Summary
Descriviamo una tecnica per utilizzare le cellule staminali embrionali murine per generare due o tre corpi embrionali tridimensionali. Abbiamo poi spiegato come indurre la differenziazione neuronale delle cellule del corpo embrionali di acido retinoico, e come analizzare il loro stato di differenziazione dal marcatore di cellule progenitrici immunofluorescenza e immunoblotting.
Abstract
Le cellule staminali embrionali di topo (CES) isolati dalla massa interna della blastocisti (tipicamente a giorno E3.5), può essere utilizzato come sistema modello in vitro per lo studio sviluppo embrionale precoce. In assenza di fattore inibitorio della leucemia (LIF), CES differenziano per default in cellule precursori neurali. Essi possono essere ammassati in una tridimensionale (3D) aggregato sferico definito corpo embrioide (EB) a causa della sua somiglianza con l'embrione in fase iniziale. EBs possono essere seminati su vetrini fibronectina rivestite, dove si espandono coltivando due estensioni (2D) dimensionali, o impiantati in matrici di collagene 3D dove continuano a crescere come sferoidi, e si differenziano in tre strati germinali: endodermica, mesoderma e ectodermica. La cultura collagene 3D simula l'ambiente in vivo più da vicino di EBS 2D. La cultura 2D EB facilita l'analisi per immunofluorescenza e immunoblotting per monitorare differenziazione. Abbiamo sviluppato una differenziazione neuronale in due fasiprotocollo zione. Nella prima fase, EBs sono generati dalla sospensione tecnica-drop, e, contemporaneamente, vengono indotte a differenziarsi da esposizione all'acido retinoico (RA). Nella seconda fase, neurali procede differenziazione in formato 2D o 3D in assenza di RA.
Introduction
CES provengono dalla massa cellulare interna della blastocisti. Queste cellule sono pluripotenti, cioè hanno la capacità di differenziarsi in qualsiasi tipo di cellula dell'organismo di origine. ESC differenziazione in vitro è di grande interesse, come un sistema sperimentale per studiare percorsi e meccanismi di sviluppo. Offre un potente e flessibile sistema modello per la sperimentazione di nuovi approcci terapeutici per la correzione della disfunzione delle cellule e dei tessuti. EBs ricapitolano molti aspetti della differenziazione cellulare durante l'embriogenesi precoce. In particolare, EBs possono essere utilizzati quando letalità embrionale rende difficile determinare la base cellulare dei difetti embrionali 1, 2. EBs possono essere formate mediante la goccia sospesa o tecniche sospensione liquida 3. Il vantaggio del primo è la capacità di generare EBS di dimensioni e densità costante, facilitando così la riproducibilità sperimentale.
4.
RA è una piccola metabolita della vitamina A lipofilo che induce neurale differenziazione 5, 6. Elevate concentrazioni di RA promuovere genica neurale e reprime l'espressione genica mesoderma durante la formazione EB 7, 8. RA è prodotto da vitamina A ossidazione retinaldehyde da uno o alcol deidrogenasi retinolo, seguita da ossidazione retinaldehyde al prodotto finale retinaldehyde deidrogenasi 9. differenziazione neurale richiede il trasporto di RA dal citoplasma al nucleo da cellule RA-binding protein 2 (CRABP2). Nel nucleo, RA si lega al suo recettore affine costituito da un eterodimero RAR-RXR 10. Ciò si traduce nel reclutamento di co-attivatori trascrizionali, e l'inizio della trascrizione 9, 11. Inoltre, RA promuove la degradazione di fosforilato (attivo) SMAD1, contrapponendosi così BMP e SMAD segnalazione 12. Oltre a queste attività, RA aumenta l'espressione di Pax6, un fattore di trascrizione che supporta neurale differenziazione 13. Segnalazione RA è modulata da sirtuin-1 (Sirt1), un dinucleotide adenina nicotinammide nucleare (NAD +) - enzima dipendente che deacetylates CRABP2, interferendo con la sua traslocazione al nucleo, e quindi con RA legame al eterodimero RAR-RXR 14, 15, 16.
