Summary
Vi beskriver en teknikk for anvendelse av muse embryonale stamceller for generering av to eller tredimensjonale embryoidlegemene. Vi forklarer hvordan å indusere differensiering av nevrale embryoid kroppscellene hos retinsyre, og hvordan å analysere deres tilstand av differensiering av stamceller markør immunfluorescens og immunblotting.
Abstract
Muse embryonale stamceller (ESCS) er isolert fra den indre massen av blastocysten (typisk dag E3.5), kan bli anvendt som in vitro modellsystem for å studere tidlige embryoutvikling. I fravær av leukemi-inhiberende faktor (LIF), ESCs differensiere som standard i neurale forløperceller. De kan bli samlet inn i en tre-dimensjonal (3D) sfærisk aggregat betegnet embryoid legeme (EB) på grunn av dets likhet til tidlig stadium embryo. EBS kan podes på fibronectin-belagte dekkglass, hvor de utvider seg ved økende todimensjonale (2D) utvidelser eller implantert i 3D kollagenmatrikser hvor de fortsetter å vokse som sfæroider, og skille ut de tre kimlag: endodermal, mesodermal, og ectodermal. 3D-kollagen kulturen etterligner in vivo miljøet tettere enn 2D EBS. 2D EB kultur muliggjør analyse av immunfluorescens og immunblotting for å spore differensiering. Vi har utviklet en to-trinns nevrale differentiasjon protokoll. I det første trinn blir EBS generert av den hengende dråpe-teknikk, og, samtidig, blir indusert til å differensiere ved hjelp av eksponering for retinsyre (RA). I det andre trinnet, neural differensiering forløper i et 2D eller 3D-format i fravær av RA.
Introduction
ESCs stammer fra blastocyst indre cellemasse. Disse cellene er pluripotent, dvs. de har kapasitet til å differensiere i en celle type organisme opprinnelsesland. ESC in vitro differensiering er av bred interesse som et eksperimentelt system for å undersøke utviklingsveier og mekanismer. Det har en kraftig og fleksibel modellsystem for å teste nye terapeutiske tilnærminger for korrigering av celle og vev dysfunksjon. EBS rekapitulere mange aspekter av celledifferensiering i tidlig embryogenese. Spesielt kan EBS brukes når embryoniske letalitet gjør det vanskelig å bestemme den cellulære basis av de embryoniske defekter 1, 2. EBS kan dannes enten ved den hengende dråpe eller flytende suspensjonsteknikker 3. Fordelen med det tidligere er evnen til å generere EBS med jevn størrelse og tetthet og letter således eksperimentelle reproduserbarhet.
4.
RA er en liten lipofilt metabolitt av vitamin A som induserer differensiering neural 5, 6. Høye konsentrasjoner av RA fremme nerve genekspresjon og undertrykker mesodermal genekspresjon i løpet av EB formasjon 7, 8. RA er produsert av vitamin A-oksydasjon til retinaldehyde ved enten alkohol eller retinol-dehydrogenase, etterfulgt av retinaldehyde oksydasjon til det endelige produkt ved retinaldehyde dehydrogenase 9. Neural differensiering krever transport av RA fra cytoplasma til kjernen ved cellulære RA-bindende protein 2 (CRABP2). I kjernen, RA bindes til sin tilhørende reseptor-komplekset som består av en RAR-RXR heterodimer 10. Dette resulterer i rekruttering av transkripsjonelle ko-aktivatorer, og initiering av transkripsjon 9, 11. Videre fremmer RA nedbrytningen av fosforylert (aktiv) Smad 1, således antagonisering BMP og SMAD signale 12. I tillegg til disse aktiviteter øker RA Pax6 uttrykk, en transkripsjonsfaktor som støtter nevrale differensiering 13. RA signale moduleres av Sirtuin-1 (SIRT1), en kjernefysisk nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD +) - avhengig enzym som deacetylates CRABP2, interferere med dens translokasjon til kjernen, og følgelig med RA-binding til RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vårt mål i utformingen av RA-behandlede EB protokollen som er beskrevet her er for å optimalisere neural differensiering for å lette in vitro-analyse av de signalveier som regulerer ESC differensiering til neuronale forløperceller. En av fordelene ved denne protokollen er tilrettelegging av analyse av cellefunksjon ved immunfluorescens. 3D EBS ikke er godt gjennomtrengt av antistoffer og er vanskelige å bilde. EB dissosiering i et 2D-monolaget på bestemte tidspunkter i løpet av neural differensiering letter immunmerking og avbildning av cellene ved hjelp av konfokal mikroskopi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Culture of Mouse embryonale fibroblaster (MEFs)
- Forbered MEF medium, Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM, høy glukose), supplert med 15% føtalt bovint serum (FBS).
