Summary
このプロトコールは、正常飼料（NCD）または高脂肪食（HFD）+カプサイシン摂食野生型マウスから得られた鼠径脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂肪分解を決定する方法を記載する。脂肪分解の指標として、鼠径脂肪パッドからグリセロール放出を測定した。
Abstract
脂肪分解は、脂肪組織中にトリグリセリドとして貯蔵された脂質を加水分解してグリセロールおよび脂肪酸にするプロセスである。この記事では、正常食餌（NCD）、高脂肪食（HFD）または0.01を含む高脂肪食餌を与えた野生型マウスから単離した鼠蹊脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン（FSK）刺激脂肪分解の測定方法を記載するカプサイシン（CAP;一過性受容体ポテンシャルバニロイドサブファミリー1（TRPV1）アゴニスト）を32週間投与した。 生体外脂肪分解を実施するために本明細書に記載される方法は、Schweiger et al。 1 UV-Visible（UV / Vis）分光光度法によりグリセロールレベルを測定するための詳細なプロトコールを提示します。本明細書に記載の方法は、脂肪分解測定のための鼠径脂肪パッドを首尾よく分離して、一貫した結果を得るために使用することができる。鼠径脂肪パッドについて記載されたプロトコルは、他の組織における脂肪分解を測定するために容易に拡張することができる。
Introduction
fat 2及び脂肪酸酸化が熱発生3,4のために必要とされるような脂肪組織は、エネルギーを蓄えます。ダイエットによって摂取された脂肪酸は、アポ蛋白質と共にキロミクロンにパッケージングされ、血液循環によって身体の異なる組織に送達される。本体ストアにおけるほとんどの細胞fat 5、6、エネルギーの予備、脂肪組織を格納する余分なエネルギーありません。脂肪組織における脂質分解は複雑なプロセスによって調節され、脂肪分解の分子的詳細はまだ曖昧なままである7 。
脂肪分解は、脂肪組織に貯蔵されたトリグリセリド（TGL）を加水分解して、酵素脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL） 8によってグリセロールおよび脂肪酸（FA）を生成するプロセスである。基礎および刺激脂肪分解における変化は、肥満の特徴である。 The basal脂肪分解は、TGLをジアシルグリセロール（DAG）に変換し、続いてモノアシルグリセロール（MAG）に加水分解するATGL活性化9によって調節される。アデニリルシクラーゼを介して、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）の活性化は、環状アデノシン一リン酸（cAMP）依存性プロテインキナーゼA（PKA）の刺激を活性化し、脂肪分解を引き起こします。従って、このプロセスに関与するタンパク質の活性を分析するためには、脂肪分解、基礎および刺激の測定が重要である。また、脂肪分解の分子調節を解明することは、肥満に対する新規な治療戦略を開発するために有益であり得る10 。脂肪分解および脂肪酸酸化を刺激する分子は、貯蔵所に貯蔵される脂肪を減少させる潜在的な候補であるので、再現性のために頑強なアッセイを用いることが重要である。
以前に公開されたデータは、CAPによる白色脂肪組織で発現されるTRPV1タンパク質の活性化が、および鼠径脂肪パッドにおけるFSK（アデニリルシクラーゼ活性化剤）刺激脂肪分解11 。前の研究はまた、CAPによるTRPV1の長期的な活性化はPKA 12を活性化させることを示唆しています。 PKAの活性化は、TRPV1の役割を検証するNCDまたは（CAP±）HFDそれぞれの食餌を給餌の32週間後-fedマウスから単離した鼠径脂肪パッドにおける基礎とPKA依存性刺激脂肪分解の両方を測定する脂肪分解13,14を刺激するので脂肪分解における活性化。