e_content "> Il nostro obiettivo nella progettazione del protocollo EB RA-trattati qui descritto è quello di ottimizzare la differenziazione neuronale al fine di facilitare l'analisi in vitro delle vie di segnalazione che regolano la differenziazione ESC in cellule precursori neuronali. Uno dei vantaggi di questo protocollo è facilitazione l'analisi della funzione delle cellule mediante immunofluorescenza. 3D EBs non sono ben penetrato da anticorpi e sono difficilmente immagine. EB dissociazione in un monostrato 2D in punti temporali specifici durante la differenziazione neuronale facilita immunomarcatura e l'imaging delle cellule mediante microscopia confocale.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Cultura di fibroblasti embrionali di topo (MEF)
- Preparare mezzo MEF, mezzo di Dulbecco modificato da Eagle (DMEM, high-glucosio), supplementato con siero fetale bovino 15% (FBS).
- Cappotto 100 mm piatti di coltura di cellule con soluzione di gelatina allo 0,5% per 30 min a temperatura ambiente (RT).
- Conte MEF usando un citometro. Rimuovere la soluzione di gelatina e versare immediatamente medio MEF pre-riscaldato a 37 ° C. Scongelare rapidamente fiale di mitomicina C MEF trattata in un bagno d'acqua a 37 ° C per 2 minuti, quindi seminare 2,8 x 10 6 MEF per ogni 100 mm piatto di gelatina rivestita. Regolare il numero di cellule di conseguenza se utilizza piatti di altre dimensioni. Incubare MEF notte a 37 ° C, 5% CO 2.
- Cambiare il medio il giorno successivo. Cultura per 2-3 giorni fino a quando lo strato MEF è confluente.
2. topo Cultura ESC
- Preparare mezzo ESC, modificata mezzo di Dulbecco Iscove (IMDM) supplementato con 15% FBS e 103 U / mL fattore leucemia inibitorio (LIF), 0,1 mM acidi non essenziali amino, 55 mM 2-mercaptoetanolo, penicillina (100 U / ml), streptomicina (100 ug / mL), gentamicina (200 ug / mL), e 0,2% micoplasma antibiotico.
- Rimuovere mezzo MEF dal piatto preparato nel passaggio 1 e sostituirla con 37 ° C media ESC pre-riscaldato.
- Scongelare una fiala ESC e alveoli sulla sommità dello strato MEF. Incubare a 37 ° C, 5% di CO 2, fino a raggiungere la confluenza CES.
- Preparare nuovi piatti di coltura di cellule contenenti un monostrato confluente di MEF. Per il passaggio CES, lavare una volta con PBS e staccare con 0,25% tripsina / EDTA per 2-5 minuti a 37 ° C, 5% CO 2. Interrompere la tripsinizzazione aggiungendo IMDM fresco con 15% FBS alle cellule distacco, trasferire la sospensione cellulare in una provetta da 15 ml e centrifugare a 160 xg per 5 minuti a temperatura ambiente.
- Rimuovere il surnatante, risospendere CES con IMDM fresco e un quinto passaggio delle cellule ad ogni nuovo piatto MEF rivestite; incubare fino celluleraggiungere la confluenza (tipicamente 4-5 giorni).
3. Prelevare MEF e CES coltura su piastre rivestiti di gelatina
- Una volta ECSS raggiunto confluenza, loro e MEF staccare con 0,25% tripsina / EDTA come al punto 2.4, risospendere le cellule in IMDM fresco, trasferire ad un batteriologico Petri non adesivo e incubare per 40 min a 37 ° C, 5% CO 2.
- trasferire accuratamente CES e MEF contenente mezzo di una nuova piastra di gelatina rivestita con una pipetta ml 5, evitando ripetuto pipettaggio. Le cellule rimanenti nelle piastre di Petri sono MEF, poiché CES non aderiscono.
- Passage i CES ogni 3-4 giorni. Meno passaging frequente può ridurre ESC pluripotenza. Non superare il 60% di confluenza, in quanto può favorire la differenziazione.
- Ripetere i passi 3.2-3.3 tre volte o più, come richiesto, fino MEF non sono più visibili con un microscopio coltura cellulare, utilizzando un obiettivo 20X, per assicurarsi MEF non sono presenti.
