Summary
Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.
Abstract
Embryonale Stammzellen der Maus (WSR) von der Innenmasse der Blastozyste isoliert ( in der Regel am Tag E3.5) können für die Untersuchung der frühe Embryonalentwicklung als in - vitro - Modellsystem verwendet werden. In Abwesenheit von Leukämie-Hemmfaktor (LIF), unterscheidet WSR standardmäßig in neuralen Vorläuferzellen. Sie können in einer dreidimensionalen (3D) angehäuft werden, um sphärische Aggregat bezeichnet Embryoidkörperbildung (EB) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem frühen Stadium Embryo. EBs auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser ausgesät werden, wo sie von wachsenden zweidimensionale (2D) Erweiterungen oder implantiert in 3D-Kollagen-Matrices erweitern, wo sie als Sphäroiden weiter wachsen und differenzieren sich in die drei Keimblätter: endodermisches, mesodermalen und ektodermalen. Die 3D - Kollagen Kultur ahmt die in - vivo - Umgebung näher als der 2D - EBs. Die 2D-EB Kultur erleichtert Analyse von Immunfluoreszenz und Immunoblotting Differenzierung zu verfolgen. Wir haben einen zweistufigen neuronalen Differenzierung entwickeltmunikationsprotokoll. Im ersten Schritt wird EBs durch die Hanging-Drop-Technik erzeugt werden, und, gleichzeitig, induziert durch Exposition gegenüber Retinsäure (RA) zu differenzieren. Im zweiten Schritt, neuronalen Differenzierung erfolgt in einem 2D- oder 3D-Format in Abwesenheit von RA.
Introduction
WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embryonalen Defekte 1, 2 zu bestimmen. EBs können 3 durch den hängenden Tropfen oder flüssigen Suspensionstechniken gebildet entweder werden. Der Vorteil des ersteren ist die Fähigkeit, EBs konsistenter Größe und Dichte zu erzeugen, so dass experimentelle Reproduzierbarkeit zu erleichtern.
4.
RA ist ein kleines lipophiles Metabolit von Vitamin A , das 5 neurale Differenzierung induziert, 6. Hohe Konzentrationen von RA Förderung neuronaler Genexpression reprimiert und mesodermalen Genexpression während der EB Bildung 7, 8. RA wird durch Vitamin - A - Oxidation Retinaldehyd entweder durch Alkohol oder Retinol - Dehydrogenase, gefolgt von Retinaldehyd Oxidation zum Endprodukt durch Retinaldehyd dehydrogenase 9 hergestellt. Neuronale Differenzierung erfordert Transport von RA aus dem Cytoplasma an den Kern durch zelluläre RA-bindendes Protein 2 (CRABP2). Im Kern bindet RA an seinen zugehörigen Rezeptor - Komplex , bestehend aus einem RAR-RXR - Heterodimer 10. Dies führt bei der Rekrutierung von Transkriptions Co-Aktivator, und der Initiation der Transkription 9, 11. Darüber hinaus fördert die RA den Abbau von phosphoryliertem (aktiv) SMAD1, wodurch BMP und SMAD Antagonisierung 12 signalisiert. Zusätzlich zu diesen Aktivitäten erhöht RA Pax6 - Expression, einen Transkriptionsfaktor, 13 neuralen Differenzierung unterstützt. RA - Signalisierung moduliert durch sirtuin-1 (Sirt1), ein Kern Nicotinamidadenindinucleotid (NAD +) - abhängiges Enzym , die CRABP2 deacetyliert, mit seiner Translokation in den Zellkern zu stören, und damit mit RA der Bindung an den RAR-RXR - Heterodimer 14, 15, 16.
e_content "> Unser Ziel der RA-behandelten EB - Protokoll bei der Gestaltung hier beschriebene neuronale Differenzierung zu optimieren , um in - vitro - Analyse der Signalwege zu erleichtern , die ESC Differenzierung in Zellen neuronalen Vorläufer regulieren. Einer der Vorteile dieses Protokolls ist die Erleichterung der die Analyse der Zellfunktion durch Immunofluoreszenz. 3D EBs ist gut nicht durch Antikörper durchdrungen und ist schwer zu Bild. EB Dissoziation in einen 2D-Monolayer zu bestimmten Zeitpunkt während der neuronalen Differenzierung und Immunomarkierung Bildgebung der Zellen durch konfokale Mikroskopie ermöglicht.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)
- Bereiten MEF Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, high-glucose), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS).
