Summary
Dieses Protokoll beschreibt die Methode zur Bestimmung der Basal- und Forskolin-stimulierten Lipolyse in Leistenfett-Pads, die aus normaler Chow-Diät (NCD) oder hochfettigen Diät (HFD) ± Capsaicin-gefütterten Wildtyp-Mäusen erhalten wurden. Als Index für die Lipolyse wurde die Glycerinfreisetzung aus Leistenfett-Pads gemessen.
Abstract
Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem das als Triglyceride in adipösen Geweben gelagerte Lipid in Glycerin und Fettsäuren hydrolysiert wird. Dieser Artikel beschreibt die Methode zur Messung der basalen und Forskolin (FSK) -stimulierten Lipolyse in den Leistenfettkissen, die von Wildtyp-Mäusen isoliert wurden, die entweder normale Chow-Diät (NCD), fettreiche Diät (HFD) oder eine fettreiche Diät mit 0,01 gefüttert wurden % Des Capsaicins (CAP; transientes Rezeptorpotential Vanilloidunterfamilie 1 (TRPV1) Agonist) für 32 Wochen. Die hier beschriebene Methode zur Durchführung der Ex-vivo- Lipolyse wird von Schweiger et al. 1 Wir stellen ein detailliertes Protokoll zur Messung der Glycerinspiegel durch UV-Visible (UV / VIS) -Spektrophotometrie vor. Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für Lipolyse-Messungen erfolgreich zu isolieren, um konsistente Ergebnisse zu erzielen. Das für Leistenfettkissen beschriebene Protokoll kann leicht erweitert werden, um die Lipolyse in anderen Geweben zu messen.
Introduction
Adipöse Gewebe speichern Energie als Fett 2 und Fettsäure Oxidation ist für die Thermogenese 3 , 4 erforderlich. Fettsäuren, die durch Diäten eingenommen werden, werden zusammen mit Apoproteinen in Chylomikronen verpackt und über Blutkreislauf an verschiedene Gewebe im Körper abgegeben. Obwohl die meisten Zellen im Körper speichern eine Reserve von Energie, Fettgewebe speichert überschüssige Energie als Fett 5 , 6 . Die Lipolyse im Fettgewebe wird durch komplexe Prozesse reguliert und die molekularen Details der Lipolyse bleiben noch vage 7 .
Die Lipolyse ist ein Verfahren, bei dem Triglyceride (TGL), die im Fettgewebe gespeichert sind, hydrolysiert werden, um Glycerin und Fettsäuren (FA) durch das Enzym adipöse Triglyceridlipase (ATGL) 8 zu erzeugen. Veränderungen in der basalen und stimulierten Lipolyse ist ein charakteristisches Merkmal der Fettleibigkeit. Die bDie asale Lipolyse wird durch die ATGL-Aktivierung 9 reguliert, die TGL in Diacylglycerin (DAG) umwandelt, das anschließend zu Monoacylglycerin (MAG) hydrolysiert wird. Die Aktivierung von hormonempfindlicher Lipase (HSL) über Adenylylcyclase aktiviert die zyklische Adenosinmonophosphat (cAMP) abhängige Proteinkinase A (PKA) Stimulation und bewirkt eine Lipolyse. Die Messung der Lipolyse, basal und stimuliert, ist daher wichtig, um die Aktivität der an diesem Prozess beteiligten Proteine zu analysieren. Auch die Entschlüsselung der molekularen Regulation der Lipolyse kann vorteilhaft sein, um neue therapeutische Strategien gegen die Fettleibigkeit zu entwickeln 10 . Da Moleküle, die die Lipolyse und die Fettsäureoxidation stimulieren, potentielle Kandidaten für die Verringerung der in Depots gespeicherten Fette sind, ist es wichtig, einen robusten Test auf Reproduzierbarkeit zu verwenden.
