Summary
Vi beskriver en teknik för användning av murina embryonala stamceller för generering av två eller tre dimensionella embryoidkroppar. Vi förklarar sedan hur man framkalla neural differentiering av embryoida kroppens celler av retinoinsyra och hur man analyserar deras tillstånd av differentiering av stamceller markör immunofluorescens och immunoblotting.
Abstract
Mus embryonala stamceller (ESC) som isolerats från den inre massan av blastocysten (typiskt vid dag E3.5), kan användas som in vitro-modellsystem för att studera tidig embryonal utveckling. I frånvaro av leukemihämmande faktor (LIF), ESC differentierar som standard till neurala prekursorceller. De kan samlat till en tredimensionell (3D) sfäriska aggregat benämnda embryoid kropp (EB) på grund av dess likhet med det tidiga stadiet embryot. EBs kan ympas på fibronektinbelagda täckglas, där de expanderar genom att odla två dimensionella (2D) förlängningar, eller implanteras i 3D kollagenmatriser där de fortsätter att växa som sfäroider, och differentierar till de tre groddblad: endodermala, mesodermala och ektodermalt. 3D collagen kulturen härmar in vivo miljö närmare än 2D EBS. 2D EB kulturen underlättar analys genom immunofluorescens och immunoblotting att spåra differentiering. Vi har utvecklat en tvåstegs neural differentieringtion-protokollet. I det första steget, är EBs genereras av hängdropp- teknik, och, samtidigt, induceras att differentiera genom exponering för retinsyra (RA). I det andra steget, neurala differentieringsfortskrider i en 2D- eller 3D-format i frånvaro av RA.
Introduction
ESCs härrör från blastocysten inre cellmassan. Dessa celler är pluripotenta, dvs de har förmågan att differentieras till alla celltyper hos organismen ursprungsland. ESC in vitro differentiering är av stort intresse som ett experimentellt system för att utreda utvecklingsvägar och mekanismer. Det erbjuder en potent och flexibel modell för att testa nya terapeutiska metoder för korrigering av cell- och vävnads dysfunktion. EB rekapitulera många aspekter av celldifferentiering under tidig embryogenes. I synnerhet, kan EBs användas när embryonal dödlighet gör det svårt att bestämma den cellulära basen av de embryonala defekter 1, 2. EBs kan bildas antingen av den hängande droppen eller vätskesuspensionstekniker 3. Fördelen av den förra är förmågan att generera EBs av konsekvent storlek och densitet, vilket underlättar experimentell reproducerbarhet.
4.
RA är en liten lipofil metabolit av vitamin A som inducerar neural differentiering 5, 6. Höga koncentrationer av RA främja neural genexpression och undertrycker mesodermala genuttryck under EB formation 7, 8. RA är producerad av vitamin A oxidation till retinaldehyd genom antingen alkohol eller retinol dehydrogenas, följt av retinaldehyd oxidation till den slutliga produkten genom retinaldehyd dehydrogenas 9. Neural differentiering kräver transport av RA från cytoplasman till kärnan genom cellulär RA-bindande protein 2 (CRABP2). I kärnan, binder RA till dess besläktade receptor komplex bestående av en RAR-RXR heterodimer 10. Detta resulterar i rekrytering av transkriptionella co-aktivatorer, och initieringen av transkription 9, 11. Vidare RA befrämjar nedbrytningen av fosforylerade (aktiva) Smad1, således antagonisera BMP och SMAD signalering 12. Förutom dessa aktiviteter ökar RA Pax6 uttryck, en transkriptionsfaktor som stöder neural differentiering 13. RA-signalering moduleras av sirtuin-1 (SIRT1), en nukleär nikotinamidadenindinukleotid (NAD +) - beroende enzym som deacetylates CRABP2, interferera med dess translokation till kärnan, och således med RA bindning till RAR-RXR heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Vårt mål i utformningen av RA-behandlade EB protokoll som beskrivs här är att optimera neural differentiering för att underlätta in vitro-analys av de signalvägar som reglerar ESC differentiering till neuronala prekursorceller. En av fördelarna med detta protokoll är underlättande av analys av cellfunktionen genom immunofluorescens. 3D EBs är inte väl penetrerad av antikroppar och är svåra att bilden. EB dissociation till en 2D monoskikt vid specifika tidpunkter under neural differentiering underlättar immunomärkning och avbildning av cellerna genom konfokalmikroskopi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur av Mus Embryonala fibroblaster (MEF)
- Förbereda MEF-medium, Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM, hög-glukos), kompletterat med 15% fetalt bovint serum (FBS).