- Verificare ESC pluripotenza controllando ESCcultura per vedere se le cellule formano colonie dense tipica morfologia poligonale ESC (Figura 1A). Stemness cella di prova mediante reazione quantitativa inversa a catena della polimerasi transcriptasi (qRT-PCR) 17, 17 immunoblotting, o immunofluorescenza di trascrizione nucleo pluripotency Fattori 17 (Figura 2).
4. Formazione EB
- Preparare tutto-trans-RA soluzione madre a 10 mM in DMSO, e aliquote in provette da 1,5 microcentrifuga luce protetto mL. La soluzione è stabile a -80 ° C per un massimo di due settimane. Proteggere dalla luce.
- Trypsinize CES come nel passaggio 2,4; replate in IMDM fresco senza LIF, come cella singola sospensione.
- Contare le cellule utilizzando un emocitometro e preparare un 5 x 10 5 cellule / ml sospensione in IMDM con 0,5 uM RA.
- Piastra 100 di 20 microlitri-gocce per 100 mm di Petri con una pipetta a 8 canali e 200 microlitri suggerimenti, invertitoi piatti, e riempiono il coperchio invertita con PBS per evitare cadute appeso da essiccazione. Proteggere terreni di coltura RA contenenti dalla luce.
- Cultura EBS appeso scende a 37 ° C, 5% di CO 2, per 4 giorni.
5. 2D Cultura EB
- Cappotto 12 mm vetrini circolare con 30 ug / ml di fibronectina per 30 minuti a RT. Luogo ogni vetrino in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti, e aggiungere 1 ml IMDM per pozzetto.
- Harvest 3 giorni-grown appeso EB goccia uno ad uno con 200 microlitri punte per pipette e semi sui vetrini fibronectina rivestite, 20 EBs per pozzetto, usando gli stessi puntali delle pipette.
NOTA: 3 giorni EB sono preferibili over EBs 4 giorni perché aderiscono meglio alle lamelle. - Continuare con la cultura IMDM-15% FBS senza LIF. Sostituire media ogni 3-4 giorni. Raccogliere il mezzo utilizzato per l'analisi secrezione della proteina come necessario.
6. Rilevazione di secreto proteine
- Trasferire 500 ml di EB Medium a 10 filtri centrifughi kDa-cutoff, centrifugare a 20.000 xg per 60 min a 4 ° C.
- Esaminare il mezzo rimanente all'interno dei filtri centrifughi ogni 15-20 minuti per evitare eccessivo arricchimento. Interrompere centrifugazione quando il volume del mezzo rimanente è scesa a 25 microlitri.
- Raccogliere il mezzo concentrato rimanente dopo l'inversione del filtro e centrifugazione a 160 xg a 4 ° C, seguendo le istruzioni del produttore.
- Rilevare le proteine secrete da immunoblotting con anticorpi specifici 17.
7. 3D Cultura EB
- Raccogliere EBS coltivate per 4 giorni in appeso gocce come descritto al punto 5.2, e metterli in provette da 1,5 ml per centrifuga (30 EBS per provetta).
- Preparare la soluzione gel di collagene seguendo le istruzioni del kit cultura collagene 3D (vedi Materiali / attrezzature Table). Diluire volumi appropriati di soluzione di collagene e 5x DMEM (un componente del kit); aggiungere il nsoluzione eutralization (un componente del kit) e mescolare bene immediatamente, e mantenere questo sul ghiaccio.
- Pipettare un volume appropriato di soluzione di collagene raffreddata nella provetta ml 1,5, contenente l'EBS, e trasferire delicatamente per i pozzetti di una piastra a 6 pozzetti utilizzando un 1 mL punta della pipetta. Evitare di fare bolle.
- Trasferire immediatamente la piastra a 37 ° C, 5% di CO 2, per 60 minuti per iniziare la polimerizzazione del collagene.
- Sovrapporre la piastra EB contenente IMDM con.
- Cambiare media ogni 3-4 giorni.
