Summary
يصف هذا البروتوكول طريقة تحديد تحلل الدهون القاعدية و فورسكولين تحفيز في منصات الدهون الأربية التي تم الحصول عليها من النظام الغذائي العادي تشاو (نسد) أو نظام غذائي عالي الدهون (هفد) ± كابسيسين تغذية الفئران نوع البرية. كمؤشر لتحلل الدهون، تم قياس إطلاق الجلسرين من منصات الدهون الدهنية الأربية.
Abstract
انحلال الدهون هو عملية يتم فيها تحلل الدهون المخزنة على شكل الدهون الثلاثية في الأنسجة الدهنية إلى الجلسرين والأحماض الدهنية. توضح هذه المقالة طريقة قياس تحلل الدهون القاعدية و فورسكولين (فسك) في منصات الدهون الأربية معزولة عن الفئران البرية نوع غذاء إما النظام الغذائي العادي (نسد)، نظام غذائي عالي الدهون (هفد) أو اتباع نظام غذائي عالي الدهون تحتوي على 0.01 ٪ من كبخاخات (كاب؛ مستقبلات عابرة فانيلويد الفصيلة 1 (TRPV1) ناهض) لمدة 32 أسبوعا. يتم وصف الطريقة الموصوفة هنا لأداء خارج الجسم تحلل الدهون من سكويجر وآخرون. 1 نقدم بروتوكول مفصل لقياس مستويات الجلسرين بواسطة الأشعة فوق البنفسجية مرئية (أوف / فيس) الطيفي. الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لعزل بنجاح منصات الدهون الإربية قياسات ليبوليسيس للحصول على نتائج متسقة. بروتوكول يمكن وصفها لبطانات الدهون الإربية يمكن أن تمتد بسهولة لقياس تحلل الدهون في الأنسجة الأخرى.
Introduction
الأنسجة الدهنية تخزين الطاقة والدهون 2 والأكسدة الأحماض الدهنية هو مطلوب ل ثيرموجينيسيس 3 ، 4 . يتم تعبئتها الأحماض الدهنية تناولها من خلال الوجبات الغذائية جنبا إلى جنب مع أبوبروتينز إلى كيلومرونس وتسليمها إلى أنسجة مختلفة في الجسم عن طريق الدورة الدموية. على الرغم من أن معظم الخلايا في الجسم تخزين احتياطي من الطاقة، ومخازن الأنسجة الدهنية الطاقة الزائدة كما الدهون 5 ، 6 . يتم تنظيم انحلال الدهون في الأنسجة الدهنية من قبل العمليات المعقدة والتفاصيل الجزيئية لتحلل الدهون لا تزال غامضة 7 .
تحلل الدهون هو عملية يتم من خلالها تحلل الدهون الثلاثية (تغل) المخزنة في الأنسجة الدهنية لإنتاج الجلسرين والأحماض الدهنية (فا) من قبل الانزيم الدهني الدهون الدهنية (أتغل) 8 . التعديلات في تحلل الدهون القاعدية وتحفيز هو سمة مميزة للسمنة. بيتم تحلل الدهون الشحمية من قبل تفعيل أتغل 9 ، الذي يحول تغل إلى دياسيلغليسيرول (داغ)، التي تحلل في وقت لاحق إلى الجلسرين مونواسيل (ماغ). تنشيط الهرمونات الحساسة للهرمونات (هسل) عن طريق أدينيليل سيكليس ينشط أدينوسين أحادي (كامب) تعتمد البروتين كيناز A (يكا) التحفيز ويسبب تحلل الدهون. قياس تحلل الدهون، القاعدية وتحفيز، وبالتالي، من المهم لتحليل نشاط البروتينات المشاركة في هذه العملية. أيضا، كشف التنظيم الجزيئي لتحلل الدهون قد تكون مفيدة لتطوير استراتيجيات علاجية جديدة ضد السمنة 10 . وبما أن الجزيئات التي تحفز تحلل الدهون وأكسدة الأحماض الدهنية هي مرشحات محتملة لتخفيض الدهون المخزنة في المستودعات، فمن المهم استخدام مقايسة قوية لإعادة التكاثر.
