثانية، وعائدات التمايز العصبية في شكل 2D أو 3D في غياب RA.
Introduction
المجالس الاقتصادية والاجتماعية تنشأ من الكيسة الكتلة الخلوية الداخلية. هذه الخلايا هي المحفزة، أي أنها تملك القدرة على التمايز إلى أي نوع من الخلايا في الكائن الأصلي. ESC في المختبر التمايز هو من اهتمام واسع كنظام تجريبي للتحقيق في مسارات وآليات التنموية. ويقدم نظام نموذجي قوي ومرن لاختبار أساليب علاجية جديدة لتصحيح الخلايا والأنسجة الخلل. EBS تلخيص جوانب كثيرة من تمايز الخلايا خلال مرحلة التطور الجنيني المبكر. على وجه الخصوص، EBS يمكن استخدامها عند الفتك الجنينية يجعل من الصعب تحديد الأساس الخلوي للعيوب الجنينية 1 و 2. EBS يمكن أن تتكون إما من قبل قطرة شنقا أو تقنيات تعليق السائلة 3. ميزة السابق هو القدرة على توليد EBS من حجم ثابت وكثافة، مما يسهل استنساخ التجربة.
معشوقة = "jove_content"> التفاعل مع الخلية البروتينات التصاق مصفوفة (ECM) قد تؤثر على القدرة على الحركة وبقاء الخلايا الملتصقة. في نظام الثقافة 2D، وغالبا ما يتم تطبيق فبرونيكتين لزيادة التصاق الخلية إلى الركيزة. فبرونيكتين عنصرا الصفيحة القاعدية التي تعترف بها 10 أنواع من سطح الخلية إنتغرين heterodimers 4.
RA هو الأيض للدهون صغيرة من فيتامين (أ) الذي يسبب العصبية التمايز 5، 6. تركيزات عالية من RA تعزيز التعبير الجيني العصبي وتقمع التعبير الجيني أرومية متوسطة خلال تشكيل EB 7 و 8. ويتم إنتاج RA فيتامين ألف الأكسدة لريتينالديهيد إما عن طريق الكحول أو الريتينول نازعة، تليها الأكسدة ريتينالديهيد إلى المنتج النهائي من قبل ريتينالديهيد نازعة 9. التمايز العصبي يتطلب نقل RA من السيتوبلازم إلى النواة التي الخلوي ملزم RA بروتين 2 (CRABP2). في النواة، RA تربط لمجمعها مستقبلات وما شابه ذلك تتألف من مغاير RAR-RXR 10. وهذا يؤدي إلى توظيف النسخي شارك في تفعيل، والشروع في النسخ 9 و 11. وعلاوة على ذلك، RA يعزز تدهور فسفرته (نشط) SMAD1، وبالتالي استعداء BMP وSMAD يشير 12. وبالإضافة إلى هذه الأنشطة، RA يزيد التعبير Pax6، وهو عامل النسخ التي تدعم العصبية التمايز 13. والتضمين إشارات RA التي كتبها sirtuin-1 (SIRT1)، وثنائي النوكليوتيد الأدينين نيكوتيناميد النووي (NAD +) - انزيم يعتمد ذلك deacetylates CRABP2، والتدخل مع النبات لالنواة، وبالتالي مع RA ملزمة لمغاير RAR-RXR 14، 15، 16.
e_content "> هدفنا في تصميم بروتوكول EB تعامل RA-الموصوفة هنا هو تحسين التمايز العصبي من أجل تسهيل في المختبر تحليل مسارات الإشارات التي تنظم ESC التمايز في الخلايا العصبية السلائف. واحدة من مزايا هذا البروتوكول هو تيسير تحليل وظيفة الخلية التي كتبها المناعي. 3D EBS لم يتم اختراقها بشكل جيد من قبل الأجسام المضادة ويصعب الصورة. تفارق EB إلى أحادي الطبقة 2D في نقطة زمنية محددة خلال التمايز العصبي يسهل immunolabeling والتصوير من الخلايا عن طريق الفحص المجهري متحد البؤر.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. ثقافة الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS)
- إعداد المتوسطة MEF والمتوسطة تعديل النسر Dulbecco وفي (DMEM، وارتفاع الجلوكوز)، على أن تستكمل مع المصل 15٪ بقري جنيني (FBS).