Bisher veröffentlichte Daten deuten darauf hin, dass die Aktivierung von TRPV1-Protein, ausgedrückt in weißem Fettgewebe, durch CAP-basierteUnd FSK (Adenylylcyclaseaktivator) - stimulierte Lipolyse in Leistenfettkissen 11 . Die bisherige Forschung deutet auch darauf hin, dass die langfristige Aktivierung von TRPV1 durch CAP die PKA 12 aktiviert. Da die Aktivierung von PKA die Lipolyse 13 , 14 stimuliert , wird sowohl die basale als auch die PKA-abhängige stimulierte Lipolyse in Leistenfettpolstern, die nach 32 Wochen nach der Fütterung der jeweiligen Diäten von NCD- oder HFD- (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden, die Rolle von TRPV1 validieren Aktivierung in der Lipolyse
Dieser Artikel beschreibt eine effiziente Methode zur Bestimmung der basalen und stimulierten Lipolyse. Obwohl andere Verfahren, die radioaktive Isotope von Glycerin und mühsame Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen 15 , 16 zur Verfügung stellen, verfügbar sind, bietet diese Methode eine direkte, einfache und kostengünstigeTechnik zur Bestimmung der Lipolyse im Fettgewebe.
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Protocol
Alle Protokolle folgen den Tierschutzrichtlinien der Universität Wyoming.
1. Tierhaltung und Fütterung
ANMERKUNG: Erwachsene männliche Wildtyp-Mäuse (C57BL / 6) (Alter 12 bis 24 Wochen) wurden in der Forschungstierstätte gemäß den Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) genehmigten Protokollen gezüchtet.
- Ab der Woche 6 des Alters, Haus Mäuse in Gruppen von vier in getrennten Käfigen und zufällig zuordnen sie in Fütterung Gruppen von NCD oder HFD (± 0,01% CAP) bis Woche 38 des Alters.
HINWEIS: CAP ist ein Agonist von TRPV1-Kanalprotein, ausgedrückt in Fettgeweben 11 , 17 . Mischen Sie CAP mit HFD in einem Mixer in der Kapuze und übertragen Sie die gemischte Mischung in ein Tablett mit kleinen 1 in 2 Trennwänden. Halten Sie das Tablett in einem -20 ° C Gefrierschrank. Entfernen Sie das Tablett mit der HFD + CAP Diät aus dem Gefrierschrank nach 24 h und lagern Sie in einem Behälter bei -20 &# 176; C Gefrierschrank bis zum Gebrauch. - Hausmäuse in einer klimatisierten Umgebung (22,8 ± 2,0 ° C, 45 - 50% Feuchtigkeit) mit einem 12/12-Licht / Dunkel-Zyklus mit Zugang zu ausgewiesener Diät und Wasser ad libitum .
- Am Ende von 38 Wochen, sezernden adinösen Fettgewebe und Verwendung für Lipolyse-Experimente (Abschnitte 2-7).
2. Vorbereitung von Mäusen für die Experimente
- Anästhesieren von Mäusen durch Injektion von Ketamin und Xylazin-Gemisch (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht). Injektion von 0,01 ml der Mischung / 10 g Körpergewicht der Maus.
- Bestätige tiefe Anästhesie durch eine feste Zehenkneife. Wenn es einen Pedalreflex gibt, teste die Maus nach mindestens 30 s erneut.
- Verwenden Sie Tierarzneimittel, um die Trockenheit der Augen während der Anästhesie zu verhindern. Verlassen Sie Mäuse nicht unbeaufsichtigt während eines der Verfahren.
- Euthanisieren von Mäusen durch Einspritzen einer hohen Dosis Ketamin- und Xylazin-Gemischinjektion (10 mg / kg bzw. 80 mg / kg Körpergewicht)E (0,01 ml / 10 g Körpergewicht) gefolgt von Zervixversetzung.
ANMERKUNG: Diese Methode der Sterbehilfe wird vom IACUC der Universität Wyoming genehmigt.
