Summary

Messung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse bei Inguinal Adipose Fat Pads

Published: July 21, 2017
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Summary

Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.

Abstract

Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem das als Triglyceride in adipösen Geweben gelagerte Lipid in Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Messung der basalen und Forskolin (FSK) -stimulierten Lipolyse in den Leistenfettkissen, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, die entweder normale Chow-Diät (NCD), fettreiche Diät (HFD) oder eine fettreiche Diät mit 0,01 gefüttert wurden % Des Capsaicins (CAP; transientes Rezeptorpotential Vanilloidunterfamilie 1 (TRPV1) Agonist) für 32 Wochen. Die hier beschriebene Methode zur Durchführung der Ex-vivo- Lipolyse wird von Schweiger et al. 1 Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Messung der Glycerinspiegel durch UV-Visible (UV / VIS) -Spektrophotometrie vor. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für Lipolyse-Messungen erfolgreich zu isolieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Das für Leistenfettkissen beschriebene Protokoll kann leicht erweitert werden, um die Lipolyse in anderen Geweben zu messen.

Introduction

Adipöse Gewebe speichern Energie als Fett 2 und Fettsäure Oxidation ist für die Thermogenese 3 , 4 erforderlich. Fettsäuren, die durch Diäten eingenommen werden, werden zusammen mit Apoproteinen in Chylomikronen verpackt und über Blutkreislauf an verschiedene Gewebe im Körper abgegeben. Obwohl die meisten Zellen im Körper speichern eine Reserve von Energie, Fettgewebe speichert überschüssige Energie als Fett 5 , 6 . Die Lipolyse im Fettgewebe wird durch komplexe Prozesse reguliert und die molekularen Details der Lipolyse bleiben noch vage 7 .

Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem Triglyceride (TGL), die im Fettgewebe gespeichert sind, hydrolysiert werden, um Glycerin und Fettsäuren (FA) durch das Enzym adipöse Triglyceridlipase (ATGL) 8 zu erzeugen. Veränderungen in der basalen und stimulierten Lipolyse ist ein charakteristisches Merkmal der Fettleibigkeit. Die bDie asale Lipolyse wird durch die ATGL-Aktivierung 9 reguliert, die TGL in Diacylglycerin (DAG) umwandelt, das anschließend zu Monoacylglycerin (MAG) hydrolysiert wird. Die Aktivierung von hormonempfindlicher Lipase (HSL) über Adenylylcyclase aktiviert die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase A (PKA) Stimulation und bewirkt eine Lipolyse. Die Messung der Lipolyse, basal und stimuliert, ist daher wichtig, um die Aktivität der an diesem Prozess beteiligten Proteine ​​zu analysieren. Auch die Entschlüsselung der molekularen Regulation der Lipolyse kann vorteilhaft sein, um neue therapeutische Strategien gegen die Fettleibigkeit zu entwickeln 10 . Da Moleküle, die die Lipolyse und die Fettsäureoxidation stimulieren, potentielle Kandidaten für die Verringerung der in Depots gespeicherten Fette sind, ist es wichtig, einen robusten Test auf Reproduzierbarkeit zu verwenden.

Bisher veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von TRPV1-Protein, ausgedrückt in weißem Fettgewebe, durch CAP-basierteUnd FSK (Adenylylcyclaseaktivator) – stimulierte Lipolyse in Leistenfettkissen 11 . Die bisherige Forschung deutet auch darauf hin, dass die langfristige Aktivierung von TRPV1 durch CAP die PKA 12 aktiviert. Da die Aktivierung von PKA die Lipolyse 13 , 14 stimuliert , wird sowohl die basale als auch die PKA-abhängige stimulierte Lipolyse in Leistenfettpolstern, die nach 32 Wochen nach der Fütterung der jeweiligen Diäten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden, die Rolle von TRPV1 validieren Aktivierung in der Lipolyse

Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Bestimmung der basalen und stimulierten Lipolyse. Obwohl andere Verfahren, die radioaktive Isotope von Glycerin und mühsame Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen 15 , 16 zur Verfügung stellen, verfügbar sind, bietet diese Methode eine direkte, einfache und kostengünstigeTechnik zur Bestimmung der Lipolyse im Fettgewebe.