- Coat 100 mm Zellkulturschalen mit 0,5% Gelatine-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Graf MEFs mit einem Durchflusszytometer. Entfernen der Gelatinelösung und sofort gießen MEF Medium vorgewärmt auf 37 ° C. Schnell auftauen Phiolen von Mitomycin C-behandeln MEFs in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min, dann 2,8 x 10 6 pro 100 mm MEFs gelatinebeschichteten dish Samens. Passen Sie die Zellzahl entsprechend, wenn Gerichte anderer Größen verwendet. Inkubieren MEFs über Nacht bei 37 ° C, 5% CO 2.
- Ändern Sie das Medium am nächsten Tag. Kultur für 2-3 Tage, bis die MEF Schicht konfluent.
2. Maus ESC Kultur
- Bereiten ESC Medium, Iscove modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM) mit 15% FBS und 103 U / ml Leukemia Inhibitory Factor (LIF), 0,1 mM nicht - essentielle Aminosäuren, 55 mM 2-Mercaptoethanol, Penicillin (100 U / ml), Streptomycin (100 ug / ml), Gentamicin (200 ug / ml) und 0,2% Mykoplasmen-Antibiotikum.
- Entfernen MEF Medium aus der in Schritt hergestellten Schale 1 und ersetzen mit 37 ° C vorgewärmtes Medium ESC.
- Abzutauen einen ESC Phiole und Samenzellen auf der Oberseite der Schicht MEF. Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2, bis WSR Konfluenz erreichen.
- Bereiten Sie neue Zellkulturschalen eine konfluente Monoschicht von MEFs enthält. In den Durchgang wäscht die WSR, einmal mit PBS und nimmt mit 0,25% Trypsin / EDTA für 2-5 min bei 37 ° C, 5% CO 2. Stoppen die Trypsinierung durch Zugabe von frischem IMDM mit 15% FBS zu den Zellen abgenommen, überträgt die Zellsuspension in ein 15 ml-Röhrchen und Zentrifugieren bei 160 xg für 5 min bei RT.
- Entfernen Sie den Überstand, resuspendiere WSR mit frischem IMDM und der Durchgang ein Fünftel der Zellen zu jedem neuen MEF-beschichtete Schale; brüten, bis die Zellenerreichen Einmündung (in der Regel 4-5 Tage).
3. Ziehen Sie MEFs und Kultur WSR auf Gelatine-beschichteten Platten
- Sobald ECS Konfluenz erreicht, lösen sie und MEFs mit 0,25% Trypsin / EDTA, wie in Schritt 2.4, um die Zellen in frischen IMDM resuspendieren, Übertragung auf ein nicht haftenden bakteriologischen Petrischale gegeben und bei 37 ° C für 40 min inkubieren, 5% CO 2.
- Sorgfältig übertragen WSR und MEFs enthaltenden Medium zu einer neuen Gelatine beschichteten Platte, die eine 5 ml-Pipette, wiederholtes Pipettieren zu vermeiden. Die Zellen in den Petrischalen verbleiben, sind MEFs, da WSR nicht haften.
- Passage der WSR alle 3-4 Tage. Seltener Passagierung kann ESC Pluripotenz reduzieren. Nicht mehr als 60% Konfluenz überschreiten, da es die Differenzierung begünstigen kann.
- Wiederholen Sie die Schritte 3,2-3,3 dreimal oder mehr, je nach Bedarf, bis MEFs nicht mehr nachweisbar ist von einer Zellkulturmikroskop, ein 20x-Objektiv verwendet wird, sicher MEFs zu machen, ist nicht vorhanden.