وتشير البيانات المنشورة سابقا أن تفعيل البروتين TRPV1 أعرب في الأنسجة الدهنية البيضاء من قبل كاب تعزيز القاعديةو فسك (أدينيليل سيكليس المنشط) -حلقة تحلل الدهون في منصات الدهون الأربية 11 . وتشير البحوث السابقة أيضا إلى أن تفعيل طويل الأجل ل TRPV1 بواسطة كاب ينشط يكا 12 . منذ تفعيل يكا يحفز انحلال الدهون 13 ، 14 ، وقياس كل من القاعدية و يكا تحفيز تحلل الدهون في منصات الدهون الأربية معزولة عن الفئران غير سارية المفعول أو هفد (± كاب) بعد 32 أسبوعا من تغذية النظم الغذائية المعنية والتحقق من صحة دور TRPV1 تفعيل في تحلل الدهون.
توضح هذه المقالة طريقة فعالة لتحديد تحلل الدهون القاعدي وتحفيز. على الرغم من أن الطرق الأخرى التي توظف النظائر المشعة من الجلسرين ومملة عالية الأداء اللوني السائل أو كروماتوغرافيا الغاز / مطياف الكتلة للقياسات 15 ، 16 متاحة، وهذا الأسلوب يوفر أكثر مباشرة وبسيطة وفعالة من حيث التكلفةتقنية لتحديد تحلل الدهون في الأنسجة الدهنية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
جميع البروتوكولات تتبع المبادئ التوجيهية رعاية الحيوان من جامعة وايومنغ.
1. الحيوان الإسكان والتغذية
ملاحظة: ولدت الذكور الذكور البرية نوع الفئران (C57BL / 6) (سن 12-24 أسبوعا) في منشأة الحيوان البحوث وفقا للجنة رعاية واستخدام الحيوان المؤسسية (إاكوك) البروتوكولات المعتمدة.
- ابتداء من الأسبوع 6 من العمر، الفئران المنزل في مجموعات من أربعة في أقفاص منفصلة وتعيينها عشوائيا في مجموعات التغذية من الأمراض غير السارية أو هفد (± 0.01٪ كاب) حتى الأسبوع 38 من العمر.
ملاحظة: كاب هو ناهض البروتين قناة TRPV1 أعرب في الأنسجة الدهنية 11 ، 17 . مزيج كاب مع هفد في خلاط داخل غطاء محرك السيارة ونقل الخليط المخلوطة إلى علبة تحتوي صغيرة 1 في 2 أقسام. حافظ على الدرج داخل الفريزر -20 درجة مئوية. إزالة علبة تحتوي على هفد + كاب النظام الغذائي من الثلاجة بعد 24 ساعة وتخزينها في حاوية في -20 &# 176؛ C الفريزر حتى الاستخدام. - الفئران البيت في بيئة تسيطر عليها المناخ (22.8 ± 2.0 درجة مئوية، 45 - 50٪ الرطوبة) مع دورة 12/12 ضوء / الظلام مع الوصول إلى النظام الغذائي المعين والماء ليبيتوم .
- في نهاية 38 أسبوعا، تشريح الأنسجة الدهنية الأربية واستخدامها لتجارب يبوليسيس (أقسام 2-7).
2. إعداد الفئران للتجارب
- تخدير الفئران عن طريق حقن الكيتامين وخليط زيلازين (10 ملغ / كلغ و 80 ملغم / كغم من وزن الجسم، على التوالي). حقن 0.01 مل من الخليط / 10 غرام من وزن الجسم من الفأرة.
- تأكيد التخدير العميق من قبل قرصة أخمص قدميه ثابتة. إذا كان هناك رد فعل دواسة، واختبار الماوس مرة أخرى بعد 30 ثانية على الأقل.
- استخدام مرهم العين البيطري لمنع جفاف العينين أثناء التخدير. لا تترك الفئران غير المراقب خلال أي من الإجراءات.