Protocol

Alle Protokolle folgen den Tierschutzrichtlinien der Universität Wyoming. 1. Tierhaltung und Fütterung ANMERKUNG: Erwachsene männliche Wildtyp-Mäuse (C57BL / 6) (Alter 12 bis 24 Wochen) wurden in der Forschungstierstätte gemäß den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen gezüchtet. Ab der Woche 6 des Alters, Haus Mäuse in Gruppen von vier in getrennten Käfigen und zufällig zuordnen sie in Fütterung Gruppen…

Representative Results

Um die Wirkung von CAP auf die basale und stimulierte Lipolyse zu bewerten, wurde in dieser Untersuchung die Lipolyse in Leistenfett-Pads durchgeführt, die aus NCD- oder HFD- (± CAP) -förmigen Wildtyp-Mäusen isoliert wurden. Die repräsentativen Ergebnisse für die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse für die Leistenfett-Pads sind in Tabelle I angegeben . Basal- und FSK-stimulierte Glycerin-Freisetzung in Gegenwart von Triacsin C, die die Acyl-coA-Synthetase hemmt un…

Discussion

Der Abbauprozess von TGL in Glycerin und Fettsäuren wird durch ATGL 9 während der Basallipolyse katalysiert und durch eine Reihe von Proteinen einschließlich der Aktivierung des Adenylylcyclase / PKA-abhängigen Weges während der stimulierten Lipolyse 21 , 22 , 23 orchestriert. Verbesserung der Lipolyse erhöht die Plasmaspiegel von Fettsäuren für Transport und Energieverbrauch 24…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde von der AHA Award Nr. 15BGIA23250030, dem National Institute of General Medical Sciences der NIH unter der Auszeichnung Nummer 8P20 GM103432-12 und der University of Wyoming Fakultät Grant in Aid to BT unterstützt.

Materials

Capsaicin Sigma, USA M2028 TRPV1 agonist
Forskolin Sigma, USA F6886 Adenylyl cyclase activator
DMEM GE healthcare and life sciences, UT, USA SH30081.01
High fat diet Research diets, New Brunswick, USA D12492 Abbreviated as HFD
Tris Amresco, USA O497
Sodium chloride Thermofisher Scientific BP358-212
Sodium deoxycholate Sigma, USA D6750
Dithiothreitol Sigma, USA D9163
Sodium orthovanadate Sigma, USA S6508
Protease inhibitor cocktail Sigma, USA P8340
Free Glycerol reagent Sigma USA F6428
DMSO Sigma, USA D8779
Triacsin C Sigma, USA T4540 Acyl CoA transferase inhibitor
Bovine serum albumin Sigma, USA A7030
Chloroform Sigma Aldrich 31998-8
Methanol Thermofisher Scientific, USA A412-1
Sodium hydroxide Amresco, USA O583
Sodium dodecyl sulfate Sigma, USA L3371
Bicinchoninic acid reagent Sigma, USA BCA1-1KT
UV-VIS Spectrophotometer Pharmacia Biotech, NJ, USA Ultrospec 2000
Normal chow diet Labdiet.com 500I abreviated as NCD
C57BL/6 mice Jackson Laboratory, CT, USA Stock number000664 wild type mice
Parafilm Heathrow Scientific, USA HS 234526A
Glycerol standard Sigma, USA G7793

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Cite This Article
Baskaran, P., Thyagarajan, B. Measurement of Basal and Forskolin-stimulated Lipolysis in Inguinal Adipose Fat Pads. J. Vis. Exp. (125), e55625, doi:10.3791/55625 (2017).

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