- Überprüfen Sie ESC Pluripotenz von ESC ÜberprüfungKultur zu sehen , ob die Zellen dichte Kolonien mit typischer ESC polygonaler Morphologie (Abbildung 1A) bilden. Prüfzelle stemness durch quantitative reverse Transkriptase - Polymerase - Kettenreaktion (qRT-PCR) 17, 17 Immunoblotting oder Immunofluoreszenz von Kern Pluripotenz Transkriptionsfaktoren 17 (Abbildung 2).
4. EB Bildung
- Bereiten all-trans-RA-Stammlösung auf 10 mM in DMSO und 1,5 ml Aliquot in lichtgeschützte Microfuge-Röhrchen. Die Lösung ist stabil bei -80 ° C für bis zu zwei Wochen. Schützen Sie es vor Licht.
- Trypsinisieren WSR wie in Schritt 2.4; Ausstrich in frischem IMDM ohne LIF als Einzelzellsuspension.
- Zählen von Zellen unter Verwendung eines Hämozytometers und bereiten eine 5 x 10 5 Zellen / ml - Suspension in IMDM mit 0,5 & mgr; M RA.
- Platte 100 von 20 & mgr; l-Tropfen pro 100-mm-Petrischale mit einer 8-Kanal-Pipette und 200 & mgr; L Spitzen, InvertzuckersirupDie Schalen und den invertierten Deckel mit PBS füllen hängende Tropfen vor dem Austrocknen zu verhindern. Schützen RA haltigen Kulturmedien von Licht.
- Kultur EBs in hängenden Tropfen bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Tage.
5. 2D EB Kultur
- Mantel 12 mm runde Glasdeckgläser mit 30 ug / ml Fibronektin für 30 min bei RT. Platzieren jedes Deckglas in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte und 1 mL IMDM pro Vertiefung.
- Ernte 3 Tage gewachsenen Tropfen hängen ein EBs durch eine mit 200 ul Pipettenspitzen und Samen sie auf den Fibronektin-beschichtete Deckgläser, 20 EBs pro Vertiefung, die gleichen Pipettenspitzen.
HINWEIS: 3-Tage-EBs bevorzugt über 4-Tage-EBs, weil sie auf die Deckgläser besser haften. - Weiter Kultur mit IMDM-15% FBS ohne LIF. Ersetzen Sie das Medium alle 3-4 Tage. Sammeln Sie das verwendete Medium zur Analyse Proteinsekretion nach Bedarf.
6. Nachweis von sekretierten Proteinen
- Übertragen Sie 500 ul von EB medimgr; m bis 10 kDa-Cutoff-Zentrifugalfilter, Schleudern bei 20.000 xg für 60 min bei 4 ° C.
- Untersuchen Sie das Medium in den zentrifugalen Filter verbleibenden alle 15-20 min übermäßige Anreicherung zu verhindern. Stoppen Zentrifugation, wenn das Volumen des restlichen Mediums auf 25 & mgr; l abgesunken ist.
- Sammeln Sie die verbleibenden konzentrierten Medium nach dem Filter Invertieren und bei 160 × g bei 4 ° C dreht, nach den Anweisungen des Herstellers.
- Erkennt die sekretierten Proteine , die durch 17 mit spezifischen Antikörpern Immunoblotting.
7. 3D EB Kultur
- Sammelt die EBs für 4 Tage gezüchtet in hängenden Tropfen, wie in Schritt 5.2 beschrieben ist, und sie in 1,5 ml-Zentrifugenröhrchen (30 EBs pro Röhrchen).
- Bereiten Sie Kollagen - Gel - Lösung nach den Anweisungen der 3D - Kollagen Kultur - Kit (siehe Materialien / Ausrüstung Tabelle). Verdünnte geeignete Volumina von Kollagenlösung und 5x DMEM (Kit-Komponente); fügen Sie die neutralization Lösung (ein Kit-Komponente) und auch sofort mischen, und halten Sie diese auf dem Eis.
- Pipettieren ein geeignetes Volumen an gekühlter Kollagenlösung in die 1,5 ml-Röhrchen, die EBs enthalten, und überträgt sanft in den Vertiefungen einer Platte mit 6 Vertiefungen einer 1 ml-Pipettenspitze verwendet wird. Vermeiden Sie Blasen.