- الموت ببطء الفئران عن طريق حقن جرعة عالية من الكيتامين وزيلازين حقن الخليط (10 ملغ / كلغ و 80 ملغم / كغم من وزن الجسم، على التوالي) ميكستوره (0.01 مل / 10 غرام من وزن الجسم) تليها خلع عنق الرحم.
ملاحظة: تمت الموافقة على هذا الأسلوب من القتل الرحيم من قبل إاكوك من جامعة وايومنغ.
3. عزل منصات الدهون الدهنية الأربية
- ضع الماوس (تغذية مع نسد أو هفد (± كاب) لمدة 32 أسبوعا) ملقاة على يسارها لهذا الإجراء.
ملاحظة: عن طريق وضع الماوس على الجانب الأيسر، فإن فورليمب اليسار واليسار هيندليمب يكون على منصة تشريح، في حين أن فوريليمب الحق والحق هيندليمب سوف تواجه بعيدا عن المنصة. - تعقيم سطح الجلد مع 2 بوصة 2 لوحة الشاش غارقة في حوالي 2.5 مل من الايثانول 70٪. جعل 2 - 3 ملم قطع الجانبية من خلال الجلد باستخدام مشرط للكشف عن الطبقة الدهنية الأساسية.
- جعل خفض 1 سم (اعتمادا على حجم الماوس) من خلال الجلد باستخدام مشرط تحت القفص الصدري مباشرة عبر السطح الظهري الانضمام إلى اثنين من الشقوق الجانبية.
- قشر رفرف الجلد عن طريق سحب بعنايةباستخدام ملقط معقم وترك وسادة تحت الجلد سليمة من خلال عدم قطع منصات الدهون. هذا هو لوحة الدهون الكذب تحت الجلد.
- تشريح لوحة الدهون بعناية من العضلات الكامنة وفافة باستخدام زوج من مقص. سحب لوحة الدهون كما يتم قطع من العضلات الكامنة.
ملاحظة: وزن وحجم منصات الدهون يعتمد على نوع من الفئران (نسد أو هفد (± كاب) -fed). - استخدام ملاقط لنقله إلى طبق بتري تحتوي على الفوسفات مخزنة المالحة (بس) حتى التجارب يبوليسيس، في درجة حرارة الغرفة (~ 15 دقيقة).
- عزل منصات الدهون من الجانب الأيمن من الماوس كما هو موضح في الخطوات 3.2-3.6.
4. بسال الجلسرين الافراج عن منصات الدهون الإبرية
- استخدام مقص حاد لقطع حوالي 20 ملغ من الأنسجة الدهنية في 5 إلى 8 قطع.
- احتضان قطع قطع من منصات الدهون الإربية في 200 ميكرولتر من وسط الحضانة (دولبيكو في تعديل إيجل المتوسطة (دمم) تحتوي على 2٪ من الأحماض الدهنيةخالية من ألبومين المصل البقري (بسا)) عند 37 درجة مئوية، و 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 60 دقيقة.
- جمع وسط الحضانة وتجميد في -80 درجة مئوية لتحليل الدهون.
ملاحظة: يتم استخدام قطع القطع لتحديد تركيز البروتين بعد استخراج الدهون. - نقل قطع قطع الدهون مع مساعدة من ملاقط في 1 مل من محلول الاستخلاص (الكلوروفورم: الميثانول (2: 1، الخامس / الخامس) و 1٪ حمض الخليك الجليدي) واحتضان لمدة 60 دقيقة عند 37 درجة مئوية تحت اهتزاز قوي في 100 دورة في الدقيقة. تجاهل حل استخراج الدهون.
ملاحظة: هذه الخطوة سوف استخراج الدهون من قطع القطع. تجاهل حل استخراج الدهون لأنها سوف تتداخل مع تقرير البروتين. - نقل الأنسجة (من الخطوة 4.2.2) باستخدام ملاقط في أنبوب ميكروفوج معقمة تحتوي على 500 ميكرولتر من محلول تحلل (0.3 N هيدروكسيد الصوديوم تحتوي على 0.1٪ كبريتات دوديسيل الصوديوم؛ سدز) واحتضان بين عشية وضحاها (12 ساعة) عند 55 درجة مئوية تحت الهز قوية عند 100 دورة في الدقيقة.