- Coat 100 mm cellodlingsskålar med 0,5% gelatinlösning under 30 min vid rumstemperatur (RT).
- Räkna MEFs med användning av en cytometer. Avlägsna gelatinlösning och omedelbart häll MEF-medium förvärmas till 37 ° C. Snabbt tina ampuller med mitomycin C-behandlade MEFs i ett 37 ° C vattenbad under 2 minuter, därefter ympa 2,8 x 10 6 MEFs per 100 mm gelatin-belagda skålen. Justera mobilnummer i enlighet med om du använder rätter av andra storlekar. Inkubera MEF över natten vid 37 ° C, 5% CO2.
- Ändra mediet på nästa dag. Kultur för 2-3 dagar tills MEF lagret är sammanflytande.
2. Mus ESC Kultur
- Förbereda ESC-medium, Iscoves modifierade Dulbeccos medium (IMDM) utökat med 15% FBS och 103 U / ml leukemihämmande faktor (LIF), 0,1 mM icke-essentiella aminosyror, 55 mM 2-merkaptoetanol, penicillin (100 U / ml), streptomycin (100 | ig / ml), gentamicin (200 | ig / ml), och 0,2% mykoplasma antibiotikum.
- Ta bort MEF medium från skålen som framställts i steg 1 och ersätta med 37 ° C förvärmt ESC-medium.
- Tina ett ESC ampull och fröceller ovanpå MEF skiktet. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, tills ESCs når konfluens.
- Förbered nya cellodlingsskålar innehållande ett sammanflytande monolager av MEF. Till passagen ESC, tvätta en gång med PBS och lossa med 0,25% trypsin / EDTA under 2-5 minuter vid 37 ° C, 5% CO2. Stoppa trypsinisering genom tillsats av färskt IMDM med 15% FBS för att borttagnings cellerna, överför cellsuspensionen till ett 15 ml rör, och centrifugera vid 160 xg under 5 min vid RT.
- Avlägsna supernatanten, återsuspendera ESCs med färsk IMDM och passage en femtedel av cellerna till varje ny MEF-belagda skålen; inkubera tills cellernanår sammanflödet (vanligtvis 4-5 dagar).
3. Dra MEF och kultur ESC på gelatinbelagda plattor
- Gång ECSS nådde konfluens, lösgöra dem och MEFs med 0,25% Trypsin / EDTA som i steg 2,4, resuspendera cellerna i färskt IMDM, överföring till ett icke-adhesivt bakteriologisk petriskål, och inkubera i 40 min vid 37 ° C, 5% CO 2.
- Noggrant överföra ESCs och MEF-innehållande medium i ett annat gelatintäckt platta med användning av en 5 ml pipett, undvika upprepad pipettering. Cellerna kvar i petriskålar är MEF, eftersom ekonomiska och sociala råden inte fastnar.
- Passage de ekonomiska och sociala råd var 3-4 dagar. Mindre frekvent passager kan minska ESC pluripotens. Inte överstiger 60% sammanflödet, eftersom det kan gynna differentiering.
- Upprepa steg 3,2-3,3 tre gånger eller mer, efter behov, tills MEF inte längre upptäckas av en cellkultur mikroskop, med hjälp av en 20X mål att se till att MEF inte är närvarande.
- Verifiera ESC pluripotens genom att kontrollera ESCkulturen för att se om cellerna bildar täta kolonier med typisk ESC polygonal morfologi (Figur 1A). Testcell stemness genom kvantitativ RT-PCR (QRT-PCR) 17, immunblotting 17, eller immunfluorescens av kärn pluripotens transkriptionsfaktorer 17 (figur 2).