- Coat 100 mm cellekulturskåler med 0,5% gelatinoppløsning i 30 minutter ved romtemperatur (RT).
- Telle MEFs ved hjelp av en cytometer. Fjern gelatinoppløsningen og før den helles MEF medium forvarmet til 37 ° C. Hurtig tines hetteglass med mitomycin-C-behandlede MEFs i et 37 ° C vannbad i 2 minutter, deretter frø 2,8 x 10 6 MEFs pr 100 mm gelatin-belagt skål. Juster celle nummer tilsvarende ved bruk retter av andre størrelser. Inkuber MEFs over natten ved 37 ° C, 5% CO2.
- Endre medium på neste dag. Kultur i 2-3 dager, inntil det MEF lag er konfluent.
2. Mouse ESC Culture
- Forbered ESC medium, Iscoves modifiserte Dulbeccos medium (IMDM) supplert med 15% FBS og 103 U / mL leukemi-inhiberende faktor (LIF), 0,1 mM ikke-essensielle aminosyrer, 55 mM 2-merkaptoetanol, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 ug / ml), gentamicin (200 ug / ml), og 0,2% mycoplasma antibiotikum.
- Fjern MEF medium fra skålen fremstilt i trinn 1 og erstatte med 37 ° C forvarmet ESC medium.
- Tine et ESC ampulle og frø celler på toppen av MEF lag. Inkuber ved 37 ° C, 5% CO2, inntil ESCs når konfluens.
- Forbered nye cellekulturskåler inneholdende et konfluent monolag av MEFs. Til passasjen den ESCs, vaske en gang med PBS og løsner med 0,25% trypsin / EDTA i 2-5 minutter ved 37 ° C, 5% CO2. Stopp trypsinering ved tilsetning av friskt IMDM med 15% FBS Til slipp cellene, overføre cellesuspensjonen til et 15 ml rør, og sentrifuger ved 160 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
- Fjern supernatanten, resuspender ESCs med frisk IMDM og passasje en femtedel av cellene til hver ny MEF belagt skål; Inkuber cellene inntilnå samløpet (vanligvis 4-5 dager).
3. Trekk MEFs og kultur ESCs på gelatin-belagte plater
- Når ECSS nådde konfluens, løsne dem og MEFs med 0,25% trypsin / EDTA som i trinn 2.4, resuspender cellene i friskt IMDM, overføring til en ikke-klebende bakteriologiske petriskål, og inkuber i 40 minutter ved 37 ° C, 5% CO 2.
- Nøye overføre ESCs og MEFs-inneholdende medium til en ny gelatin-belagte plate ved anvendelse av en 5 ml pipette, unngå gjentatt pipettering. Cellene er igjen i petriskålene er MEFs, siden ESCs ikke overholder.
- Passage de ESCs hver 3-4 dager. Sjeldnere aging kan redusere ESC pluripotency. Ikke overstige 60% samløpet, da det kan favorisere differensiering.
- Gjenta trinn 3,2-3,3 tre ganger eller mer, etter behov, inntil MEFs ikke lenger påvises ved en cellekultur mikroskop, med en 20X objektiv, for å sørge for at MEFs ikke er tilstede.