- جمع وسط الحضانة وتجميد في -80 درجة مئوية لتحليل الدهون.
- تحديد تركيز البروتين من الأنسجة (الخطوة 4.2.3) باستخدام حمض بيسينونينيك (بكا) كاشف و بسا كمعيار 18 .
- ذوبان الجليد المتوسطة المجمدة (الخطوة 4.2.1) على الجليد وتحديد محتوى الجلسرين من المتوسط باستخدام كاشف الجلسرين الحرة كما هو موضح في أقسام البروتوكول 6 و 7 6 .
- استقراء تركيز الجلسرين في عينات من منحنى القياسية تآمر باستخدام معايير الجلسرين 19 والتعبير عن تحلل الدهون كما نانوموليز الجلسرين في البروتين ملغ لكل ساعة 20 .
5. تحلل الدهون فسك تحفيز
- بريينكوبات حوالي 20 ملغ من لوحة الدهون الإربية (5 إلى 8 قطع قطعة) التي تم الحصول عليها من الأمراض غير السارية أو هفد (± كاب) في البرية نوع الماوس الماوس في 200 ميكرولتر دمم تحتوي على 2٪ حمض دهني حر بسا، 10 ميكرومتر فسك و 5 ميكرومتر ترياسسين C في 37 درجة مئوية في 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة لمدة 60 دقيقة.
- نقل قطع الأنسجة باستخدام ملاقط إلى وسيلة مماثلة واحتضان لمدة 60 دقيقة أخرى في 37 درجة مئوية، و 5٪ كو 2 و 95٪ الرطوبة. جمع وسط الحضانة وتخزينها في -80 درجة مئوية حتى الفحص يبوليسيس.
ملاحظة: تحفيز تحلل الدهون يسبب الإفراج السريع من الأحماض الدهنية والجلسرين في غضون 15 دقيقة، وهو الخطية خلال الساعة الأولى، والهضاب بعد ذلك. منذ معدل تحلل الدهون هو أعلى ومستقرة بين الساعة الأولى والثانية من تحفيز فسك، هذا البروتوكول قياس تحلل الدهون في حالة حفز بعد فترة الحضانة الثانية كما هو موضح سابقا 1 . لذلك، كل من الخطوات التجريبية (5.1 و 5.1.1) ضرورية.
6. إعداد كاشف الجلسرين الحرة
- إعادة كاشف الجلسرين 19 في 40 مل من الماء منزوع الأيونات في قنينة زجاجية العنبر الملونة، ووضع سدادة على قارورة وتخلط جيدا عن طريق عكس 10 مرات. لا تخلط عن طريق الاهتزاز.
- تخزين القارورة في 4 درجات مئوية داخل ثلاجة محمية من الضوء عن طريق تغطية القارورة تماما مع رقائق الألومنيوم.
- انتقل إلى إعداد معيار الجلسرين (القسم 7).
7. إعداد الجلسرين القياسية وتحديد محتوى الجلسرين
- جعل مخزون من 1 ملم عن طريق تمييع 35 ميكرولتر من الأسهم الموردة مع 65 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
ملاحظة: الشركة المصنعة الموردة الجلسرين القياسية المخزون هو 2.8 ملي الجلسرين. - خذ خمسة طول طول 1 سم كوفيتس ميثاكريليت القابل للتصرف. تسمية كوفيتس باستخدام علامة كما 0، 1.25، 2.5، 5 و 10 نمول القياسية.
- إضافة 0، 1.25، 2.5، 5 و 10 ميكرولتر من 1 ملم معيار الجلسرين إلى كوفيتس المسمى منها. تشكل حجم كل كوفيت إلى 10 ميكرولتر مع الماء منزوع الأيونات.
- جعل 1 إلى 10 التخفيف من جميع العينات (من الخطوة 4.4 أو 5.1.1) عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من العينة إلى 90 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات إلى أنابيب الطرد المركزي الجديدة قبل ميليتر 500 ميكرولتر. إضافة 10 ميكرولتر من العينات المخففة في كوفيتس المسمى مع رقم تعريف العينة المعنية.