- Sofort übertragen , die Platte auf 37 ° C, 5% CO 2, für 60 min an Kollagen Polymerisation zu initiieren.
- Overlay die EB-enthaltenden Platte mit IMDM.
- Ändern Sie das Medium alle 3-4 Tage.
8. EB Dissociation
- Sammle den Tag 4 EBs (aus Schritt 4) einer nach dem anderen, mit 200 & mgr; l-Pipettenspitzen und sie auf einem nicht haftenden bakteriologische Petrischale mit IMDM mit 15% FBS; Kultur bei 37 ° C, 5% CO 2 für 4 Tage. Überprüfen Sie die EBs zweimal täglich, um sicherzustellen, dass sie nicht auf den Boden befestigen; sachte schütteln die Schale EB Befestigung am Boden zu verhindern.
- Zentrifugieren Sie die EBs bei 185 × g für 5 min beiRT in einer Tischzentrifuge.
- Entfernen Sie die Überstände. Das Pellet sollte nicht mehr als 100 & mgr; l in jedem Röhrchen.
- Hinzufügen EBs 1 ml 0,25% Typ pelletisiert I pro Röhrchen Kollagenase, ergänzt mit 20% FBS in PBS.
- Inkubiere den EB-Kollagenase Gemisch 1 h bei 37 ° C, 5% CO 2, Pipettieren es alle 20 min unter Verwendung von 1 ml - Pipettenspitzen sanft.
- Waschen Sie die Zellen vorsichtig 3x mit PBS. Wenn Zellaggregate vorhanden sind, verwendet einen Zellsieb mit einem 100-um-Sieb, sie zu entfernen.
- Ausstrich die Zellen auf einer Gelatine-beschichtete 60-mm-Schalen in IMDM. Dann Inkubieren bei 37 ° C, 5% CO 2.
9. Transfektion von Dissociated EBs
- Für qRT-PCR und Immunoblotting fällt eine 6-Well-Platte mit 0,5% Gelatine.
- Für Immunofluoreszenz mantel Deckgläser mit 30 ug / ml Fibronektin für 30 min bei RT. Legen Sie jedes Deckglas in einer Vertiefung einer 24-Well-Platte. In IMDM.
- Seed 4,75 x 10 5 oder 1 x 10 & sup5 ;
- Wachsen die Zellen auf 70% Konfluenz vor der Transfektion.
- Transfizieren der Zellen mit einem nicht - liposomalen Lipid - Stammzell-optimal Reagenz 17 (siehe Materialien / Ausrüstung Table), die Anweisungen des Herstellers folgend.
HINWEIS: Die Reagenz wir verwenden typischerweise eine Transfektionseffizienz von 50% erreicht (siehe Repräsentative Ergebnisse). - Analyse der Proben durch qRT-PCR oder von 17 2 oder 3 Tage nach der Transfektion Immunoblotting, respectively.
10. Analyse von EB Differenzierung durch Immunofluoreszenz
- Wash 2D EBs oder distanzierter 3D EBs mit PBS und fixiert mit 4% Paraformaldehyd in PBS für 30 min bei RT. Waschen Sie die fixierten Zellen mit PBS 3x entfernen Zelldebris schwimmt.
HINWEIS: Paraformaldehyd ist eine Haut und Augen reizend; Seien Sie vorsichtig beim Umgang. 1% Triton X-100 in PBS, die Zellen für 20 Minuten bei RT durchdringbar zu machen, dann waschen 3x mit PBS. - Entfernen PBS und Blockieren mit 5% BSA in PBS für 30 min.
- Bereiten primäre Antikörperverdünnung in 1% BSA / PBS, ergänzt mit 0,03% Triton X-100. Ersetzen der Blockierungslösung durch die primäre Antikörperlösung. Inkubieren für 3 h bei RT oder über Nacht bei 4 ° C, dann waschen die Zellen mit PBS 3x.
- Bewerben sekundären Antikörper in PBS nach den Anweisungen des Herstellers. Inkubation für 1 h bei RT, dann waschen Sie die Zellen mit PBS 3x.