- معطف 100 ملم أطباق زراعة الخلايا مع 0.5٪ محلول الجيلاتين لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT).
- عدد MEFS باستخدام عداد الكريات. إزالة حل الجيلاتين وتصب على الفور MEF المتوسط قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. بسرعة ذوبان الجليد قارورة من ميتوميسين MEFS المعالجة C في 37 ° C حمام الماء لمدة 2 دقيقة، ثم البذور 2.8 × 10 6 MEFS لكل 100 ملم طبق الجيلاتين المغلفة. ضبط عدد الخلايا تبعا لذلك في حالة استخدام أطباق من أحجام أخرى. احتضان MEFS بين عشية وضحاها في 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- تغيير المتوسطة في اليوم التالي. الثقافة لمدة 2-3 أيام حتى طبقة MEF هي متموجة.
2. الفأر ESC الثقافة
- إعداد ESC المتوسطة، Iscove لتعديل المتوسطة Dulbecco و(IMDM) تستكمل مع 15٪ FBS و 103 U / مل عامل اللوكيميا المثبطة (LIF)، 0.1 ملي الأحماض الأمينية غير الأساسية، 55 مم 2-المركابتويثانول، البنسلين (100 U / مل)، الستربتومايسين (100 ميكروغرام / مل)، جنتاميسين (200 ميكروغرام / مل)، و 0.2٪ الميكوبلازما المضادات الحيوية.
- إزالة MEF المتوسطة من الطبق المعد في الخطوة 1 واستبدالها مع 37 ° C قبل تحسنت المتوسطة ESC.
- تذويب قارورة ESC وخلايا البذور في أعلى طبقة MEF. احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، حتى الوصول إلى نقطة التقاء المجالس الاقتصادية والاجتماعية.
- إعداد أطباق ثقافة خلية جديدة تحتوي على أحادي الطبقة متموجة من MEFS. لمرور المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ويغسل مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني وفصل مع 0.25٪ التربسين / EDTA لمدة 2-5 دقائق عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2. وقف trypsinization بإضافة IMDM الطازجة مع 15٪ FBS إلى الخلايا فصل، ونقل تعليق خلية إلى أنبوب 15 مل، وأجهزة الطرد المركزي في 160 x ج لمدة 5 دقائق في RT.
- إزالة طاف، المجالس الاقتصادية والاجتماعية إعادة تعليق مع IMDM الطازجة ومرور خمس الخلايا إلى كل طبق جديد المغلفة MEF؛ احتضان حتى الخلاياوصول إلى نقطة التقاء (عادة 4-5 أيام).
3. سحب MEFS والمجالس الاقتصادية والاجتماعية الثقافة على لوحات المغلفة الجيلاتين،
- مرة واحدة وصلت ECSS التقاء، فصل بينها وMEFS مع 0.25٪ التربسين / EDTA كما في الخطوة 2.4، resuspend الخلايا في IMDM جديدة، ونقل إلى غير لاصقة طبق بتري الجرثومية، واحتضان لمدة 40 دقيقة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
- نقل بعناية المجالس الاقتصادية والاجتماعية وMEFS التي تحتوي على المديين المتوسط ولوحة جديدة الجيلاتين المغلفة باستخدام 5 مل ماصة، وتجنب pipetting لالمتكررة. الخلايا المتبقية في أطباق بتري هي MEFS، منذ المجالس الاقتصادية والاجتماعية لا تلتزم.