4. EB Bildning
- Förbereda all-trans-RA förrådslösning vid 10 mM i DMSO, och alikvot i 1,5 ml ljusskyddade mikrofugrör. Lösningen är stabil vid -80 ° C under upp till två veckor. Skydda mot ljus.
- Trypsinize ESCs som i steg 2,4; förnyad utbredning i färskt IMDM utan LIF, som en enkelcellsuspension.
- Räkna celler med användning av en hemocytometer, och förbereda en 5 x 10 5 celler / ml suspension i IMDM med 0,5 ^ M RA.
- Plattan 100 20-pl-droppar per 100-mm petri skål med en 8-kanals pipett och 200 mikroliter tips, invertdisken, och fylla den inverterade locket med PBS för att förhindra hängande droppar från torkning. Skydda RA innehållande odlingsmedier från ljus.
- Kultur EBs i hängande droppar vid 37 ° C, 5% CO2, under 4 dagar.
5. 2D EB Kultur
- Coat 12 mm cirkulärt täckglas med 30 | ig / ml fibronektin för 30 min vid RT. Placera varje täckglas i en brunn i en 24-brunnars platta, och tillsätt 1 ml IMDM per brunn.
- Skörd tre dygn odlade hängande droppe EBs en efter en med 200 mikroliter pipettspetsar och utsäde dem på fibronektinbelagda täckglas, 20 EBs per brunn, med användning av samma pipettspetsar.
OBS: 3-dagars EB är att föredra framför fyra dagars EB eftersom de fästa bättre till täck. - Fortsätt kultur med IMDM-15% FBS utan LIF. Byt medium var 3-4 dagar. Samla upp mediet för proteinutsöndring analys efter behov.
6. Detektion av utsöndrade proteiner
- Överföra 500 mikroliter av EB medium till 10 kDa-cutoff centrifugalfilter, centrifugera vid 20 tusen xg under 60 min vid 4 ° C.
- Undersök kvar inuti centrifugalfilter varje 15-20 min att förhindra överdriven anrikning medium. Stoppa centrifugering när volymen av den kvarvarande mediet har sjunkit till 25 mikroliter.
- Uppsamling av resterande koncentrerade mediet efter invertering filtret och spinning vid 160 xg vid 4 ° C, enligt tillverkarens instruktioner.
- Detektera de utsöndrade proteiner genom immunoblotting med specifika antikroppar 17.
7. 3D EB Kultur
- Samla EBs odlas under 4 dagar i hängande droppar såsom beskrivs i steg 5,2, och placera dem i 1,5 ml centrifugrör (30 EBS per rör).
- Förbereda kollagengel lösning efter instruktionerna från 3D kollagenodlingssats (se Material / Utrustning tabell). Späd lämpliga volymer av kollagenlösning och 5x DMEM (ett kit komponent); tillsätt neutralization lösning (ett kit komponent) och blanda väl omedelbart, och hålla detta på is.
- Pipettera en lämplig volym av kyld kollagenlösningen in i 1,5 ml rör innehållande EBs och försiktigt över till brunnarna i en 6-brunnars platta med användning av en 1 ml pipettspets. Undvik att bubblor.
- Omedelbart överföra plattan till 37 ° C, 5% CO2, under 60 minuter för att initiera kollagen polymerisation.
- Överlagra EB innehållande plattan med IMDM.
- Ändra medel var 3-4 dagar.
8. EB Dissociation
- Samla dagen 4 EB (från steg 4) en efter en, med 200 mikroliter pipettspetsar och överföra dem till en icke-adhesiv bakteriologisk petriskål innehållande IMDM med 15% FBS; odling vid 37 ° C, 5% CO2 under ytterligare 4 dagar. Kontrollera EBS två gånger varje dag för att se till att de inte fäster till botten; försiktigt skaka skålen för att förhindra EB fastsättning till botten.
- Centrifugera EBs vid 185 xg under 5 min vidRT, i en bordscentrifug.
- Ta supernatanterna. Pelleten bör inte överstiga 100 mikroliter i varje rör.