- Berg Deckgläser auf Objektträgern aus Glas mit einem Anti-faden Medium für die optische Mikroskopie.
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Representative Results
Oct4, Nanog und SOX2 sind die Kerntranskriptionsfaktoren, die ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wir wandten das obige Protokoll , um die neuronale Differenzierung von WSR vom Wildtyp und aus einem Stamm von genetisch veränderten Mäusen , wo Syx, ein Gen , kodierend für das RhoA spezifische exchange factor Syx, gestört zu vergleichen. Wir hatten Syx in 18 Angiogenese beteiligt. Wir bemerkten Unterschiede im Verhalten von EBs von Syx aggregiert + / + und Syx - / - WSR, und fuhr fort , zu testen , ob die neuronale Differenzierung von Syx - / - WSR schneller als die ihrer Syx + / + Kollegen ist.
Um den Anfangszustand Syx zu vergleichen + / + und Syx - / - WSR wir in jeder der Häufigkeiten von Oct4 Genotyp quantifiziert, Nanog und SOX2, die Kerntranskriptionsfaktoren tHut ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wie 10 des Protokolls in Schritt beschrieben ist, wurde von WSR Oct4, Sox2 und Nanog Antikörper immunmarkiert. Die Häufigkeiten der 3 - Transkriptionsfaktoren in Syx + / + und Syx - / - WSR waren ähnlich, wie durch Immunofluoreszenz (Figur 2) bestimmt und Immunoblotting 17 (Abbildung 2).
EBs in einer 3D - Kollagen - Matrix implantiert (Figur 1B) beginnt zelluläre Erweiterungen keimt , die auf einem Zellkultur - Mikroskop mit einem 10X - Objektiv sichtbar sind, 2 Tage nach der Implantation. Am Tag 6, zwischen 5 bis 10 Sprossen von 200 & mgr; m oder weniger kann in der Regel in Syx + / + EBs beobachtet werden, wohingegen in Syx - / - EBs werden 30-50 Sprossen häufig beobachtet, die meisten davon sind länger als 200 & mgr; m , (1C).
Syx verlängert Zellen - / - als von Syx + / + 2D EBs (3A). Um die Geschwindigkeit der neuronalen Differenzierung der Zellen zu vergleichen , die von der Syx + / + und Syx verlängert - / - EBs wir immunomarkiert sie nach 6 Tagen der Kultur durch die 2D - Nestin neuralen Stammzellmarker, ein Intermediärfilament regulatorisches Protein 19. Nestin Überfluss war wesentlich höher in Zellen , die aus Syx verlauf - / - EBs (3B). Wir verglichen dann die Fülle von Nestin und Tubulin - β3 (Tubβ3), ein axonalen Zytoskeletts Protein 20, von 13-Tage - 2D EBs dissoziierten Zellen. Beide Proteine wurden in reichlicher Zellen dissoziiert von Syx - / - EBs als in ihrer Syx + / + Pendants (3C). Wir erhielten ähnliche Ergebnisse durch Quantifizierung von immunoblotting der gleichen Proteine 17.
4 zeigt Zellen durch konstitutiv grün fluoreszierendes Protein transfiziert (GFP) -kondensierte aktive RhoA (RhoA-Q63L) unter Verwendung eines Stammzell-optimal Transfektionsreagenz (siehe Materialien / Ausrüstung Tabelle).