3. Isolierung von Inguinal Adipose Fat Pads
- Legen Sie die Maus (mit NCD oder HFD (± CAP) für 32 Wochen) liegen auf der linken Seite für die Prozedur.
HINWEIS: Wenn du die Maus auf die linke Seite legst, wird der linke Vorder- und linke Hinterbein auf der Sektionsplattform stehen, während der rechte Vorsprung und der rechte Hinterbein von der Plattform abgewandt werden. - Sterilisieren Sie die Hautoberfläche mit einem 2-Zoll- 2- Gaze-Pad, das in etwa 2,5 ml 70% Ethanol eingeweicht wurde. Machen Sie einen 2 - 3 mm seitlichen Schnitt durch die Haut mit einem Skalpell, um die zugrunde liegende Fettschicht zu zeigen.
- Machen Sie einen 1 cm Schnitt (abhängig von der Größe der Maus) durch die Haut mit einem Skalpell direkt unter dem Brustkorb über die dorsale Oberfläche verbinden die beiden seitlichen Einschnitte.
- Schälen Sie die Hautklappe, indem Sie sie sorgfältig ziehenMit steriler Pinzette und lassen Sie die subkutane Auflage intakt, indem Sie nicht die fetten Pads schneiden. Das ist das fette Pad, das unter der Haut liegt.
- Ziehen Sie das Fett-Pad sorgfältig aus dem zugrunde liegenden Muskel und Faszie mit einer Schere. Ziehen Sie das Fett-Pad, wie es aus dem zugrunde liegenden Muskel geschnitten wird.
HINWEIS: Das Gewicht und die Größe der Fettpolster hängt von der Art der Mäuse (NCD oder HFD (± CAP) -fed ab). - Verwenden Sie eine Pinzette, um sie auf eine Petrischale mit Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) zu übertragen, bis die Lipolyse-Experimente bei Raumtemperatur (~ 15 min) durchgeführt wurden.
- Isoliere die Fettpolster von der rechten Seite der Maus, wie in den Schritten 3.2-3.6 beschrieben.
4. Basal Glycerol Freisetzung von Inguinal Fat Pads
- Verwenden Sie scharfe Schere, um etwa 20 mg Fettgewebe in 5 bis 8 Stück zu schneiden.
- Inkubieren Sie die geschnittenen Stücke von Leistenfettkissen in 200 & mgr; l Inkubationsmedium (Dulbecco's Modified Eagel's Medium (DMEM), das 2% Fettsäure enthältFreies Rinderserumalbumin (BSA)) bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 60 min.
- Das Inkubationsmedium sammeln und bei -80 ° C für den Lipolyse-Test einfrieren.
HINWEIS: Die geschnittenen Stücke werden zur Bestimmung der Proteinkonzentration nach der Lipidextraktion verwendet. - Übertragen Sie die geschnittenen Fettstücke mit Hilfe von Pinzetten in 1 ml Extraktionslösung (Chloroform: Methanol (2: 1, v / v) und 1% Eisessig) und inkubieren für 60 min bei 37 ° C unter kräftigem Schütteln bei 100 ° C Rpm Die Fettabsaugungslösung verwerfen.
HINWEIS: Dieser Schritt wird Fett aus den Schnittstücken extrahieren. Verwerfe die Fett-Extraktionslösung, da sie die Proteinbestimmung beeinträchtigen wird. - Übertragen Sie das Gewebe (aus Schritt 4.2.2) mit einer Pinzette in ein steriles Mikrofugenröhrchen, das 500 μl Lyse-Lösung (0,3 N NaOH, enthaltend 0,1% Natriumdodecylsulfat, SDS) enthält und über Nacht (12 h) bei 55 ° C unter kräftigem Schütteln inkubieren Bei 100 U / min.
- Das Inkubationsmedium sammeln und bei -80 ° C für den Lipolyse-Test einfrieren.