- Lägg till pellete EBs 1 ml 0,25% typ I-kollagenas per rör, som kompletterats med 20% FBS i PBS.
- Inkubera EB-kollagenas blandningen under 1 h vid 37 ° C, 5% CO 2, pipettera den försiktigt varje 20 min, med användning av 1 ml pipettspetsar.
- Tvätta cellerna försiktigt 3x med PBS. Om cellaggregat är närvarande, använder en cell sil med en 100-um mesh för att ta bort dem.
- Förnyad utbredning av cellerna på en gelatinbelagda 60 mm skålar i IMDM. Sedan inkubera vid 37 ° C, 5% CO2.
9. Transfektion av dissocierade EBs
- För QRT-PCR och immunoblotting, belägga en 6-brunnsplatta med 0,5% gelatin.
- För immunofluorescens, belägga glastäckglas med 30 | ig / ml fibronektin för 30 min vid RT. Placera varje täckglas i en brunn i en 24-brunnsplatta. Lägg IMDM.
- Utsäde 4,75 x 10 5 eller ett x 10 5
- Odla cellerna till 70% sammanflödet före transfektion.
- Transfektera cellerna genom en icke-liposomala lipid stamcellsoptimala reagens 17 (se Material / Utrustning tabell), enligt tillverkarens instruktioner.
OBS: Reagenset vi använde nått typiskt en transfektionseffektivitet av 50% (se Representativa resultat). - Analysera proverna med QRT-PCR eller genom immunoblotting 17 2 eller 3 dagar efter transfektion, respektive.
10. Analys av EB Differentiering på Immunofluorescens
- Tvätt 2D EBs eller dissocierade 3D EBs med PBS och fäst med 4% paraformaldehyd i PBS under 30 min vid RT. Tvätta de fixerade cellerna 3x med PBS för att avlägsna flytande cellrester.
OBS: Paraformaldehyd är en hud och ögonirritation; försiktig när du hanterar den. Lägg 1% triton X-100 i PBS för att permeabilisera cellerna för 20 minuter vid RT, sedan tvätta 3x med PBS. - Ta bort PBS och blockera med 5% BSA i PBS under 30 min.
- Förbereda primära antikroppen spädning i 1% BSA / PBS kompletterad med 0,03% Triton X-100. Ersätta den blockerande lösningen av den primära antikroppslösningen. Inkubera under 3 h vid RT, eller över natten vid 4 ° C, tvätta sedan cellerna 3x med PBS.
- Applicera sekundär antikropp i PBS enligt tillverkarens instruktioner. Inkubera under 1 h vid RT, sedan tvätta cellerna 3x med PBS.
- Mount täckglas på objektglas med en anti-fade medium för optisk mikroskopi.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Oct4, Nanog och SOX2 är kärntranskriptionsfaktorer som ger ESC självförnyelse och pluripotens. Vi tillämpade ovanstående protokoll för att jämföra den neurala differentieringen av ESCs från vildtyp och från en stam av genetiskt modifierade möss där Syx, en gen som kodar för det RhoA specifika utbyte faktor Syx, störs. Vi hade inblandad Syx i angiogenes 18. Vi märkte skillnader i beteenden EBS aggregerade från Syx + / + och Syx - / - ekonomiska och sociala råd, och fortsatte att testa om det neurala differentieringen av Syx - / - ekonomiska och sociala råden är snabbare än deras Syx + / + motsvarigheter.
Att jämföra det initiala tillståndet för Syx + / + och Syx - / - ESCs, vi kvantifieras i varje genotyp bestånd av Oct4, Nanog, och SOX2, kärntranskriptionsfaktorer thatt ger ESC självförnyelse och pluripotens. Såsom beskrivs i steg 10 i protokollet, var ESCs immunolabeled av Oct4, Sox2, och Nanog antikroppar. Bestånd av de 3 transkriptionsfaktorer i Syx + / + och Syx - / - ESCs var liknande, vilket bestäms genom immunofluorescens (fig 2) och immunoblotting 17 (figur 2).