- Kontroller ESC pluripotency ved å sjekke ESCkultur for å se om cellene som danner tette kolonier med typisk ESC polygonal morfologi (figur 1A). Testcelle stemness ved kvantitativ revers transkriptase-polymerase kjedereaksjon (QRT-PCR) 17, immunoblotting 17, eller immunfluorescens av kjerne pluripotency transkripsjonsfaktorene 17 (figur 2).
4. EB Dannelse
- Forbered all-trans-RA stamløsning av 10 mM i DMSO, og delmengde på 1,5 ml lyse beskyttet mikrofugerør. Oppløsningen er stabil ved -80 ° C i opptil to uker. Beskytt mot lys.
- Trypsiniser ESCs som i trinn 2.4; replate i frisk IMDM uten LIF, som en enkeltcellesuspensjon.
- Cellene telles ved bruk av et hemocytometer, og fremstille en 5 x 10 5 celler / ml suspensjon i IMDM med 0,5 uM RA.
- Plate 100 20-il-dråper per 100-mm petri skål med en 8-kanal pipette og 200 ul tips, invertrettene, og fylle den snudde lokket med PBS for å forhindre hengende dråper fra tørking. Beskytt RA-holdige dyrkningsmedier mot lys.
- Kultur EBS i hengende dråper ved 37 ° C, 5% CO2, i 4 dager.
5. 2D EB Culture
- Coat 12 mm sirkulær dekkglass med 30 pg / ml fibronectin i 30 minutter ved RT. Plasser hver dekkglass i en brønn av en 24-brønners plate, og tilsett 1 ml IMDM per brønn.
- Avling 3 dagers-dyrket hengende dråpe EBS en etter en med 200 ul pipettespisser og frø dem på fibronectinbelagt dekkglass, 20 EBS per brønn, ved å bruke de samme pipettespissene.
MERK: 3-dagers EBS er å foretrekke fremfor 4-dagers EBS fordi de holder seg bedre til Dekk. - Fortsett kultur med IMDM-15% FBS uten LIF. Erstatt medium hver 3-4 dager. Det brukte medium for proteinsekresjon analyse etter behov.
6. Deteksjon av utskilte proteiner
- Overfør 500 ul av EB medium til 10 kDa-cutoff sentrifugalfiltere, sentrifugering ved 20 000 xg i 60 min ved 4 ° C.
- Undersøk medium som sitter igjen i sentrifugalfiltere hver 15-20 min for å forhindre for høy anrikning. Stopp sentrifugering når volumet av det gjenværende mediet har falt til 25 ul.
- Samle den gjenværende konsentrerte medium etter invertering av filteret og sentrifugering ved 160 x g ved 4 ° C, ved å følge produsentens instruksjoner.
- Detektere de utskilte proteiner ved immunblotting med 17 spesifikke antistoffer.
7. 3D EB Culture
- Samle EBS dyrket i 4 dager i hengende dråper som beskrevet i trinn 5.2, og plassere dem i 1,5 ml sentrifugerør (30 EBS pr tube).
- Fremstill kollagengel oppløsningen ved å følge instruksjonene til 3D-kollagen kulturen kit (se Materialer / utstyr tabell). Fortynn hensiktsmessige volum av kollagenløsning og 5x DMEM (en kit komponent); legger -neutralization løsning (en kit komponent) og bland godt umiddelbart, og holde dette på is.
- Pipetter et passende volum av avkjølt kollagen løsning i 1,5 ml rør inneholdende den EBS, og forsiktig overføres til brønnene i en 6-brønn plate ved anvendelse av en 1 ml pipette. Unngå å lage bobler.
- Umiddelbart overføre platen til 37 ° C, 5% CO2, i 60 min for å initiere polymerisering av kollagen.
- Overlappe den EB-holdig plate med IMDM.
- Endre medium hver 3-4 dager.