8. EB Dissociazione
- Raccogliere il giorno 4 EBS (passaggio 4) una ad una, con 200 microlitri punte delle pipette e trasferirli ad un non adesivo batteriologico capsula di Petri contenenti IMDM con il 15% FBS; coltura a 37 ° C, 5% CO 2 per altri 4 giorni. Controllare l'EBs due volte al giorno per assicurarsi che essi non attribuiscono al fondo; agitare delicatamente piatto per evitare attaccamento EB al fondo.
- Centrifugare EBS a 185 xg per 5 minuti aRT, in una centrifuga da banco.
- Rimuovere il surnatante. Il pellet non deve superare i 100 microlitri in ciascun tubo.
- Aggiungere al pellettato EB 1 mL tipo 0,25% I collagenasi per provetta, supplementato con 20% FBS in PBS.
- Incubare la miscela EB-collagenasi per 1 ora a 37 ° C, 5% di CO 2, pipettando delicatamente ogni 20 min, usando 1 ml di puntali delle pipette.
- Lavare le cellule delicatamente 3x con PBS. Se aggregati di cellule sono presenti, utilizzare un filtro cella con una maglia di 100 micron per rimuoverli.
- Replate le cellule su una gelatina rivestita piatti 60 mm in IMDM. Incubare a 37 ° C, 5% CO 2.
9. La trasfezione di dissociato EBs
- Per qRT-PCR e immunoblotting, cappotto una piastra da 6 pozzetti con 0,5% di gelatina.
- Per immunofluorescenza, vetrini cappotto con 30 ug / ml di fibronectina per 30 minuti a RT. Luogo ogni vetrino in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere IMDM.
- Seme di 4,75 x 10 5 o 1 x 10 5
- Crescere le cellule al 70% di confluenza prima della trasfezione.
- Trasfezione delle cellule da un nonliposomal lipidi reagente di cellule staminali-ottimale 17 (vedi Materiali / attrezzature Table), seguendo le istruzioni del produttore.
NOTA: Il reagente abbiamo usato tipicamente raggiunge un'efficienza di trasfezione del 50% (vedi Rappresentante dei risultati). - Analizzare i campioni mediante qRT-PCR o mediante immunoblotting 17 2 o 3 giorni dopo la trasfezione, rispettivamente.
Analisi 10. EB Differenziazione in immunofluorescenza
- Lavare 2D EBs o dissociato EBs 3D con PBS e fissare con 4% paraformaldeide in PBS per 30 minuti a temperatura ambiente. Lavare le cellule fissate 3x con PBS per rimuovere i detriti cellulari galleggiante.
NOTA: Paraformaldeide è una pelle e irritante per gli occhi; usare cautela nel maneggiarlo. Aggiungere 1% Triton X-100 in PBS per permeabilize le cellule per 20 minuti a RT, poi lavare 3x con PBS. - Rimuovere PBS e bloccare con 5% BSA in PBS per 30 min.
- Preparare diluizione anticorpo primario in 1% BSA / PBS integrato con 0,03% Triton X-100. Sostituire la soluzione bloccante dalla soluzione anticorpo primario. Incubare per 3 ore a temperatura ambiente, o per una notte a 4 ° C, poi lavare le cellule 3X con PBS.
- Applicare anticorpo secondario in PBS in base alle istruzioni del produttore. Incubare per 1 ora a RT, poi lavare le cellule 3x con PBS.
- Monte coprioggetto su vetrini con un mezzo anti-sbiadimento per la microscopia ottica.
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Representative Results
Oct4, Nanog, e SOX2 sono i fattori di trascrizione fondamentali che conferiscono ESC auto-rinnovamento e pluripotenza. Abbiamo applicato il protocollo di cui sopra per confrontare la differenziazione neuronale dei CES da wild type e da un ceppo di topi geneticamente modificati in cui Syx, un gene che codifica per il fattore di scambio RhoA-specifica Syx, è interrotta. Avevamo implicati Syx nell'angiogenesi 18. Abbiamo notato differenze nei comportamenti dei EBs aggregate da Syx + / + e Syx - / - CES, e ha proceduto a verificare se la differenziazione neuronale di Syx - / - CES è più veloce di quella dei loro + / + controparti SYX.