- Bestimmen Sie die Proteinkonzentration des Gewebes (Schritt 4.2.3) unter Verwendung des Bicinchoninsäure (BCA) -Reagens und BSA als Standard 18 .
- Auftauen des gefrorenen Mediums (Schritt 4.2.1) auf Eis und festzustellen , der Glyceringehalt des Mediums ein freies Glycerin Reagenz wie in Protokoll Abschnitten 6 und 7 beschriebenen 6.
- Extraktion der Konzentration von Glycerin in Proben aus der Standardkurve, die unter Verwendung von Glycerin-Standards 19 aufgetragen ist, und Expression von Lipolyse als Nanomol-Glycerin pro mg Protein pro h 20 .
5. FSK-stimulierte Lipolyse
- Präinkubieren Sie etwa 20 mg Leistenfettkissen (5 bis 8 Schnittstücke), erhalten aus NCD- oder HFD (± CAP) -Fett-Wildtyp-Maus in 200 μl DMEM mit 2% fettsäurefreiem BSA, 10 μM FSK und 5 μM Triacsin C an 37 ° C in 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit für 60 min.
- Übertragen Sie die Gewebestücke mit Pinzetten auf ein identisches Medium und inkubieren für weitere 60 min bei 37 ° C, 5% CO 2 und 95% Feuchtigkeit. Sammle das Inkubationsmedium und lag bei -80 ° C bis zum Lipolyse-Assay.
HINWEIS: Die Stimulation der Lipolyse bewirkt eine rasche Freisetzung von Fettsäuren und Glycerin innerhalb von 15 min, die während der ersten Stunde linear ist, und Plateaus danach. Da die Rate stimulierter Lipolyse höher und stabiler ist Zeitraum zwischen der ersten und zweiten Stunde der FSK - Stimulation, dieses Protokoll gemessen Lipolyse in dem stimulierten Zustand nach dem zweiten Inkubation , wie zuvor 1 beschrieben. So sind sowohl die experimentellen Schritte (5.1 und 5.1.1) notwendig.
6. Herstellung des freien Glycerinreagens
- Das Glycerinreagenz 19 in 40 ml entionisiertem Wasser in einer bernsteinfarbenen Glasfläschchen rekonstituieren, einen Stopf auf die Durchstechflasche legen und 10 mal mischen. Mischen Sie nicht durch Schütteln.
- Lagern Sie die Durchstechflasche bei 4 ° C in einem kühlschrank vor Licht, indem Sie die Durchstechflasche vollständig mit Aluminiumfolie abdecken.
- Weiter zur Vorbereitung des Glycerin-Standards (Abschnitt 7).
7. Vorbereitung des Glycerin-Standards und Bestimmung des Glycerin-Gehalts
- Machen Sie einen Vorrat von 1 mM durch Verdünnen von 35 & mgr; l des zugeführten Materials mit 65 & mgr; l entionisiertem Wasser.
ANMERKUNG: Der Hersteller lieferte Glycerin-Standardlager 2,8 mM Glycerin. - Nehmen Sie fünf 1-cm-Pfadlänge Einweg-Methacrylat-Küvetten. Markieren Sie die Küvetten mit einem Marker als 0, 1.25, 2.5, 5 und 10 nmol Standard.
- Füge 0, 1,25, 2,5, 5 und 10 μl 1 mM Glycerin-Standard zu den jeweiligen markierten Küvetten hinzu. Das Volumen jeder Küvette auf 10 μl mit entionisiertem Wasser auffüllen.
- 1 bis 10 Verdünnung aller Proben (aus Schritt 4.4 oder 5.1.1) durch Zugabe von 10 μl der Probe zu 90 μl deionisiertem Wasser in frische 500 μl prämarkierte Zentrifugenröhrchen herstellen. 10 μl der verdünnten Proben in die mit der jeweiligen Probenidentifikationsnummer markierten Küvetten geben.