8. EB Dissosiasjon
- Samle dag 4 EBS (fra trinn 4) en etter en, med 200 ul pipettespisser og overføre dem til en ikke-klebende bakteriologiske petriskål innehold IMDM med 15% FBS; kultur ved 37 ° C, 5% CO2 i 4 dager. Sjekk EBS to ganger hver dag for å sørge for at de ikke fester seg til bunnen; Rist forsiktig på fatet for å forhindre EB festing til bunnen.
- Sentrifuger EBS ved 185 xg i 5 minutter vedRT, i en bordsentrifuge.
- Fjern supernatanten. Pelleten bør ikke overskride 100 ul i hvert rør.
- Legg til pelletisert EBS 1 ml 0,25% type I-kollagenase per rør, supplert med 20% FBS i PBS.
- Inkuber EB-kollagenase blandingen i 1 time ved 37 ° C, 5% CO2, pipettere det forsiktig hvert 20 min, ved anvendelse av 1 ml pipettespissene.
- Vask cellene forsiktig 3x med PBS. Hvis celle aggregater er til stede, å bruke et cellefilter med en 100 pm sikt for å fjerne dem.
- Replate cellene på en gelatin-belagte 60 mm plater i IMDM. Deretter inkuberes ved 37 ° C, 5% CO2.
9. Transfeksjon av Spaltet EBS
- For QRT-PCR og immunblotting, belegge en 6-brønns plate med 0,5% gelatin.
- For immunfluorescens, belegge dekkglass med 30 pg / ml fibronectin i 30 minutter ved RT. Plasser hver dekkglass i en brønn av en 24-brønners plate. Legg IMDM.
- Seed 4,75 x 10 5 eller 1 x 10 5
- Dyrke cellene til 70% konfluens før transfeksjon.
- Transfektere cellene ved en nonliposomal lipid stamcelle-optimal reagens 17 (se Materialer / utstyr tabell), ved å følge produsentens instruksjoner.
MERK: reagens vi brukte vanligvis nådd en transfeksjon effektivitet på 50% (se Representant Resultater). - Analyser av prøver ved QRT-PCR eller ved immunoblotting 17 2 eller 3 dager etter transfeksjon, henholdsvis.
10. Analyse av EB Differensiering av immunfluorescens
- Vask 2D EBS eller dissosiert 3D EBS med PBS og feste med 4% paraformaldehyd i PBS i 30 minutter ved romtemperatur. Vask de fikserte cellene 3x med PBS for å fjerne flytende celleavfall.
MERK: Paraformaldehyde er en hud og øye irriterende; utvise forsiktighet ved håndtering av den. Tilsett 1% triton X-100 i PBS for å permeabilisere cellene i 20 minutter ved RT, deretter vask 3 ganger med PBS. - Fjern PBS og blokken med 5% BSA i PBS i 30 min.
- Forbered primære antistoff-fortynning i 1% BSA / PBS supplert med 0,03% Triton X-100. Erstatte den blokkerende oppløsning av det primære antistoff oppløsning. Inkuber i 3 timer ved romtemperatur, eller over natten ved 4 ° C, deretter vaskes cellene 3 ganger med PBS.
- Påfør sekundært antistoff i PBS i henhold til produsentens instruksjoner. Inkuber i 1 time ved romtemperatur, deretter vaske cellene 3x med PBS.
- Mount Dekk på objektglass med en anti-fade medium for optisk mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog, og SOX2 er kjernen transkripsjonsfaktorer som utviser ESC selvfornyelse og pluripotency. Vi anvendte den ovennevnte protokoll for å sammenligne det neurale differensiering av ESCs fra villtypen og fra en stamme av genetisk modifiserte mus hvor Syx, et gen som koder for den RhoA spesifikke utveksling faktor Syx, blir forstyrret. Vi hadde innblandet Syx i angiogenese 18. Vi la merke til forskjeller i atferd av EBS aggregeres fra Syx + / + og Syx - / - ESCs, og fortsatte å teste om det nevrale differensiering av Syx - / - ESCs er raskere enn sine Syx + / + kolleger.