EBs implanterade i en 3D kollagenmatrisen (Figur 1B) börjar groning cellulära förlängningar som är synliga på en cellodlings mikroskop med en 10X objektiv, 2 dagar efter implantation. På dag 6, mellan 5 till 10 groddar av 200 pm eller mindre kan normalt observeras i Syx + / + EBs, medan i Syx - / - EBS, 30-50 groddar observeras ofta, av vilka de flesta är längre än 200 | j, m , (Figur 1C).
Syx - / - än från Syx + / + 2D EBs (figur 3A). Att jämföra graden av neural differentiering av cellerna som sträckte sig från Syx + / + och Syx - / - EBs, immunolabeled vi dem efter 6 dagars 2D odling genom den neurala stamcellmarkören nestin, ett intermediärt filament reglerande protein 19. Nestin överflöd var väsentligt högre i celler som sträcker sig från Syx - / - EBs (figur 3B). Vi jämförde sedan överflödet av nestin och tubulin β3 (Tubβ3), en axonal cytoskelett-protein 20, i celler dissocierade från 13-dagars 2D EBs. Båda proteinerna var mer rikligt förekommande i celler dissocierade från Syx - / - EBs än i deras Syx + / + motsvarigheter (figur 3C). Vi fick liknande resultat genom kvantifiering av immunoblomma av samma proteiner 17.
Figur 4 visas celler som transfekterats genom konstitutivt grönt fluorescerande protein (GFP) -fusionerad aktiv RhoA (RhoA-Q63L) med användning av en stamcellsoptimala transfektionsreagens (se Material / Utrustning tabell).
Figur 1: Sprout Uppkomsten från Syx + / + och Syx - / - EBS i 3D kultur. (A) Syx + / + och Syx - / - ESCs växte i klustrade kolonier före induktionen av neural differentiering. (B och C) bilder av EBs bildade i hängande droppar med 0,5 ^ M RA, och insattes sedan i en 3D kollagenmatrisen utan RA, såsom beskrivits i steg 7.1-7.4. Bilder fångades på dag sex av de angivna målen (Scale B ars = 100 | im i A och C, 200 | j, m i B). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förekomst av Pluripotens Kärntranskriptionsfaktorer. Representativa bilder som visar bestånd av de angivna kärn pluripotens markörer i Syx + / + och Syx - / - ESC (Scale bar = 50 | im). Se Yang et al. 17 för detaljer av immunomärkning metoden (Scale bar = 50 ^ m; DAPI, 2- (4-amidinofenyl) -1 H-indol-6-karboxamidin). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
gur 3" src = "/ filer / ftp_upload / 55.621 / 55621fig3.jpg" />
Figur 3: Visualisering av neurala differentieringsmarkörer i EB Cells. (A) Fas bilder av 2D EB kanter som visar att celler expanderade snabbare från Syx - / - än från Syx + / + EBs (Scale bar = 200 | j, m). (B) Immunofluorescens bilder som visar att det neurala differentieringsmarkör nestin var mer rikligt förekommande i celler som expanderar från 6 dag 2D Syx - / - EBs än från sina Syx + / + motsvarigheter (Scale bar = 50 ^ m). (C) Immunofluorescens bilder som visar att de neurala differentieringsmarkörer nestin och Tubβ3 var mer rikligt förekommande i celler dissocierade från 13 dag 3D Syx - / - EBs än från deras Syx + / + motsvarigheter (Scale bar = 50 ^ m). Klicka här för att tävlawa större version av denna figur.
Figur 4: Visualisering av effektiviteten av den Transfektion Reagent. Tre replikat av immunfluorescensbilder som visar ESCs transfekterade genom konstitutivt aktiv RhoA fuserade till GFP för att illustrera transfektionseffektiviteten av reagenset som används i steg 9,5 i protokollet (Scale bar = 50 ^ m). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I detta protokoll presenterar vi ett relativt enkelt och tillgänglig metod för att studera neural differentiering av murina ESCs. I tidigare protokoll, till RA till mediet vid dag 2 eller dag 4 av EB hängdropp- 8 eller genom suspensionsodling 7, respektive, eller omedelbart efter EB hängande droppe aggregering 21. I protokollet vi fram var RA lagt tidigare. Trots den tidigare införandet av RA till EBS bildas av suspensionskultur, producerade detta protokoll högre uttryck av neurala differentieringsmarkörer 8.