Per confrontare lo stato iniziale di Syx + / + e Syx - / - CES, ci quantificati in ogni genotipo abbondanza di Oct4, Nanog, e SOX2, i fattori di trascrizione nucleo tcappello conferire ESC auto-rinnovamento e pluripotenza. Come descritto nel passaggio 10 del protocollo, CSE stati immunolabeled da Oct4, Sox2 e Nanog anticorpi. L'abbondanza dei fattori di trascrizione a 3 Syx + / + e Syx - / - CES erano simili, come determinato mediante immunofluorescenza (Figura 2) e immunoblotting 17 (Figura 2).
EBs impiantati in una matrice di collagene 3D (Figura 1B) iniziano germinazione estensioni cellulari che sono visibili su un microscopio coltura cellulare con un obiettivo 10X, 2 giorni dopo l'impianto. Il giorno 6, da 5 a 10 germogli di 200 um o meno può essere normalmente osservati in Syx + / + EBS, mentre in Syx - / - EBS, 30-50 germogli sono frequentemente osservati, la maggioranza dei quali sono più di 200 um , (Figura 1C).
Syx - / - che da Syx + / + 2D EBS (Figura 3A). Per confrontare il tasso di differenziazione neuronale delle cellule che si estendevano dal Syx + / + e Syx - / - EBS, noi li immunolabeled dopo 6 giorni di coltura 2D dal marcatore nestina neurale delle cellule staminali, un filamento intermedio proteina regolatrice 19. Abbondanza di Nestin è sostanzialmente maggiore nelle cellule estendono da Syx - / - EBS (Figura 3B). Abbiamo quindi confrontato l'abbondanza di nestina e tubulina β3 (Tubβ3), una proteina del citoscheletro assonale 20, nelle cellule dissociate da 13 giorni 2D EBS. Entrambe le proteine sono più abbondanti in cellule dissociate da Syx - / - EBS che nei loro + / + omologhi Syx (Figura 3C). Abbiamo ottenuto risultati simili quantificazione immunoblotting delle stesse proteine 17.
La figura 4 mostra cellule trasfettate da proteina fluorescente costitutivamente verde (GFP) -fused RhoA attiva (RhoA-Q63L) usando un reagente di trasfezione di cellule staminali-ottimale (vedi Materiali / Apparecchiatura Tabella).
Figura 1: Germoglio Emersione da Syx + / + e Syx - / - EBS nella cultura 3D. (A) Syx + / + e Syx - / - CES sono cresciute in colonie cluster prima della induzione della differenziazione neuronale. (B e C) immagini di EBS formate in appeso gocce con 0,5 uM RA, e poi inseriti in una matrice di collagene 3D senza RA, come descritto ai punti 7.1-7.4. Le immagini sono state catturate il giorno 6 dagli obiettivi indicati (Scala B ars = 100 um A e C, 200 micron di B). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 2: La presenza di fattori di trascrizione pluripotenza core. Immagini rappresentative che mostrano l'abbondanza dei marcatori pluripotenza fondamentali indicati Syx + / + e Syx - / - CES (bar scala = 50 pm). Vedere Yang et al. 17 per dettagli del metodo immunomarcatura (Barra di scala = 50 pm; DAPI, 2- (4-amidinophenyl) -1H-indolo-6-carboxamidine). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 3: Visualizzazione del neurali differenziazione marcatori in cellule EB. Immagini (A) Fase di 2D EB bordi mostrando che le cellule espanse velocemente da Syx - / - che da Syx + / + EBS (bar scala = 200 um). Immagini (B) immunofluorescenza che dimostrano che l'neurale marcatore differenziazione nestin era più abbondante nelle cellule in espansione da 6 giorni 2D Syx - / - EBS che da loro + / + controparti Syx (Barra di scala = 50 micron). Immagini (C) immunofluorescenza che dimostri che i marcatori di differenziazione neurale nestina e Tubβ3 erano più abbondante nelle cellule dissociate dal 13 giorno 3D SYX - / - EBs che da loro (Barra di scala = 50 micron) Syx + / + controparti. Si prega di cliccare qui per viewa più grande versione di questa figura.