- التبديل على الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف وتعيين الموجةطول إلى 540 نانومتر.
- دافئ كاشف الجلسرين مجانا لدرجة حرارة الغرفة عن طريق الحفاظ على قارورة (الخطوة 6.2) في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة.
- إعداد سلسلة من كوفيتس المسمى كما فارغة "0" نمول القياسية (الخطوة 7.3)، والمعايير (الخطوة 7.3) والعينات (الخطوة 7.4).
- إضافة 10 ميكرولتر من كل من معيار وعينة في كوفيت المسمى منها. استخدام "0" نمول القياسية فارغة.
- إضافة 0.8 مل من كاشف الجلسرين الحرة في كل كوفيت، التي تحتوي على معايير الجلسرين باستخدام ماصة 1 مل.
- تغطية كوفيت مع 1.5 سم مربع من البلاستيك مربع البارافين وتخلط محتويات عن طريق عكس كوفيت لمدة 3 مرات وتجنب جانبا في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقيقة.
- وضع كفيت في الأشعة فوق البنفسجية فيس الطيف وتسجيل الامتصاصية (540 نانومتر الطول الموجي).
- رسم المنحنى القياسي باستخدام تركيزات المعايير (نمول) في المحور س و الامتصاصية المسجلة في المحور ص.
- حساب تركيز غليسيرول في العينات (نمول) بالاستقراء باستخدام المنحنى القياسي المرسوم في الخطوة 7.12.
- مضاعفة تركيز العينات (نمول / كوفيت) مع عامل التخفيف 10 (راجع الخطوة 7.4) و 20 (إجمالي حجم)
- تقسيم تركيز الجلسرين في كل عينة (الخطوة 7.13) من قبل ملغ من البروتين يحسب بواسطة طريقة بكا.
ملاحظة: منذ يتم تحضين عينات وسادة الدهون الإربية لمدة 60 دقيقة، تمثل النتائج كما نمول من الجلسرين / ملغ بروتين / ساعة.
- جعل مخزون من 1 ملم عن طريق تمييع 35 ميكرولتر من الأسهم الموردة مع 65 ميكرولتر من الماء منزوع الأيونات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لتقييم تأثير كاب على التحلل الشحمي القاعدية وتحفيز، ويقيس هذا البحث تحلل الدهون في الأربية الدهون الدهنية منصات معزولة من نسد أو هفد (± كاب) -fed نوع البرية الفئران. نتائج ممثل لالقاعدية و فسك تحفيز تحلل الدهون لمنصات الدهون الأربية وتعطى في الجدول الأول . القاعدية و فسك تحفيز الإفراج الجلسرين في وجود ترياسين C، الذي يمنع أسيل كوا سينثيتاس ويمنع تجديد تغل. كما هو مبين في الشكل 1 ، هفد قمع تحلل الدهون فسك تحفيز، وزيادة كاب كل من تحلل الدهون القاعدية و فسك. تم استخدام ترياسسين C لمنع تثبيط تغل من الجلسرين والأحماض الدهنية 11 . يتم التعبير عن جميع البيانات كوسيلة ± سيم يتم تحليل المقارنات بين المجموعات باستخدام اتجاه واحد أنوفا والتحليلات بعد آخر أجريت باستخدام اختبار تي تي الطالب. يتم تعيين أحجام العينة لتحديد ما إذا كانت القيمة المتوسطة لمتغير النتيجة في مجموعة واحدة تختلف اختلافا كبيرا عن تلك الموجودة في مجموعة أخرى. وتعتبر قيمة p <0.05 ذات دلالة إحصائية.