この記事では、基礎脂質分解および刺激脂肪分解を効率的に測定する方法について説明します。測定15のためのグリセロールおよび退屈な高速液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー/質量分析法の放射性同位体を使用する他の方法が、16が利用可能であり、この方法は、より直接的簡単かつコスト効率を提供します脂肪組織における脂肪分解を決定する技術。
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Protocol
すべてのプロトコルは、ワイオミング大学の動物保護指針に従っています。
1.動物の住宅と給餌
注：成体雄性野生型マウス（C57BL / 6）（12〜24週齢）は、施設動物実験および使用委員会（IACUC）承認プロトコルに従って研究動物施設で飼育した。
- 6週目から開始して、4匹のグループのマウスを別々のケージに収容し、38才までNCDまたはHFDの摂食群（±0.01％CAP）にランダムに割り当てる。
注：CAPは、脂肪組織11、17で表さTRPV1チャネルタンパク質のアゴニストです。フード内部ブレンダーにHFDを有するキャップを混合し、2つのパーティションに小さい1を含有するトレイにブレンドした混合物を移します。トレイを-20℃の冷凍庫の中に保管してください。 24時間後にHFD + CAP飼料を入れたトレイを冷凍庫から取り出し、-20＆＃176;冷凍庫を使用するまで。 - （22.8±2.0℃、湿度45〜50％）、12/12ライト/ダークサイクルで、指定食および水を自由に使用できるハウスマウス。
- 38週の終わりに、鼠径脂肪組織を切開し、脂肪分解実験に使用する（セクション2-7）。
2.実験のためのマウスの準備
- ケタミンとキシラジンの混合物（それぞれ10mg / kgおよび80mg / kg体重）を注射することによってマウスを麻酔する。混合物0.01mL /マウス体重10gを注射する。
- 徹底的なつま先で深い麻酔を確認する。ペダル・リフレックスがある場合は、少なくとも30秒後に再度マウスをテストしてください。
- 麻酔中の眼の乾燥を防ぐために、獣眼軟膏を使用する。いずれの処置中もマウスを放置しないでください。
- 高用量のケタミンおよびキシラジン混合物注射（それぞれ10mg / kgおよび80mg / kg体重）の混合物を注射することによってマウスを安楽死させるe（0.01ml / 10g体重）、続いて頚部脱臼。
注：安楽死のこの方法は、ワイオミング大学のIACUCによって承認されています。
3.腹腔脂肪脂肪パッドの分離
- 手順のために左に横たわるマウス（NCDまたはHFD（±CAP）を32週間与えた）を置く。
注：マウスを左に置くことによって、左前肢および左後肢は解剖用プラットフォーム上にあり、右前肢および右後肢はプラットフォームから離れている。 - 70％エタノール約2.5mLのに浸し2インチ2ガーゼパッドで皮膚表面を殺菌。下にある脂肪層を明らかにするために、メスを使用して皮膚を通して2〜3mmの側方切開を行う。
- 2つの外側の切開を結合する背側表面を横切って胸郭の真下にある外科用メスを使用して、皮膚を通して1cmの切断（マウスのサイズに依存する）を行う。
- 慎重にドラッグして皮弁を剥がす滅菌鉗子を使用し、脂肪パッドを切断しないことによって皮下パッドをそのまま残す。これは、皮膚の下に横たわっている太ったパッドです。
- 脂肪のパッドを下の筋肉と筋膜から慎重に解剖し、はさみを使用してください。下の筋肉からカットされて脂肪パッドを引き出します。
注：脂肪パッドの重量とサイズは、マウスの種類（NCDまたはHFD（±CAP）が授与された）に依存します。 - 室温（〜15分）で脂肪分解実験までリン酸緩衝生理食塩水（PBS）を含むペトリ皿にピンセットを移す。
- ステップ3.2-3.6で説明したように、脂肪パッドをマウスの右側から分離します。
4.鼠径脂肪パッドからの基礎グリセロール放出
- シャープなはさみを使用して約20 mgの脂肪組織を5〜8個に切断します。