Abbildung 1: Sprout Entstehung von Syx + / + und Syx - / - EBS in 3D - Kultur. (A) Syx + / + und Syx - / - WSR wuchs in gruppierten Kolonien vor der Induktion der neuronalen Differenzierung. (B und C) Bilder von EBs gebildet in Tropfen mit 0,5 & mgr; M RA hängt, und dann in eine 3D - Kollagen - Matrix ohne RA eingesetzt, wie 7,1-7,4 in Schritten beschrieben. Die Bilder wurden am Tag gefangen 6 durch die angegebenen Ziele (Skala b ars = 100 & mgr; m in A und C, 200 um in B). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2: Anwesenheit von Pluripotenz Kerntranskriptionsfaktoren. Repräsentative Bilder , welche die Häufigkeiten des angegebenen Kern Pluripotenz Markers in Syx + / + und Syx zeigen - / - WSR (Maßstabsbalken = 50 um). Siehe Yang et al. 17 für Details der Immunmarkierung Methode (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m; DAPI, 2- (4-amidinophenyl) -1H-indol-6-carboxamidin). Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3" src = "/ files / ftp_upload / 55621 / 55621fig3.jpg" />
Abbildung 3: Visualisierung von Neural Differenzierungsmarker in EB - Zellen. (A) Phasenbilder von 2D - EB Kanten zeigen , dass expandierten Zellen aus Syx schneller - / - als aus Syx + / + EBs (Maßstabsbalken = 200 & mgr; m). (B) Immunofluorescence Bilder zeigen , dass der neuronale Differenzierung Marker Nestin in Zellen reichlich vorhanden war aus 6 Tagen 2D Syx expandierende - / - EBs als von ihrem Syx + / + Pendants (Maßstabsbalken = 50 um). (C) Immunofluorescence Bilder zeigen , dass die neuronalen Differenzierungsmarker Nestin und Tubβ3 reichlicher vorhanden waren dissoziiert in Zellen , die aus 13 Tagen 3D Syx - / - EBs als von ihren Syx + / + Pendants (Maßstabsbalken = 50 um). Bitte klicken Sie hier , um die viewa größere Version dieser Figur.
Abbildung 4: Darstellung der Effizienz der Transfection Reagent. Drei Replikate von Immunofluoreszenz Bilder WSR transfiziert von konstitutiv aktiven RhoA fusioniert an GFP zu veranschaulichen, die Transfektionseffizienz des verwendeten Reagenz in Schritt 9.5 des Protokolls (Maßstabsbalken = 50 & mgr; m) zeigt. Bitte klicken Sie hier , um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
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Discussion
In diesem Protokoll stellen wir eine relativ einfache und zugängliche Methode neuronale Differenzierung von murinen WSR zu studieren. In vorangegangenen Protokollen wurde RA auf das Medium am Tag 2 oder Tag hinzugefügt 4 des EB hängenden Tropfen 8 oder durch Suspensionskultur bzw. 7, oder unmittelbar nach der Tropfenaggregation EB 21 hängt. In dem Protokoll wir erdacht wurde RA früher gegeben. Trotz der früheren Einführung von RA zu EBs durch Suspensionskultur gebildet wird , erzeugt dieses Protokoll eine höhere Expression von neuronalen Differenzierungsmarker 8.
Hier stellen wir bevorzugt RA Anwendung und neuronale Differenzierung zu Beginn der hängenden Tropfens Kultur zu induzieren. Diese Änderung ermöglicht es gleich RA Exposition gegenüber dem WSR, wenn sie noch in einer einzigen Zellsuspension werden vor dem EB-Aggregation. Wenn RA zu aggregierten EBs hinzugefügt wird, Zellen in der EB innere Masse geeignet sind, einen niedrigeren RA concentrati zu spürenauf als die Zellen in der äußeren Schicht. Die Anwendung von RA zu Beginn der EB - Aggregation ist vorteilhaft , auch weil es endodermisches und mesodermalen Keimschicht Entwicklung zugunsten der neuronalen Differenzierung der Schicht ektodermalen unterdrückt 7, 8. Wir haben bestätigt , dass die RA - Behandlung neuronaler Differenzierung durch die Untersuchung der Fülle der Nähe von 10 Markern 17 gefördert.