- مرور المجالس الاقتصادية والاجتماعية كل 3-4 أيام. أقل الركض المتكرر قد يقلل ESC تعدد القدرات. لا تتجاوز 60٪ التقاء، لأنها قد يفضلون التمايز.
- كرر الخطوات من 3،2-3،3 ثلاث مرات أو أكثر، حسب الاقتضاء، حتى MEFS لم تعد كشفها بواسطة المجهر زراعة الخلايا، وذلك باستخدام الهدف 20X، للتأكد من MEFS غير موجودة.
- تحقق ESC تعدد القدرات عن طريق التحقق من ESCالثقافة لمعرفة ما إذا كان شكل خلايا مستعمرات كثيفة مع نموذجي ESC مورفولوجيا المضلع (الشكل 1A). stemness خلية الاختبار الكمي عكس سلسلة من ردود الفعل الناسخ البلمرة (QRT-PCR) 17، immunoblotting 17، أو المناعي النسخ تعدد القدرات الأساسية عوامل 17 (الشكل 2).
4. EB تشكيل
- إعداد جميع العابر-RA حل السهم عند 10 ملم في DMSO، وقسامة إلى 1.5 مل أنابيب microfuge محمية الضوء. الحل هو مستقر في -80 درجة مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين. حمايتها من الضوء.
- يعرض للتريبسين المجالس الاقتصادية والاجتماعية كما في الخطوة 2.4. replate في IMDM جديدة بدون LIF، وتعليق وحيدة الخلية.
- عد الخلايا باستخدام عدادة الكريات، وإعداد 5 × 10 5 خلية / مل تعليق في IMDM مع 0.5 ميكرومتر RA.
- لوحة 100 20 ميكرولتر قطرات لكل 100 ملم طبق بتري مع ماصة 8 قنوات و 200 نصائح ميكرولتر، قلبالأطباق، وملء غطاء المقلوب مع PBS لمنع قطرات تتدلى من التجفيف. حماية وسائل الإعلام الثقافة التي تحتوي على RA بعيدا عن الضوء.
- ثقافة EBS في شنقا قطرات عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، لمدة 4 أيام.
5. 2D EB الثقافة
- معطف 12 ملم coverslips الزجاج دائري مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة في RT. وضع كل ساترة في بئر من 24 لوحة جيدا، وإضافة 1 مل IMDM لكل بئر.
- حصاد 3 شنقا انخفاض EBS واحدا تلو الآخر مع 200 نصائح ميكرولتر ماصة والبذور منها على لل coverslips المغلفة فبرونيكتين، 20 EBS لكل بئر، وذلك باستخدام نفس نصائح ماصة نمت يوما.
ملاحظة: لمدة 3 أيام EBS هي الأفضل على EBS 4 أيام لأنها تلتزم أفضل للل coverslips. - تواصل الثقافة مع IMDM 15٪ FBS دون LIF. استبدال المتوسطة كل 3-4 أيام. جمع الوسيلة المستخدمة لتحليل إفراز بروتين حسب الحاجة.
6. الكشف عن البروتينات يفرز
- نقل 500 ميكرولتر من EB ميديأم إلى 10 مرشحات الطرد المركزي كيلو دالتون، قطع، وتدور في 20000 x ج لمدة 60 دقيقة على 4 درجات مئوية.
- دراسة المتوسطة المتبقية داخل مرشحات الطرد المركزي كل 15-20 دقيقة لمنع تخصيب المفرط. وقف الطرد المركزي عندما انخفض حجم المتوسطة المتبقية إلى 25 ميكرولتر.
- جمع المتوسطة تتركز المتبقية بعد قلب مرشح والغزل في 160 x ج في 4 درجات مئوية، وبعد تعليمات الشركة الصانعة.
- الكشف عن البروتينات التي يفرزها immunoblotting مع الأجسام المضادة المحددة 17.