- 鼠径脂肪パッドのカットピースを200μLのインキュベーション培地（2％脂肪酸を含むダルベッコ変法イーゲル培地（DMEM））にインキュベートする。37℃、5％CO 2および95％湿度で60分間、無血清ウシ血清アルブミン（BSA）中で培養した。
- インキュベーション培地を回収し、脂肪分解アッセイのために-80℃で凍結する。
注：切片は、脂質抽出後のタンパク質濃度の測定に使用されます。 - 切断された脂肪片をピンセットを用いて1 mLの抽出溶液（クロロホルム：メタノール（2：1、v / v）および1％氷酢酸）に移し、100℃で激しく振盪しながら37℃で60分間インキュベートするrpm。脂肪抽出溶液を捨てる。
注：この手順は、カットピースから脂肪を抽出します。脂肪抽出溶液はタンパク質の測定を妨げるため、廃棄してください。 - 500μLの溶解液（0.1％ドデシル硫酸ナトリウムを含有する0.3N NaOH; SDS）を含有する滅菌した微量遠心管にピンセットを用いて組織を移し（4.2.2）、激しく振盪しながら55℃で一晩インキュベートする100rpmで測定した。
- インキュベーション培地を回収し、脂肪分解アッセイのために-80℃で凍結する。
- 標準18としてビシンコニン酸（BCA）試薬及びBSAを用いて組織のタンパク質濃度（ステップ4.2.3）を決定します。
- 氷上で凍結媒体（ステップ4.2.1）を解凍し、プロトコルセクション6及び7 6に記載したように遊離グリセロール試薬を用いて培地のグリセロール含量を決定します。
- 標準曲線から試料中のグリセロールの濃度を外挿するグリセロール標準19およびh 20当たりナノモルグリセロール当たりmgタンパク質として明示脂肪分解を使用してプロットしました。
FSK刺激脂肪分解
- 2％の脂肪酸を含まないBSA、10μMのFSKおよび5μMのトライアクシンCを含有する200μLのDMEM中、NCDまたはHFD（±CAP）を与えた野生型マウスから得られた約20mgの鼠径脂肪パッド（5〜8切片）を、 5％CO 2および湿度95％で37℃で60分間インキュベートした。
- 同じ培地にピンセットを使用して組織片を移し、37℃、5％CO 2および95％湿度でさらに60分間インキュベートする。インキュベーション培地を回収し、脂肪分解アッセイまで-80℃で保存する。
注：脂肪分解の刺激は、脂肪酸およびグリセロールの急速な放出を15分以内に引き起こし、これは最初の1時間の間は直線的であり、その後は平坦化する。誘導脂肪分解の速度はFSK刺激の第一及び第二の時間の間に高く、安定しているので、このプロトコルは、以前に1記載したように第2のインキュベーション期間後、刺激状態における脂肪分解を測定しました。したがって、実験ステップ（5.1および5.1.1）の両方が必要である。
6.遊離グリセロール試薬の調製
- 琥珀色のガラスバイアル中で40mLの脱イオン水中にグリセロール試薬19を再構成し、バイアルにストッパーを置き、10回反転させてよく混合する。振り混ぜはしないでください。
- バイアル瓶をアルミホイルで完全に覆うことによって、光から保護された冷蔵庫の中に4℃で保存します。
- グリセロール標準液の調製（セクション7）に進んでください。
7.グリセロール標準の調製およびグリセロール含有量の測定
- 35μLの供給ストックを65μLの脱イオン水で希釈して1mMのストックを調製する。
注：製造業者が供給するグリセロール標準品は2.8mMグリセロールです。 - 1cmの経路長の使い捨てメタクリレートキュベットを5本取る。マーカーを0,1.25,2.5,5,10 nmolの標準としてキュベットに標識する。
- 0mM、1.25mM、2.5mM、5μLおよび10μLの1mMグリセロール標準液をそれぞれの標識化キュベットに加える。脱イオン水で各キュベットの容量を10μLにします。
- 10μLのサンプルを90μLの脱イオン水に新鮮な500μLの前標識遠心チューブに加えることにより、すべてのサンプル（ステップ4.4または5.1.1）の1〜10倍希釈を行います。各サンプル識別番号でラベルされたキュベットに10μLの希釈サンプルを加えます。
- UV-VIS分光光度計のスイッチを入れ、波を設定します長さ〜540nm。