- Schalte das UV-VIS-Spektrophotometer ein und setze die Welle einLänge bis 540 nm.
- Das freie Glycerinreagenz auf Raumtemperatur erwärmen, indem man die Durchstechflasche (Schritt 6.2) bei Raumtemperatur 15 min lang hält.
- Stellen Sie eine Reihe von markierten Küvetten als leeren "0" nmol Standard (Schritt 7.3), Standards (Schritt 7.3) und Proben (Schritt 7.4) auf.
- Fügen Sie 10 μl von jedem der Standard und Probe in die jeweilige markierte Küvette. Verwenden Sie "0" nmol Standard als Leerzeichen.
- Füge 0,8 ml freies Glycerinreagenz in jede Küvette hinzu, wobei die Glycerin-Standards unter Verwendung einer 1-ml-Pipette enthalten sind.
- Die Küvette mit einem 1,5 cm quadratischen Plastik-Paraffin-Film bedecken und den Inhalt durch dreimaliges Umkehren der Küvette mischen und 10 min bei Raumtemperatur ablegen.
- Legen Sie die Küvette in das UV-VIS-Spektrophotometer und notieren Sie die Absorption (540 nm Wellenlänge).
- Zeichnen Sie die Standardkurve unter Verwendung der Konzentrationen der Standards (nmol) in der X-Achse und der aufgezeichneten Absorption in der Y-Achse.
- Berechnen Sie die Konzentration von glYcerol in den Proben (nmol) durch Extrapolation unter Verwendung der in Schritt 7.12 aufgetragenen Standardkurve.
- Multiplizieren Sie die Konzentration der Proben (nmol / Küvette) mit dem Verdünnungsfaktor 10 (siehe Schritt 7.4) und 20 (Gesamtvolumen)
- Teilen Sie die Konzentration von Glycerin in jeder Probe (Schritt 7.13) durch die nach dem BCA-Verfahren berechnete mg Protein.
HINWEIS: Da die Leistenfettkissenproben für 60 min inkubiert werden, stellen sie die Ergebnisse als nmol von Glycerin / mg Protein / h dar.
- Machen Sie einen Vorrat von 1 mM durch Verdünnen von 35 & mgr; l des zugeführten Materials mit 65 & mgr; l entionisiertem Wasser.
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Representative Results
Um die Wirkung von CAP auf die basale und stimulierte Lipolyse zu bewerten, wurde in dieser Untersuchung die Lipolyse in Leistenfett-Pads durchgeführt, die aus NCD- oder HFD- (± CAP) -förmigen Wildtyp-Mäusen isoliert wurden. Die repräsentativen Ergebnisse für die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse für die Leistenfett-Pads sind in Tabelle I angegeben . Basal- und FSK-stimulierte Glycerin-Freisetzung in Gegenwart von Triacsin C, die die Acyl-coA-Synthetase hemmt und die Regeneration von TGL verhindert. Wie in Abbildung 1 gezeigt , unterdrückte HFD die FSK-stimulierte Lipolyse und CAP erhöhte sowohl die basale als auch die FSK-stimulierte Lipolyse. Triacsin C wurde verwendet, um die Regeneration von TGL aus Glycerin und Fettsäuren zu hemmen 11 . Alle Daten werden als Mittel ausgedrückt ± SEM Vergleiche zwischen Gruppen werden mit Einweg-ANOVA analysiert und Post-hoc- Analysen wurden unter Verwendung des Student's t- Tests durchgeführt. Mustergrößen sind eingestellt Um festzustellen, ob sich der Mittelwert einer Ergebnisvariablen in einer Gruppe signifikant von der in einer anderen Gruppe unterscheidet. Ein p-Wert <0,05 gilt als statistisch signifikant.