Figura 4: Visualizzazione della efficienza della trasfezione reagente. Tre repliche di immagini immunofluorescenza mostrano CES trasfettate da RhoA costitutivamente attivo fuse per GFP per illustrare l'efficienza di transfezione del reagente usato nella fase 9.5 del protocollo (scala bar = 50 pm). Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
In questo protocollo vi presentiamo un metodo relativamente semplice e accessibile per studiare la differenziazione neuronale dei CES murini. In precedenti protocolli, RA è stato aggiunto al mezzo al giorno 2 o 4 giorni della EB hanging-goccia 8 o coltura in sospensione 7, rispettivamente, o immediatamente dopo l'EB appeso aggregazione goccia 21. Nel protocollo abbiamo ideato, RA è stato aggiunto in precedenza. Nonostante l'introduzione anticipata di RA EB formata da coltura in sospensione, questo protocollo prodotta alta espressione di marcatori di differenziazione neurale 8.
Qui, abbiamo favorito l'applicazione di RA e indurre la differenziazione neuronale all'inizio della cultura goccia impiccagione. Questa modifica permette l'esposizione RA pari al CES quando sono ancora in una sospensione di cellule singole, prima EB aggregazione. Quando RA è aggiunto EB aggregati, le cellule della massa interna EB sono suscettibili di rilevare una inferiore per RA Concentratisu di cellule nello strato esterno. Applicazione del RA all'inizio di EB aggregazione è vantaggiosa anche perché sopprime endodermal e mesodermal germe sviluppo strato a favore di differenziamento neurale dello strato ectodermica 7, 8. Abbiamo confermato che il trattamento con RA provocato differenziazione neuronale esaminando l'abbondanza di vicino a 10 marcatori 17.
Ci sono tre considerazioni critiche in questo protocollo. Il primo è massima rimozione delle cellule feeder MEF per ottenere una popolazione ESC elevata purezza. La seconda è la sensibilità alla luce di RA: la sua soluzione di riserva e le gocce sospese devono essere protetti dalla luce dopo l'applicazione RA. soluzione madre RA è stabile solo per due settimane, dopo di che una soluzione fresca deve essere preparato. La terza considerazione è la concentrazione RA. Nei nostri esperimenti pilota, abbiamo scoperto che ad una concentrazione di RA crescita cellulare ritardata 10 micron e proprovocati dal EBs piccole dimensioni rispetto alle concentrazioni più basse, forse perché RA possono causare apoptosi alle alte conncentrations 22, 23, 24. Abbiamo osservato che una concentrazione di 0,5 pM RA prodotto un numero maggiore di EBs ben formate rispetto alle due superiori 25 o inferiori concentrazioni, e che l'EBS ha raggiunto un diametro medio di circa 200 um. EBs grandi superano la dimensione di campo di un obiettivo 10X e sono, di conseguenza, difficile da immagine. Pertanto, abbiamo scelto 0,5 uM come concentrazione ottimale RA.
Analisi per immunofluorescenza del 3D EB è problematico perché sono troppo fragili per il sezionamento congelato. Inoltre, abbiamo scoperto che le sezioni EB congelati non aderiscono bene ai vetrini elettrostaticamente-trattati non rivestiti. Preparazione della cultura 2D EB richiede l'aggregazione delle gocce appesi in più, perché alcuni EBs non attribuiscono bene al substrato. EB dissociazione, che è relativamente lento, può essere accelerata pipettando EBS su e giù in una provetta da microcentrifuga da 1,5 durante la loro incubazione con collagenasi.
Neurally CES differenziate possono essere utilizzati per sostituire le cellule danneggiate endogene, ad esempio i neuroni dopaminergici persi nella substantia nigra nel cervello di pazienti affetti da malattia di Parkinson 26. Mentre attuali tecniche di differenziazione ESC umane non richiedono formazione EB (ibid.), EBs sono ancora uno strumento utile per l'analisi dettagliata del differenziamento neurale a livello molecolare.
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Disclosures
Gli autori dichiarano di non avere interessi in competizione o finanziari
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto da NIH concedere R01 HL119984 AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
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