For å sammenligne den opprinnelige tilstanden av Syx + / + og Syx - / - ESCs, vi kvantifisert i hver genotype de Forekomsten av Oct4, Nanog, og SOX2, kjernen transkripsjonsfaktorer tlue gi ESC selvfornyelse og pluripotency. Som beskrevet i trinn 10 i protokollen, ble ESCs immunolabeled av Oct4, Sox2, og Nanog antistoffer. De abundances av de 3 transkripsjonsfaktorer i Syx + / + og Syx - / - ESCs var lik, som bestemt ved immunfluorescens (figur 2) og immunblotting 17 (figur 2).
EBS implantert i en 3D-kollagen matriks (figur 1B) begynner å spire cellulære utvidelser som er synlige på en cellekultur mikroskop med et 10X objektiv, 2 dager etter implantasjon. På dag 6, mellom 5 til 10 spirer på 200 um eller mindre kan vanligvis observeres i Syx + / + EBS, mens det i Syx - / - EBS, 30-50 spirer observeres ofte, de fleste av hvilke er lengre enn 200 um , (figur 1C).
Syx - / - enn fra Syx + / + 2D EBS (figur 3A). For å sammenligne frekvensen av nevrale differensiering av cellene som strakte seg fra Syx + / + og Syx - / - EBS, immunolabeled vi dem etter 6 dagers 2D kultur av den neurale stamcelle markør nestin, et mellomliggende filament regulatorisk protein 19. Nestin overflod var betydelig høyere i celler som strekker seg fra Syx - / - EBS (figur 3B). Vi så sammenlignet overflod av nestin og tubulin β3 (Tubβ3), en aksonal cytoskjelettet protein 20, i cellene dissosiert fra 13-dagers 2D EBS. Begge proteiner var mer tallrike i cellene dissosiert fra Syx - / - EBS enn i sine Syx + / + motparter (figur 3C). Vi fikk lignende resultater ved kvantifisering av immunoblotte opp av de samme proteinene 17.
Figur 4 viser celler transfektert med konstitutivt grønt fluorescerende protein (GFP) -fused aktiv RhoA (RhoA-Q63L) ved hjelp av en stilk-celle-optimal transfeksjon reagens (se Materialer / utstyr tabell).
Figur 1: Sprout Emergence fra Syx + / + og Syx - / - EBS i 3D kultur. (A) Syx + / + og Syx - / - ESCs vokste i klynger kolonier før induksjon av nevrale differensiering. (B og C) bilder av EBS dannet i hengende dråper med 0,5 uM RA, og deretter satt inn i et 3D-kollagen matriks uten RA, slik som beskrevet i trinn 7,1-7,4. Bildene ble tatt på dag 6 av de angitte mål (Scale b ars = 100 mikrometer i A og C og 200 mikrometer i B). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Tilstedeværelse av pluripotency kjernetranskripsjonsfaktorer. Representative bilder som viser Forekomsten av de indikerte kjerne pluripotency markører i Syx + / + og Syx - / - ESCs (Skala = 50 pm). Se Yang et al. 17 for beskrivelse av den immunmerking metoden (Skala bar = 50 pm; DAPI, 2- (4-amidinofenyl) -1 H-indol-6-karboksamidin). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
gur 3" src = "/ files / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Figur 3: Visualisering av Neural differensieringsmarkører i EB celler. (A) Fase bilder av 2D EB kanter som viser at cellene ekspanderes raskere fra Syx - / - enn fra Syx + / + EBS (Skala bar = 200 um). (B) immunfluorescens bilder som viser at det neurale differensiering markør nestin var mer tallrike i celler utvide fra 6 dagers 2D Syx - / - EBS enn fra deres Syx + / + motstykker (Skala bar = 50 um). (C) immunfluorescens-bilder som viser at neural differensieringsmarkører nestin og Tubβ3 var mer tallrike i cellene dissosiert fra 13 dagers 3D Syx - / - EBS enn fra deres Syx + / + motstykker (Skala bar = 50 um). Klikk her for å viewa større versjon av dette tallet.