7. 3D EB الثقافة
- جمع EBS نمت لمدة 4 أيام في شنقا قطرات كما هو موضح في الخطوة 5.2، ووضعها في 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي (30 EBS في أنبوب).
- إعداد الكولاجين حل هلام بعد تعليمات من عدة ثقافة الكولاجين 3D (انظر المواد / المعدات الجدول). تمييع كميات مناسبة من محلول الكولاجين و5X DMEM (أحد مكونات عدة)؛ إضافة نحل eutralization (أحد مكونات الطقم) وتخلط جيدا فورا، والحفاظ على هذا على الجليد.
- ماصة حجم مناسب من حل الكولاجين المبردة في أنبوب 1.5 مل تحتوي على EBS، ونقل بلطف إلى آبار لوحة 6 جيدا باستخدام 1 مل ماصة. تجنب الوقوع في فقاعات.
- على الفور نقل لوحة إلى 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، لمدة 60 دقيقة لبدء الكولاجين بلمرة.
- تراكب لوحة EB التي تحتوي على مع IMDM.
- تغيير المتوسطة كل 3-4 أيام.
8. EB التفكك
- جمع يوم 4 EBS (من الخطوة 4) واحدا تلو الآخر، مع 200 نصائح ميكرولتر ماصة ونقلها إلى غير لاصقة البكتريولوجي طبق بتري تحتوي على IMDM مع 15٪ FBS. الثقافة عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2 لمدة 4 أيام أخرى. تحقق من EBS مرتين كل يوم للتأكد من أنها لا نعلق على الجزء السفلي. يهز بلطف الطبق لمنع EB المرفق إلى أسفل.
- الطرد المركزي EBS في 185 x ج لمدة 5 دقائق فيRT، في جهاز للطرد المركزي الفوق.
- إزالة supernatants. يجب أن لا يتجاوز بيليه 100 ميكرولتر في كل أنبوب.
- إضافة إلى مكعبات EBS 1 مل نوع 0.25٪ I كولاجيناز في الأنبوب، على أن تستكمل مع 20٪ FBS في برنامج تلفزيوني.
- احتضان الخليط EB-كولاجيناز لمدة 1 ساعة على 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2، pipetting لبرفق كل 20 دقيقة، وذلك باستخدام 1 نصائح ماصة مل.
- غسل الخلايا 3X بلطف مع PBS. إذا المجاميع خلية موجودة، استخدم مصفاة الخلية مع شبكة 100 ميكرون لإزالتها.
- Replate الخلايا على الجيلاتين المغلفة أطباق 60 ملم في IMDM. ثم احتضان عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO 2.
9. ترنسفكأيشن من فصل EBS
- لQRT-PCR وimmunoblotting، ومعطف لوحة 6 جيدا مع 0.5٪ الجيلاتين.
- لالمناعي، coverslips الزجاج معطف مع 30 ميكروغرام / مل فبرونيكتين لمدة 30 دقيقة في RT. وضع كل ساترة في بئر من 24 لوحة جيدا. إضافة IMDM.
- البذور 4.75 × 5 10 أو 1 × 10 5
- تنمو الخلايا إلى 70٪ التقاء قبل ترنسفكأيشن.
- Transfect الخلايا من قبل nonliposomal الدهون كاشف الخلايا الجذعية الأمثل 17 (انظر المواد / المعدات الجدول)، بعد تعليمات الشركة الصانعة.
ملاحظة: الكاشف كنا بلغ عادة كفاءة ترنسفكأيشن من 50٪ (انظر ممثل النتائج). - تحليل العينات التي QRT-PCR أو immunoblotting بعد 17 2 أو 3 أيام ترنسفكأيشن، على التوالي.
10. تحليل EB التمايز التي كتبها المناعي
- غسل 2D EBS أو فصل EBS 3D مع برنامج تلفزيوني والإصلاح مع بارافورمالدهيد 4٪ في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة في RT. غسل الخلايا الثابتة 3X مع PBS لإزالة الحطام العائم الخلية.
