Wir beschreiben eine Technik für die zur Erzeugung von zwei- oder dreidimensionalen Embryoidkörpern murinen embryonalen Stammzellen. Wir dann erklären, wie neuronale Differenzierung der Zellen Embryoidkörper von Retinsäure zu induzieren, und wie ihr Zustand der Differenzierung von Vorläuferzellmarker Immunofluoreszenz und Immunoblotting analysiert.
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Methodenartikel
Analyse von Retinsäure-induzierte neuronale Differenzierung von embryonalen Stammzellen der Maus in zwei und drei-dimensionale Embryoidkörpern
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Embryonale Stammzellen der Maus (WSR) von der Innenmasse der Blastozyste isoliert ( in der Regel am Tag E3.5) können für die Untersuchung der frühe Embryonalentwicklung als in - vitro - Modellsystem verwendet werden. In Abwesenheit von Leukämie-Hemmfaktor (LIF), unterscheidet WSR standardmäßig in neuralen Vorläuferzellen. Sie können in einer dreidimensionalen (3D) angehäuft werden, um sphärische Aggregat bezeichnet Embryoidkörperbildung (EB) aufgrund seiner Ähnlichkeit mit dem frühen Stadium Embryo. EBs auf Fibronektin-beschichtete Deckgläser ausgesät werden, wo sie von wachsenden zweidimensionale (2D) Erweiterungen oder implantiert in 3D-Kollagen-Matrices erweitern, wo sie als Sphäroiden weiter wachsen und differenzieren sich in die drei Keimblätter: endodermisches, mesodermalen und ektodermalen. Die 3D - Kollagen Kultur ahmt die in - vivo - Umgebung näher als der 2D - EBs. Die 2D-EB Kultur erleichtert Analyse von Immunfluoreszenz und Immunoblotting Differenzierung zu verfolgen. Wir haben einen zweistufigen neuronalen Differenzierung entwickeltmunikationsprotokoll. Im ersten Schritt wird EBs durch die Hanging-Drop-Technik erzeugt werden, und, gleichzeitig, induziert durch Exposition gegenüber Retinsäure (RA) zu differenzieren. Im zweiten Schritt, neuronalen Differenzierung erfolgt in einem 2D- oder 3D-Format in Abwesenheit von RA.
Einleitung
WSR stammt aus der Blastozyste inneren Zellmasse. Diese Zellen sind pluripotent, dh sie haben die Fähigkeit zur Differenzierung zu jedem Zelltyp des Ursprungsorganismus haben. ESC in vitro Differenzierung von breitem Interesse als experimentelles System für die Entwicklungsweg und Mechanismen zu untersuchen. Es bietet ein starkes und flexibles Modellsystem neue therapeutische Ansätze zur Korrektur von Zell- und Gewebestörungen zu testen. EBs rekapitulieren viele Aspekte der Zelldifferenzierung während der frühen Embryonalentwicklung. Insbesondere kann EBs verwendet werden , wenn embryonale Letalität erschwert es , die zellulären Grundlagen der embry....
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Protokoll
1. Kultur von embryonalen Maus-Fibroblasten (MEF)
- Bereiten MEF Medium, nach Dulbecco modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, high-glucose), ergänzt mit 15% fötalem Rinderserum (FBS).
- Coat 100 mm Zellkulturschalen mit 0,5% Gelatine-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur (RT).
- Graf MEFs mit einem Durchflusszytometer. Entfernen der Gelatinelösung und sofort gießen MEF Medium vorgewärmt auf 37 ° C. Schnell auftauen Phiolen von Mitomycin C-behandeln MEFs in einem 37 ° C Wasserbad für 2 min, dann 2,8 x 10 6 pro 100 mm MEFs gelatinebeschichteten dish Samens. Passen Sie die Zellzahl entsprechend, wenn Gerichte anderer Größen verwendet. Inkub....
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Ergebnisse
Oct4, Nanog und SOX2 sind die Kerntranskriptionsfaktoren, die ESC Selbsterneuerung und Pluripotenz verleihen. Wir wandten das obige Protokoll , um die neuronale Differenzierung von WSR vom Wildtyp und aus einem Stamm von genetisch veränderten Mäusen , wo Syx, ein Gen , kodierend für das RhoA spezifische exchange factor Syx, gestört zu vergleichen. Wir hatten Syx in 18 Angiogenese beteiligt. Wir bemerkten Unterschiede im Verhalten von EBs von Syx .......
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Diskussion
In diesem Protokoll stellen wir eine relativ einfache und zugängliche Methode neuronale Differenzierung von murinen WSR zu studieren. In vorangegangenen Protokollen wurde RA auf das Medium am Tag 2 oder Tag hinzugefügt 4 des EB hängenden Tropfen 8 oder durch Suspensionskultur bzw. 7, oder unmittelbar nach der Tropfenaggregation EB 21 hängt. In dem Protokoll wir erdacht wurde RA früher gegeben. Trotz der früheren Einführung von RA zu EBs durch Suspen.......