Abbildung 1: CAP erhöht die Basal- und FSK-stimulierte Glycerin-Freisetzung in Inguinal Fat Pads. Balkendiagramme repräsentieren den Mittelwert ± SEM der basalen und FSK (10 μM) -stimulierten Glycerinfreisetzung (nmol / mg Protein / h) in den Leistenfettkissen, die aus NCD- oder HFD (± CAP) -fettartigen Mäusen isoliert wurden. ** Repräsentiert statistische Signifikanz für p-Wert <0,05 für n = 6. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur anzuzeigen.
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Abbildung 2: Hydrolyse von Triglyceriden (TGL) Ergebnisse bei der Erzeugung freier Fettsäuren (FFA) und Glycerin. FFA unterliegt einer mitochondrialen β-Oxidation. Dies stimuliert zusammen mit der Hochregulierung des Entkopplungsproteins 1 (UCP-1) die Thermogenese. Die Glycerolfreisetzung wird nach dem in dem Artikel beschriebenen Protokoll gemessen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Lipolyse (Nmol Glycerin / mg Protein / h) | NCD (N = 6) | HFD (N = 6) | HFD + CAP (N = 6) |
| Basal | 16,22 ± 1,28 | 17,16 ± 1,48 | 52,07 ± 2,66 |
| FSK Stimuliert (Mit Triacsin C) | 54,88 ± 3,27 | 41,23 ± 4,43 | 72,04 ± 4,16 |
Tabelle 1: Wirkung von CAP auf die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse bei Inguinal Fat Pads. Mittlere basale und FSK-stimulierte Glycerinfreisetzung ± SEM, gemessen in Leistenfett-Fettgewebe, erhalten aus NCD-, HFD- oder HFD + CAP-gefütterten Wildtyp-Mäusen.
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Discussion
Der Abbauprozess von TGL in Glycerin und Fettsäuren wird durch ATGL 9 während der Basallipolyse katalysiert und durch eine Reihe von Proteinen einschließlich der Aktivierung des Adenylylcyclase / PKA-abhängigen Weges während der stimulierten Lipolyse 21 , 22 , 23 orchestriert. Verbesserung der Lipolyse erhöht die Plasmaspiegel von Fettsäuren für Transport und Energieverbrauch 24 . Fettsäuren werden von Mitochondrien als Acetyl-CoA aufgenommen, das zur Energiegewinnung verwendet wird.
Der Grad und das Ausmaß der Lipolyse können effizient durch Glycerinfreisetzung aus Fettgeweben gemessen werden ( Tabelle 1 und Abbildung 1 ). Die Hydrolyse von TGL produziert Fettsäuren und Glycerin. Bisherige Untersuchungen zeigten, dass die Nahrungsergänzung von CAP die Basal- sowie FSK-stimulierten Glycerol-Freisetzungen signifikant erhöht hatE aus Leisten- und Braunfettkissen 11 , 17 . Die erhöhte Produktion von Fettsäuren aus erhöhter Lipolyse könnte als Futter zur Erzeugung von Wärme und Thermogenese dienen, da CAP auch die Expression von mitochondrialem UCP-1 in den Leistenfettkissen signifikant erhöht hat. In Übereinstimmung mit dieser Vorstellung deuten die bisherigen Untersuchungen darauf hin, dass CAP die Expression von Peroxisom-Proliferator-aktiviertem Rezeptor-Alpha (PPARα) in Leistenfett-Pads verstärkte, was bei der mitochondrialen Fettsäureoxidation und bei der Transkriptionsregulation von UCP-1 25 , 26 eine entscheidende Rolle spielt , 27 Folglich erhöhte die CAP auch die metabolische Aktivität, die Wärmeproduktion und den Energieaufwand bei den HFD-gefütterten Mäusen 28 , 29 . Des Weiteren erhöhte die HFD-Fütterung die stimulierte Lipolyse, während CAP die Basal- und FSK-stimulierten PKA-abhängigen erhöhteT Lipolyse sowie verbesserte Insulinsensitivität 30 . Daher ist es, wie durch das Modell in Fig. 2 beschrieben , sinnvoll, zu interpretieren, daß die CAP die basale und stimulierte Lipolyse erhöht, ohne daß die Insulinresistenz verursacht wird, wenn das überschüssige Fett verbrannt wird, um Wärme durch mitochondriale UCP-1-Hochregulation zu erzeugen.