ملاحظة: لامتصاص العرق والجلد والعين إزعاج. توخي الحذر عند التعامل مع الامر. إضافة 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني لpermeabilize الخلايا لمدة 20 دقيقة في RT، ثم يغسل 3X مع برنامج تلفزيوني. - إزالة برنامج تلفزيوني ومنع مع 5٪ BSA في برنامج تلفزيوني لمدة 30 دقيقة.
- إعداد تخفيف الأجسام المضادة الأولية في 1٪ BSA / PBS تستكمل مع 0.03٪ تريتون X-100. استبدال حل حجب من قبل حل الأجسام المضادة الأولية. احتضان لمدة 3 ساعات في RT، أو بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية، ثم يغسل خلايا 3X مع برنامج تلفزيوني.
- تطبيق الضد الثانوية في برنامج تلفزيوني وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. احتضان لمدة 1 ساعة عند RT، ثم يغسل خلايا 3X مع برنامج تلفزيوني.
- جبل coverslips على الشرائح الزجاجية مع وسيلة مكافحة تتلاشى لالمجهر الضوئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4، NANOG، وSOX2 هي عوامل النسخ الأساسية التي تمنح ESC تجديد الذات وتعدد القدرات. طبقنا البروتوكول أعلاه لمقارنة التمايز العصبي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية من النوع البري ومن سلالة من الفئران المعدلة وراثيا حيث SYX، الجين الترميز لعامل الصرف RhoA محددة SYX، وتعطلت. نحن لمحت SYX في الأوعية الدموية 18. لاحظنا الاختلافات في سلوك EBS مجمعة من SYX + / + وSYX - / - المجالس الاقتصادية والاجتماعية، وشرعت في اختبار إذا تمايز العصبي للSYX - / - المجالس الاقتصادية والاجتماعية هو أسرع من ذلك من هم SYX + / + نظرائهم.
المقارنة بين الحالة الأولية للSYX + / + وSYX - / - المجالس الاقتصادية والاجتماعية، ونحن كميا في كل الوراثي وفرة Oct4، NANOG، وSOX2، وعوامل النسخ الأساسية ر قبعة تضفي ESC تجديد الذات وتعدد القدرات. كما هو موضح في الخطوة 10 من البروتوكول، وimmunolabeled المجالس الاقتصادية والاجتماعية التي كتبها Oct4، Sox2، والأجسام المضادة NANOG. وكانت المجالس الاقتصادية والاجتماعية المماثلة، على النحو الذي يحدده المناعي (الشكل 2) وimmunoblotting 17 (الشكل 2) - وفرة من عوامل النسخ 3 في SYX + / + وSYX - /.
EBS مزروع في مصفوفة الكولاجين 3D (الشكل 1B) تبدأ تنبت ملحقات الخلوية التي هي واضحة على المجهر زراعة الخلايا مع الهدف 10X، 2 بعد أيام من الزرع. في يوم 6، بين 5-10 براعم من 200 ميكرون أو أقل يمكن ملاحظتها عادة في SYX + / + EBS، في حين أنه في SYX - / - كثيرا ما لوحظ EBS، 30-50 براعم، ومعظمها هي أطول من 200 ميكرون (الشكل 1C).
في الصفحة = "1"> لاحظنا أن الخلايا بمد أسرع من SYX - / - من من SYX + / + 2D EBS (الشكل 3A). لمقارنة معدل التمايز العصبي للخلايا التي امتدت من SYX + / + وSYX - / - EBS، نحن immunolabeled لهم بعد 6 أيام من ثقافة 2D من قبل العصبي الخلايا الجذعية nestin علامة، وهو بروتين تنظيمي خيوط المتوسط 19. وكانت وفرة Nestin في أعلى بكثير في الخلايا التي تمتد من SYX - / - EBS (الشكل 3B). ثم قارنا فرة من nestin وتويولين β3 (Tubβ3)، وهو بروتين الهيكل الخلوي المحاور 20، في الخلايا فصلها عن 13 يوما 2D EBS. وكانت كل من البروتينات أكثر وفرة في الخلايا فصلها عن SYX - / - EBS من في حياتهم SYX + / + نظرائهم (الشكل 3C). حصلنا على نتائج مماثلة من قبل الكمي لimmunoblotting من نفس البروتينات 17.