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Offenlegungen
Die Autoren erklären, sie haben keine konkurrierenden oder finanziellen Interessen
Danksagungen
Diese Studie wurde von NIH Zuschusses R01 HL119984 zu AH unterstützt
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Materials | |||
| MEFs | EMD Millipore | PMEF-CF | ESC Feeder layer |
| ESC | EMD Millipore | CMTI-2 | |
| Zellkulturschale (60 mm) | Eppendorf | 30701119 | Zellkultur |
| Zellkulturschale (100 mm) | Falcon | 353003 | Zellkultur-Petrischale |
| (100 mm) mm) | Corning | 351029 | Hängende Tropfen |
| 24-Well-Platte | Greiner Bio-One | 662160 | 2D EBs |
| 6-Well-Platte | Eppendorf | 30720113 | Transfection |
| Dark 1,5 mL Zentrifugenröhrchen | Celltreat Scientific Products | 229437 | RA-Stammlösung |
| Mikroskop-Deckglas | Fisherbrand | 12-545-80 | Rund, 12 mm Durchmesser |
| Superfrost-plus Objektträger | Fisherbrand | 12-550-15 | |
| 3D-Kollagenkultur-Kit | EMD Millipore | ECM675 | 3D-Kultur |
| Effecten-Transfektionsreagenz | Qiagen | 301427 | Stammzell-Transfektion |
| Microcon Zentrifugalfilter (10 kDa) | EMD Millipore | MRCPRT010 | Proteinkonzentration |
| Name | Company | >Katalognummer | Kommentare |
| Reagenzien | |||
| DMEM | Lonza | 12-709F | MEFs Kultur |
| IMDM | Gibco | 12440-046 | ESCs Kultur |
| Fötales Rinderserum (FBS) | EMD Millipore | ES-009-B | ESCs Kultur |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G2625 | Schalenbeschichtung |
| LIF | R& D Systems | 8878-LF-025 | Zur Aufrechterhaltung der ESC-Pluripotenz |
| MEM-Lösungen für nicht-essentielle Aminosäuren | Gibco | 11140050 | Zellkultur |
| 2-Mercaptoethanol | Gibco | 21985023 | Zellkultur |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Zellkultur |
| Gentamicin | Gibco | 15750060 | Zellkultur |
| MycoZap Plus-PR | Lonza | VZA-2022 | Zellkultur |
| 0,25 % Trypsin-EDTA | Gibco | 25200-072 | Zellkultur |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| All-trans-Retinsäure | Sigma-Aldrich | R2625-50MG | Induktion der neuralen Differenzierung |
| Rinderserumalbumin | Sigma-Aldrich | A7030-50G | Blockierung und Antikörperverdünnung |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787-100ML | Zellmembran-Permeabilisierung |
| Zellsieb | Corning | 352360 | |
| Prolong Gold Anti-Fade-Reagenz mit DAPI | Life Tech. | P36931 | Eindeckreagenz |
| 16% Paraformaldehyd | Elektronenmikroskopie Wissenschaften | 15710 | Zellfixierung |
| Fibronektin | R& D Systems | 1030-FN | Schalenbeschichtung |
| PBS | Gibco | 10010049 | |
| Kollagenase Typ I | Worthington Biochem. Corp | LS004196 | EB Dissoziation |
| Name | Unternehmen | Katalognummer< | strong>Kommentare |
| Primärantikörper | |||
| Nestin (Rat-401) | Santa Cruz Biotech | sc-33677 | Nachweis der neuronalen |
| Differenzierung Okt4 | Santa Cruz Biotech | sc-5279 | Nachweis von Neuronale Differenzierung |
| Nanog | Bethyl Laboratories | A300-398A | Nachweis der neuronalen Differenzierung |
| Sox2-Zell-Signalwege | 3579 | Nachweis der neuronalen Differenzierung | |
| Tubulin b3 (AA10) | Santa Cruz Biotech | sc-80016 | Nachweis der neuronalen Differenzierung |
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
| Sekundäre Antikörper | |||
| Donkey Anti-Maus-Alexa555 | Life Tech. | A31570 | Immunfluoreszenz-Esel |
| Anti-Maus-Alexa488 | Lebenstechnik. | A21202 | Immunfluoreszenz |
| Name | Company | >Katalognummer | Comments |
| Instruments | |||
| Weitfeldmikroskop | Nikon | Eclipse TS100 | Zellkultur-Bildgebung |
| Konfokales Mikroskop | Nikon | C2 | Immunfluoreszenz-Bildgebung |
Referenzen
- Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies. Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).
- Itskovitz-Eldor, J., et al. Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromis....
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Nachdrucke und Genehmigungen