- バイアル（ステップ6.2）を室温で15分間保持することにより遊離グリセロール試薬を室温に温める。
- ブランク「0」nmol標準（ステップ7.3）、標準（ステップ7.3）およびサンプル（ステップ7.4）として一連の標識キュベットを設定する。
- スタンダードとサンプルのそれぞれ10μLをそれぞれの標識キュベットに加えます。ブランクとして "0" nmolスタンダードを使用してください。
- 1mLのピペットを用いてグリセロール標準を含有する各キュベットに0.8mLの遊離グリセロール試薬を加える。
- キュベットを1.5cm角のプラスチックパラフィンフィルムで覆い、キュベットを3回反転させて内容物を混合し、室温で10分間放置する。
- キュベットをUV-VIS分光光度計に置き、吸光度（波長540 nm）を記録する。
- X軸の標準濃度（nmol）およびY軸の記録吸光度を用いて標準曲線をプロットします。
- glの濃度を計算する（7.12）でプロットされた検量線を用いて外挿により試料中のγ-イセノールを定量する（nmol）。
- 希釈倍率10（ステップ7.4参照）および20（全容積）でサンプルの濃度（nmol /キュベット）を掛け、
- BCA法で計算したタンパク質mgで、各サンプルのグリセロール濃度を除算する（ステップ7.13）。
注：鼠径脂肪パッドのサンプルは60分間インキュベートされているので、nmolのグリセロール/ mg蛋白質/ hとして結果を表します。
- 35μLの供給ストックを65μLの脱イオン水で希釈して1mMのストックを調製する。
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Representative Results
基礎および刺激脂肪分解に対するCAPの効果を評価するために、本研究では、NCDまたはHFD（±CAP）飼育野生型マウスから単離された鼠蹊脂肪細胞の脂質分解を測定した。鼠径脂肪パッドの基礎およびFSK刺激脂肪分解の代表的な結果を表Iに示す 。アシルcoAシンテターゼを阻害し、TGLの再生を妨げるトリアクシンCの存在下での基礎およびFSK刺激グリセロール放出。 図1に示すように、HFDはFSK刺激脂肪分解を抑制し、CAPは基礎およびFSK刺激脂肪分解の両方を増加させた。トリアクシンCは、グリセロールおよび脂肪酸11からTGLの再生を阻害するために使用しました。全てのデータを平均±SEMとして表す。群間の比較を一方向ANOVAを用いて分析し、 ポストホック分析をスチューデントt検定を用いて行った。サンプルサイズが設定されていますあるグループのアウトカム変数の平均値が他のグループのアウトカム変数の平均値と著しく異なるかどうかを判断する。 p-値<0.05は統計的に有意であると考えられる。
図1：CAPは、鼠径脂肪パッドにおける基礎およびFSK刺激性のグリセロール放出を増加させる。棒グラフは、NCDまたはHFD（±CAP）を与えた野生型マウスから単離した鼠蹊脂肪パッドにおける基底およびFSK（10μM）刺激グリセロール放出（nmol / mgタンパク質/時間）の平均±SEMを表す。 ** n = 6に対するp値<0.05の統計的有意性を表す。この図のより大きなバージョンを見るには、ここをクリックしてください。
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図2：トリグリセリド（TGL）の加水分解は、遊離脂肪酸（FFA）およびグリセロールの生成をもたらす。 FFAはミトコンドリアβ酸化を受ける。これは、脱共役タンパク質1（UCP-1）のアップレギュレーションとともに、熱産生を刺激する。グリセロールの放出は、この論文に記載されたプロトコールによって測定される。 この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。
| 脂質分解 （ナノモルグリセロール/タンパク質mg / h） | NCD （n = 6） | HFD （n = 6） | HFD + CAP （n = 6） |