Es gibt drei kritische Überlegungen in diesem Protokoll. Die erste ist die maximale Entfernung der MEF-Feeder-Zellen eine hohe Reinheit ESC Bevölkerung zu erreichen. Die zweite ist die Lichtempfindlichkeit von RA: seine Stammlösung und die hängenden Tropfen müssen von Licht nach RA Anwendung geschützt werden. RA-Stammlösung ist stabil nur zwei Wochen, wonach eine frische Lösung hergestellt werden muss. Die dritte Überlegung ist die RA-Konzentration. In unseren Pilotversuchen fanden wir, dass bei einer Konzentration von 10 & mgr; M RA verzögert das Zellwachstum und Produced kleinerer EBs im Vergleich zu niedrigeren Konzentrationen, möglicherweise weil RA kann Apoptose bei hohen conncentrations 22, 23, 24 verursachen. Wir haben beobachtet , dass eine RA - Konzentration von 0,5 & mgr; M erzeugt eine größere Anzahl von wohlgeformten EBs als bei entweder höheren oder niedrigeren Konzentrationen 25, und dass die EBs erreichte einen durchschnittlichen Durchmesser von etwa 200 um. Größere EBs überschreiten die Feldgröße eines 10X-Objektiv und waren folglich schwieriger zu Bild. Daher wählten wir 0,5 uM als optimale RA-Konzentration.
Die Analyse durch Immunofluoreszenz von 3D-EBs ist problematisch, weil sie zu spröde für gefrorene Schnitte sind. Darüber hinaus fanden wir, dass gefrorene EB Abschnitte haften nicht gut auf unbeschichteten elektrostatisch behandelten Glasobjektträger. Herstellung von 2D-EB Kultur erfordert die Aggregation von zusätzlichen hängenden Tropfen, weil einige EBs anhängen nicht gut auf das Substrat. EB dissociation, die relativ langsam ist, kann durch Pipettieren der EBs nach oben und unten in einem 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen während ihrer Inkubation mit Kollagenase beschleunigt werden.
Neural differenzierte WSR können beschädigt endogenen Zellen verwendet werden , zu ersetzen, zB dopaminergen Neuronen in der Substantia nigra im Gehirn von Patienten , die an der Parkinson-Krankheit leiden 26 verloren. Während aktuelle Techniken der Differenzierung menschlicher ESC nicht EB Bildung erfordern (ibid.), Ist EBs noch ein nützliches Werkzeug für die detaillierte Analyse der neuronalen Differenzierung auf der molekularen Ebene.
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Disclosures
Die Autoren erklären, sie haben keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen
Acknowledgments
Diese Studie wurde von NIH Zuschusses R01 HL119984 zu AH unterstützt
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Cell culture dish (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Cell culture |
| Cell culture dish (100 mm) | Falcon | 353003 | Cell culture |
| Petri dish (100 mm) | Corning | 351029 | Hanging drops |
| 24-well plate | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-well plate | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1.5 mL centrifuge tube | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA stock solution |
| Microscope cover-glass | Fisherbrand | 12-545-80 | Circular, 12 mm diameter |
| Superfrost-plus microscope slides | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D collagen culture kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D culture |
| Effectene Transfection Reagent | Qiagen | 301427 | Stem cell transfection |
| Microcon Centrifugal Filters (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Protein concentration |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs culture |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs culture |
| Fetal bovine serum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs culture |
| Gelatin | Sigma-Aldrich | G2625 | Dish coating |
| LIF | R&D Systems | 8878-LF-025 | To maintain ESC pluripotency |
| MEM Non-Essential Amino Acids Solutions | Gibco | 11140050 | Cell culture |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Cell culture |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Cell culture |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Cell culture |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Cell culture |
| 0.25% Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Cell culture |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-retinoic acid | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induction of neural differentiation |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blocking and antibody dilution |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Cell membrane permeabilization |
| Cell strainer | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold anti-fade reagent with DAPI | Life Tech. | P36931 | Mounting reagent |
| 16% Paraformaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Cell fixation |
| Fibronectin | R&D Systems | 1030-FN | Dish coating |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Collagenase type I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB dissociation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Primary Antibodies | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Detection of neural differentiation |
| Oct4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Detection of neural differentiation |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Detection of neural differentiation |
| Sox2 | Cell Signaling | 3579 | Detection of neural differentiation |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Detection of neural differentiation |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Secondary Antibodies | |||
| Donkey anti-Mouse-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunofluorescence |
| Donkey anti-mouse-Alexa488 | Life Tech. | A21202 | Immunofluorescence |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Instruments | |||
| Wide-field microscope | Nikon | Eclipse TS100 | Cell culture imaging |
| Confocal microscope | Nikon | C2 | Immunofluorescence imaging |
References
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