الشكل 1: كاب الزيادات الأساسية و فسك حفز الجلسرين الإفراج في منصات الدهون الإربية. وتمثل الرسوم البيانية الشريطية المتوسط ± سيم من القاعدية و فسك (10 ميكرومتر) - الافراج عن الجلسرين المحاكاة (نمول / ملغ بروتين / ساعة) في منصات الدهون الإربية معزولة عن الفئران البرية من الأمراض غير السارية أو هفد (± كاب). ** يمثل دلالة إحصائية لقيمة p <0.05 ل n = 6. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
5 / 55625fig2.jpg "/>
الشكل 2: التحلل المائي للدهون الثلاثية (تغل) النتائج في توليد الأحماض الدهنية الحرة (ففا) والغليسرين. ففا يخضع الميتوكوندريا β الأكسدة. هذا، جنبا إلى جنب مع أوبريغولاتيون من البروتين اقتران 1 (أوكب-1) يحفز توليد الحرارة. يقاس إطلاق الجلسرين عن طريق بروتوكول وصفها في هذه المادة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| يبوليسا (نيموليز الجلسرين / ملغ من البروتين / ساعة) | الأمراض غير المعدية (ن = 6) | HFD (ن = 6) | هفد + كاب (ن = 6) |
| قاعدي | 16.22 ± 1.28 | 17.16 ± 1.48 | 52.07 ± 2.66 |
| فسك حفز (مع ترياسسين C) | 54.88 ± 3.27 | 41.23 ± 4.43 | 72.04 ± 4.16 |
الجدول 1: تأثير كاب على البازل و فسك تحفيز انحلال الدهون في منصات الدهون الأربية. يعني القاعدية و فسك حفز الإفراج الجلسرين ± سيم قياسها في الأنسجة الدهنية الدهنية الأربية التي تم الحصول عليها من الأمراض غير السارية، هفد أو هفد + كاب تغذية البرية نوع الفئران.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يتم تحفيز عملية انهيار تغل في الجلسرين والأحماض الدهنية من قبل أتغل 9 خلال تحلل الدهون القاعدية ومنسق من قبل مجموعة من البروتينات بما في ذلك تفعيل مسار أدنيليل سيكليس / يكا المعتمدة خلال تحلل الدهون تحفيز 21 ، 22 ، 23 . تعزيز يبوليسيس يزيد من مستويات البلازما من الأحماض الدهنية للنقل واستخدام الطاقة 24 . يتم أخذ الأحماض الدهنية من قبل الميتوكوندريا كما أسيتيل كوا، والذي يستخدم لإنتاج الطاقة.
ويمكن قياس درجة ومدى تحلل الدهون بكفاءة من خلال الإفراج الجلسرين من الأنسجة الدهنية ( الجدول 1 والشكل 1 ). التحلل المائي ل تغل ينتج الأحماض الدهنية والجلسرين. وأظهرت الأبحاث السابقة أن المكملات الغذائية من كاب تعزيز كبير في القاعدية وكذلك فسك حفز المنشار الجلسرينه من منصات الأربية والبني الدهون 11 ، 17 . زيادة إنتاج الأحماض الدهنية من تحلل الدهون المعززة يمكن أن تكون بمثابة تغذية لإنتاج الحرارة و توليد الحرارة منذ كاب أيضا زيادة كبيرة في التعبير عن أوكب-1 الميتوكوندريا في منصات الدهون الإربية. واتساقا مع هذا المفهوم، تشير البحوث السابقة إلى أن كاب تعزيز التعبير عن البيروكسيزوم التكاثر ألفا مستقبلات تنشيط (PPARα) في منصات الدهون الأربية، الذي يلعب دورا حاسما في الأكسدة الأحماض الدهنية الميتوكوندريا وفي أوبريغولاتيون النسخي من أوكب-1 25 ، 26 ، 27 . ونتيجة لذلك، وزادت كاب أيضا النشاط الأيضي، وإنتاج الحرارة ونفقات الطاقة في الفئران تغذية هفد 28 ، 29 . وعلاوة على ذلك، هفد تغذية قمع تحفيز تحلل الدهون في حين كاب زيادة القاعدية و فسك حفز يكا-ديبندينتي يبوليسيس وكذلك تعزيز حساسية الأنسولين 30 . لذلك، كما هو موضح في النموذج في الشكل 2 ، فمن المعقول أن تفسر أن كاب يزيد الأساسي وتحفيز تحلل الدهون دون التسبب في مقاومة الانسولين كما يتم حرق الدهون الزائدة لإنتاج الحرارة عن طريق الميتوكوندريا أوكب-1 أوبريغولاتيون.