ويبين الشكل 4 خلايا transfected من البروتين الفلوري الأخضر جوهري (GFP) -fused نشط RhoA (RhoA-Q63L) باستخدام كاشف ترنسفكأيشن الخلايا الجذعية المستوى الأمثل (انظر المواد / المعدات الجدول).
الشكل 1: الشتلات ظهور من SYX + / + وSYX - / - EBS في الثقافة 3D. (A) SYX + / + وSYX - / - نمت المجالس الاقتصادية والاجتماعية في المستعمرات تتجمع أمام تحريض التمايز العصبي. (B و C) وصور من EBS تشكلت في شنقا قطرات مع 0.5 ميكرومتر RA، ومن ثم إدراجها في مصفوفة الكولاجين 3D دون RA، كما هو موضح في الخطوات 7،1-7،4. تم التقاط الصور في يوم 6 من الأهداف المشار إليها (مقياس ب ARS = 100 ميكرون في A و C، و 200 ميكرومتر في B). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: وجود عوامل النسخ تعدد القدرات الأساسية. صور الممثل تبين وفرة من علامات تعدد القدرات الأساسية المشار إليها في SYX + / + وSYX - / - المجالس الاقتصادية والاجتماعية (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). انظر يانغ وآخرون. 17 للاطلاع على تفاصيل طريقة immunolabeling (شريط مقياس = 50 ميكرومتر. دابي، 2- (4-amidinophenyl) -1H -indole-6-carboxamidine). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
جوري 3 "SRC =" / ملفات / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg "/>
الشكل (3): تصور العصبية التمايز علامات في خلايا EB. الصور (A) المرحلة من 2D EB حواف تظهر أن الخلايا توسعت أسرع من SYX - / - من من SYX + / + EBS (شريط مقياس = 200 ميكرون). الصور (B) المناعي تبين أن العصبية التمايز علامة nestin كان أكثر وفرة في الخلايا توسيع من 6 يوم 2D SYX - / - EBS من من هم SYX + / + نظرائهم (شريط مقياس = 50 ميكرومتر). الصور (C) المناعي تظهر أن علامات التمايز العصبية nestin وTubβ3 كانت أكثر وفرة في الخلايا فصلها عن 13 يوم 3D SYX - / - EBS من من (شريط مقياس = 50 ميكرومتر) SYX + / + نظرائهم. الرجاء الضغط هنا للتنافسوا نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: التصور كفاءة ترنسفكأيشن الكاشف. ثلاثة مكررات من الصور المناعي تظهر المجالس الاقتصادية والاجتماعية transfected التي كتبها RhoA نشط بشكل جوهري تنصهر إلى GFP لتوضيح كفاءة ترنسفكأيشن كاشف المستخدمة في الخطوة 9.5 من البروتوكول (مقياس بار = 50 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذا البروتوكول نقدم طريقة بسيطة نسبيا ويمكن الوصول إليها لدراسة التمايز العصبي من المجالس الاقتصادية والاجتماعية الفئران. في البروتوكولات السابقة، وأضيف RA إلى متوسطة في يوم 2 أو يوم 4 من EB شنقا الإفلات 8 أو ثقافة تعليق 7، على التوالي، أو مباشرة بعد EB شنقا انخفاض تجميع 21. في البروتوكول وضعت، وأضيف RA في وقت سابق. على الرغم من إدخال سابق من RA إلى EBS التي شكلتها ثقافة تعليق، أنتج هذا البروتوكول التعبير أعلى من 8 علامات التمايز العصبية.