Här har vi föredrog att tillämpa RA och framkalla neural differentiering i början av droppe kulturen. Denna modifiering tillåter lika RA exponering för ekonomiska och sociala råd när de fortfarande är i en enda cell fjädring, före EB aggregering. När RA tillsätts till aggregerade EBs, celler i EB inre massan kommer sannolikt att avkänna en lägre till RA concentratipå än celler i det yttre skiktet. Applikation av RA i början av EB aggregation är fördelaktig också för att det undertrycker endodermalt och mesodermalt GRODDBLAD utveckling till förmån för neural differentiering av ektodermalt skiktet 7, 8. Vi bekräftade att RA behandling främjas neural differentiering genom att undersöka överflödet av nära 10 markörer 17.
Det finns tre viktiga överväganden i detta protokoll. Den första är maximalt avlägsnande av de MEF matarceller för att uppnå en hög renhet ESC befolkningen. Den andra är den ljuskänsligheten av RA: dess stamlösning och de hängande dropparna måste skyddas från ljus efter RA applicering. RA stamlösning är stabil endast under två veckor, varefter en färsk lösning måste framställas. Den tredje övervägande är RA-koncentration. I våra pilotförsök, fann vi att vid en koncentration av 10 ^ M RA efterbliven celltillväxt och prosparperioder mindre storlek EBs jämfört med lägre koncentrationer, möjligen eftersom RA kan orsaka apoptos vid höga conncentrations 22, 23, 24. Vi observerat att en RA-koncentration av 0,5 ^ M producerade ett större antal välformade EBs än vid antingen högre 25 eller lägre koncentrationer, och att EBs nått en genomsnittlig diameter av omkring 200 um. Större EB överskrider området storleken på en 10X objektiv och var därmed svårare att bilden. Därför valde vi 0,5 pM som optimal RA-koncentration.
Analys genom immunofluorescens 3D EBS är problematisk eftersom de är för sköra för fryst sektionering. Dessutom fann vi att frysta EB sektionerna inte fastnar väl obelagda elektro-behandlade objektglas. Beredning av 2D EB kultur kräver aggregering av extra hängande droppar, eftersom vissa EBS inte fäster väl till underlaget. EB dissociation, vilken är relativt långsam, kan påskyndas genom att pipettera EBs upp och ner i en 1,5 ml mikrofugrör under deras inkubation med kollagenas.
Neuralt differentierade ekonomiska och sociala råd kan användas för att ersätta skadade kroppsegna celler, t.ex. dopaminerga nervceller förlorade i substantia nigra i hjärnan hos patienter som lider av Parkinsons sjukdom 26. Medan nuvarande tekniker av human ESC differentiering inte kräver EB formation (ibid.), EBs är fortfarande ett användbart verktyg för detaljerad analys av neural differentiering på molekylär nivå.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande eller ekonomiska intressen
Acknowledgments
Denna studie stöddes av NIH bidrag R01 HL119984 till AH
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers. Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).
- Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L.
- Blumberg, B. An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation. Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).
- Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M.
- Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture. Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).
- Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells. Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).
- Duester, G. Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis. Cell. 134 (6), 921-931 (2008).
- Niederreither, K., Dolle, P. Retinoic acid in development: towards an integrated view. Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).
- Maden, M. Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system. Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).
- Sheng, N., et al. Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).
- Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells. Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).
- Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid. J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).
- Sessler, R. J., Noy, N. A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II. Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).
- Tang, S., et al. SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation. Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).
- Yang, J., et al. RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms. Sci Signal. 9 (438), ra76 (2016).
- Garnaas, M. K., et al. Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo. Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).
- Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis. Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).
- Arai, T., Matsumoto, G. Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes. J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).
- Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space. Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).
- Liu, Y., et al. Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells. Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).
- Altucci, L., et al. Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL. Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).
- Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax. Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).
- Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. 3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages. Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).
- Cai, J., et al. BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells. Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).