توضح هذه المقالة طريقة قياس إطلاق الجلسرين من الأنسجة الدهنية البيضاء. على الرغم من أن العديد من الطرق باستخدام النظائر مستقرة من الجلسرين متوفرة، فإنها تتطلب إما عالية الأداء اللوني السائل أو الكروماتوغرافيا الغاز / مطياف الكتلة للقياسات 15 ، 16 . أيضا، ترتبط القياسات الجلسرين الراسخ الراديو مع عدم خصوصية 31 . وتشمل الطرق البديلة تحديد مرنا ومستويات البروتين من ليباسيس والبروتينات التنظيمية تشارك في تحلل الدهون. طرق الألوان هي أيضا متاحة ل dإترمين تركيز الأحماض الدهنية سلسلة طويلة في الدورة الدموية. الطريقة الموصوفة هنا فعالة جدا في تحليل الإفراج الجلسرين من الأنسجة الدهنية كما يمكن القيام به باستخدام قارئ لوحة قادرة على قياس مضان والامتصاصية. كما أن الطريقة التحليلية المبسطة لإطلاق الجلسرين الموصوفة في هذه المقالة توفر استقرارا ودقة أفضل 32 .
يجب أن تمارس إجراءات التشغيل القياسية لأن هذا الأسلوب ينطوي على التقنيات الجراحية لعزل منصات الدهون. يوصي هذا البروتوكول استخدام بسا الدهون الحرة. وهذا قد يسبب تشكيل فقاعة الهواء، والتي سوف تتداخل مع القراءة الامتصاصية. لذلك، ينبغي توخي الحذر أثناء التعامل مع العينات لمنع فقاعات الهواء. وينبغي اتخاذ الاحتياطات بعدم هز أو عكس العينات خلال علاج بسا، ما لم يوصى بهذه الخطوة في البروتوكول. أيضا، خطوة استخراج الدهون من الدهون الأربية أمر بالغ الأهمية لأن وجود الدهون سوف تتداخل الطرافةساعة الأربية الدهنية تقرير البروتين الأنسجة. بالإضافة إلى ذلك، أثناء إعداد معايير الجلسرين، فمن المهم لخلط محتويات عن طريق انقلاب وليس يهز القارورة.
الطريقة الموصوفة هنا يمكن استخدامها لعزل بنجاح منصات الدهون الإربية لعدة فحوصات بما في ذلك قياسات تحلل الدهون. بروتوكول ليبوليسيس الموصوفة لسادات الدهون الإربية يمكن بسهولة أن تمتد إلى قياس تحلل الدهون في الأنسجة الأخرى. هي الأمثل الطرق لجميع أنواع منصات الدهون، وكذلك برياديبوسيتس.
وباختصار، يصف هذا المقال طريقة لقياس القاعدية و فسك تحفيز الإفراج الجلسرين في الأربية الدهون الدهنية منصات معزولة من الأمراض غير السارية أو هفد (± كاب) الفئران -fed. وتشير البيانات المقدمة إلى أن تفعيل TRPV1 بواسطة كاب زيادة القاعدية و فسك تحفيز يبوليسيس ومنع تراكم الدهون في الأنسجة الدهنية. وتظهر هذه البيانات دورا حاسما من البروتين TRPV1 في التنظيمn، بسبب، ليبوليسيس، إلى داخل، أبيض، شحمي، تيسو.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لديهم ما يكشف.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل جائزة أها رقم 15BGIA23250030، والمعهد الوطني للعلوم الطبية العامة للمعاهد الوطنية للصحة تحت الجائزة رقم 8P20 GM103432-12 وجامعة وايومنغ منحة كلية في المعونة ل بت.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S. 2nd, Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Sigma. Free Glycerol Reagent. , Available from: http://www.sigmaaldrich.com/content/dam/sigma-aldrich/docs/Sigma/Bulletin/f6428bul.pdf (2017).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