Figur 4: Visualisering av effektiviteten av Transfection Reagent. Tre replikater av immunofluorescens-bilder som viser ESCs transfektert med konstitutivt aktiv RhoA fusjonert til GFP for å illustrere transfeksjonseffektiviteten av det reagens som anvendes i trinn 9.5 i protokollen (Skala bar = 50 um). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen presenterer vi en forholdsvis enkel og tilgjengelig metode for å studere nevrale differensiering av murine ESCs. I tidligere protokoller, ble RA tilsatt til mediet på dag 2 og dag 4 av den EB hengende dråpe 8 eller ved suspensjonskultur 7, henholdsvis, eller umiddelbart etter EB hengende dråpe aggregering 21. I protokollen vi utviklet, ble RA lagt tidligere. Til tross for den tidligere innføring av RA til EBS dannet av suspensjonskultur, denne protokollen produserte høyere ekspresjon av neural differensierings 8 markører.
Her favoriserte vi søker RA og indusere nevrale differensiering ved starten av den hengende dråpe kultur. Denne modifikasjon gjør det mulig lik RA eksponering for ESCs når de fremdeles er i en enkeltcellesuspensjon, før EB aggregering. Når RA er lagt til aggregerte EBS, celler i EB indre massen er sannsynlig å avføle et lavere til RA concentratipå enn celler i det ytre laget. Anvendelse av RA ved starten av EB aggregering er fordelaktig også fordi det undertrykker endodermal og mesodermal bakterie lag utvikling i favør av nevrale differensiering av ectodermal lag 7, 8. Vi har bekreftet at RA behandling fremmet neural differensiering ved å undersøke overflod av nær 10 markører 17.
Det er tre viktige hensyn i denne protokollen. Den første er den maksimale fjerning av MEF feeder-celler for å oppnå en høy renhet ESC befolkning. Den andre er lysfølsomheten av RA: dens stamløsning og de hengende dråper må beskyttes mot lys etter RA søknad. RA stamoppløsning er stabil bare i to uker, hvoretter må fremstilles en ny oppløsning. Den tredje faktor er den RA konsentrasjon. I våre pilotforsøk, fant vi at i en konsentrasjon på 10 mM RA stående cellevekst og proproduserte mindre størrelse EBS sammenlignet med lavere konsentrasjoner, muligens fordi RA kan forårsake apoptose ved høye conncentrations 22, 23, 24. Vi har observert at en RA-konsentrasjon på 0,5 uM produsert et større antall velformede EBS enn ved enten høyere 25 eller lavere konsentrasjoner, og at den EBS nådde en gjennomsnittlig diameter på omkring 200 mikrometer. Større EBS stige feltet størrelse med en 10X objektiv og var dermed vanskeligere å bilde. Derfor, valgte vi 0,5 uM eksempel optimal RA konsentrasjon.
Analyse av immunfluorescens av 3D EBS er problematisk fordi de er for sprø for frossen snitting. Videre fant vi at frosne EB deler ikke holder godt til ubestrøket elektrostatisk behandlet glass. Fremstilling av 2D EB kultur krever aggregering av ekstra hengende dråper, fordi noen EBS ikke feste godt til underlaget. EB dissociation, som er forholdsvis langsom, kan akselereres ved å pipettere EBS opp og ned i et 1,5 ml mikrofuge-rør under inkubasjon med kollagenase.
Nevralt differensierte ESCs kan benyttes for å erstatte skadede endogene celler, f.eks dopaminerge neuroner tapt i substantia nigra i hjernen til pasienter som lider av Parkinsons sykdom 26. Mens dagens teknikk for human ESC differensiering ikke krever EB formasjon (ibid.), EBS er fortsatt et nyttig verktøy for detaljert analyse av nevral differensiering på det molekylære nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer de har ingen konkurrerende eller økonomiske interesser
Acknowledgments
Denne studien ble støttet av NIH stipend R01 HL119984 til AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