Dieser Artikel beschreibt die Methode der Messung der Glycerin-Freisetzung aus weißen Fettgewebe. Obwohl mehrere Methoden mit stabilen Isotopen von Glycerin zur Verfügung stehen, benötigen sie entweder Hochleistungsflüssigchromatographie oder Gaschromatographie / Massenspektrometrie für die Messungen 15 , 16 . Auch Glycerin-Radio-Tracer-Messungen sind mit Nicht-Spezifitäten verbunden 31 . Alternative Methoden umfassen die Bestimmung von mRNA und Proteinspiegel von Lipasen und regulatorischen Proteinen, die an der Lipolyse beteiligt sind. Kolorimetrische Methoden sind auch für d verfügbarEtermine die Konzentration von langkettigen Fettsäuren im Umlauf. Das hier beschriebene Verfahren ist sehr effizient bei der Analyse der Glycerinfreisetzung aus Fettgeweben, wie es mit einem Plattenleser möglich ist, der zur Fluoreszenz- und Absorptionsmessung fähig ist. Auch die vereinfachte analytische Methode für die Glycerinfreisetzung, die in diesem Artikel beschrieben wird, bietet eine verbesserte Stabilität und Präzision 32 .
Standard-Betriebsverfahren sollten praktiziert werden, da diese Methode chirurgische Techniken beinhaltet, um Fettpolster zu isolieren. Dieses Protokoll empfiehlt die Verwendung von fettfreiem BSA. Dies kann zu Luftblasenbildung führen, die die Absorptionsmessung beeinträchtigen wird. Deshalb ist darauf zu achten, dass Proben behandelt werden, um Luftblasen zu vermeiden. Es ist darauf zu achten, dass die Proben nicht während der BSA-Behandlung geschüttelt oder umgekehrt werden, es sei denn, dass ein solcher Schritt im Protokoll empfohlen wird. Auch ist der Fett-Extraktionsschritt von Leistenfett kritisch, da das Vorhandensein von Fett den Witz störtH-inguinalen Fettgewebe-Proteinbestimmung. Zusätzlich ist es bei der Herstellung von Glycerin-Standards wichtig, den Inhalt durch Inversion zu mischen und die Durchstechflasche nicht zu schütteln.
Das hier beschriebene Verfahren kann verwendet werden, um Leistenfettkissen für mehrere Assays, einschließlich Lipolyse-Messungen, erfolgreich zu isolieren. Das für Leistenfettkissen beschriebene Lipolyseprotokoll kann leicht auf die Messung der Lipolyse in anderen Geweben ausgedehnt werden. Die Methoden sind für alle Arten von Fett-Pads, sowie Preadipocyten optimiert.
Zusammenfassend beschreibt dieser Artikel die Methode zur Messung der basalen und FSK-stimulierten Glycerol-Freisetzung in inguinalen Fettfettsäuren, die aus NCD- oder HFD (± CAP) -Fed-Mäusen isoliert wurden. Die dargestellten Daten deuten darauf hin, dass die TRPV1-Aktivierung durch CAP die Basal- und FSK-stimulierte Lipolyse erhöht und die Akkumulation von Lipiden im Fettgewebe verhindert hat. Diese Daten zeigen eine kritische Rolle des TRPV1-Proteins in der RegulationN der Lipolyse im weißen Fettgewebe
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu offenbaren.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der AHA Award Nr. 15BGIA23250030, dem National Institute of General Medical Sciences der NIH unter der Auszeichnung Nummer 8P20 GM103432-12 und der University of Wyoming Fakultät Grant in Aid to BT unterstützt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
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