هنا، نحن يفضل تطبيق RA ويحفز التمايز العصبي في بداية ثقافة الإفلات شنقا. هذا التعديل يسمح المساواة التعرض RA إلى المجالس الاقتصادية والاجتماعية عندما تكون لا تزال في تعليق خلية واحدة، قبل EB التجميع. عند إضافة RA إلى EBS مجمعة، من المرجح أن أستشعر أدنى إلى RA concentrati الخلايا في كتلة الداخلية EBعلى من الخلايا في الطبقة الخارجية. تطبيق RA في بداية EB التجميع هو مفيد أيضا لأنه يقمع الأديم الباطن والجرثومية أرومية متوسطة تطوير طبقة لصالح التمايز العصبي للطبقة الأدمة 7 و 8. أكدنا أن العلاج RA روجت التمايز العصبي عن طريق فحص وفرة ما يقرب من 10 علامات 17.
هناك ثلاثة اعتبارات حاسمة في هذا البروتوكول. الأول هو إزالة الحد الأقصى من الخلايا المغذية MEF لتحقيق السكان ESC عالية النقاء. والثاني هو الحساسية للضوء من RA: حل أسهمها وقطرات شنقا يجب أن تكون محمية من الضوء بعد التطبيق RA. RA حل الأسهم مستقرة فقط لمدة أسبوعين، وبعد ذلك يجب أن يكون مستعدا لحل جديد. الاعتبار الثالث هو تركيز RA. في التجارب الرائدة لدينا، وجدنا أن بتركيز 10 ميكرومتر RA نمو الخلايا المتخلفين والمؤيدduced EBS أصغر الحجم بالمقارنة مع تركيزات أقل، ربما لأن RA يمكن أن يسبب موت الخلايا المبرمج في conncentrations ارتفاع 22 و 23 و 24. لاحظنا أن تركيز RA من 0.5 ميكرومتر إنتاج عدد أكبر من EBS بشكل جيد مما كانت عليه في أي أعلى بنسبة 25 أو أقل التركيزات، وأن EBS وصل متوسط قطرها حوالي 200 ميكرون. EBS أكبر تتجاوز حجم الحقل من هدف 10X وكانت، بالتالي، من الصعب صورة. لذلك، اخترنا 0.5 ميكرومتر كما تركيز RA الأمثل.
التحليل المناعي لل3D EBS مثير للجدل لأنها هشة للغاية بالنسبة لباجتزاء المجمدة. وعلاوة على ذلك، وجدنا أن أقسام EB المجمدة لا يلتصق بشكل جيد لغير المصقول الشرائح الزجاجية المعالجة كهربية. إعداد ثقافة 2D EB يتطلب تجميع قطرات شنقا إضافية، لأن بعض EBS لا نعلق بشكل جيد لالركيزة. EB ديssociation، التي هي بطيئة نسبيا، يمكن تسريع قبل pipetting وEBS صعودا وهبوطا في أنبوب microfuge 1.5 مل أثناء الحضانة مع كولاجيناز.
Neurally المجالس الاقتصادية والاجتماعية المتباينة يمكن استخدامها لتحل محل الخلايا التالفة الذاتية، مثل الخلايا العصبية الدوبامين خسر في المادة السوداء في الدماغ من المرضى الذين يعانون من مرض باركنسون 26. في حين التقنيات الحالية للتمايز ESC البشري لا تتطلب تشكيل EB (المرجع نفسه)، EBS لا تزال أداة مفيدة لتحليل مفصل للتمايز العصبية على المستوى الجزيئي.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب تعلن أنها لا تملك المصالح المتنافسة أو المالية
Acknowledgments
وأيد هذه الدراسة من قبل منحة المعاهد الوطنية للصحة R01 HL119984 إلى AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. Fibronectin-integrin interactions. Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. Retinoids in embryonal development. Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