| 基礎 | 16.22±1.28 | 17.16±1.48 | 52.07±2.66 |
| FSK刺激 （トライアックCを含む） | 54.88±3.27 | 41.23±4.43 | 72.04±4.16 |
表1：腹腔内脂肪パッドにおける基礎およびFSK刺激による脂肪分解に対するCAPの影響。 NCD、HFDまたはHFD + CAP摂食野生型マウスから得られた鼠径脂肪脂肪組織で測定した平均基礎およびFSK刺激グリセロール放出±SEM。
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Discussion
グリセロールと脂肪酸にTGLの破壊プロセスは、基礎脂肪分解中ATGL 9によって触媒および誘導脂肪分解21、22、23間にアデニリルシクラーゼ/ PKA依存性経路の活性化を含むタンパク質のアレイによって調整されます。脂肪分解の強化は、輸送およびエネルギー使用のための血漿中の血漿レベルを増加させる24 。脂肪酸はミトコンドリアによってエネルギーを生成するために使用されるアセチルCoAとして取り込まれる。
脂肪分解の程度および程度は、脂肪組織からのグリセロール放出によって効率的に測定することができる（ 表1および図1 ）。 TGLの加水分解は、脂肪酸およびグリセロールを生成する。以前の研究は、CAPの栄養補給により、FSK刺激されたグリセロール放出物だけでなく、鼠径部および褐色脂肪パッド11、17から電子。脂肪の増強による脂肪酸の増加した産生は、鼠径部脂肪パッドにおけるミトコンドリアUCP-1の発現を有意に増加させたので、熱および熱発生を生じるための飼料として役立つ可能性がある。この概念に一致して、以前の研究では、CAPはミトコンドリアの脂肪酸酸化にとUCP-1 25の転写アップレギュレーションに重要な役割を果たしている鼠径部脂肪パッドにおけるペルオキシソーム増殖因子活性化受容体α（PPARα）の発現を増強することを示唆している26 、 27 。したがって、CAPはまた、HFD-給餌マウス28、29で代謝活性、熱産生及びエネルギー消費を増加させました。さらに、HFD供給は刺激された脂肪分解を抑制し、CAPは基底およびFSK刺激PKA依存性を増加させた脂肪分解およびインスリン感受性の増強30 。したがって、 図2のモデルで説明したように、ミトコンドリアUCP-1アップレギュレーションによって余剰脂肪が燃焼して熱を生成するため、CAPはインスリン抵抗性を引き起こさずに基礎脂質分解および刺激脂肪分解を増加させると解釈することは妥当である。
この記事では、白色脂肪組織からのグリセロール放出を測定する方法について説明します。グリセロールの安定同位体を用いて、いくつかの方法が利用可能であるが、それらは測定値15、16のための高速液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー/質量分析法のいずれかを必要とします。また、グリセロールラジオトレーサ測定値は、非特異性31に関連する。代わりの方法は、脂肪分解に関与するリパーゼおよび調節タンパク質のmRNAおよびタンパク質レベルを決定することを含む。比色法はまた、d循環中の長鎖脂肪酸の濃度を決定する。ここに記載された方法は、蛍光および吸光度測定が可能なプレートリーダーを用いて行うことができるので、脂肪組織からのグリセロール放出を分析するのに非常に効率的である。また、この記事に記載されているグリセロールの簡便な分析方法は、安定性と精度が向上しています32 。
標準的な操作手順は、脂肪パッドを隔離する外科的技術を伴うため、実施する必要があります。このプロトコルは、無脂肪BSAの使用を推奨しています。これは、気泡の形成を引き起こし、吸光度の読み取りを妨げる可能性があります。したがって、気泡を防ぐためにサンプルを扱う際には注意が必要です。このような手順がプロトコールで推奨されている場合を除き、BSAの処理中にサンプルを振ったり反転したりしないように注意する必要があります。また、脂肪の存在が気分を妨げるので、鼠蹊脂肪からの脂肪抽出工程は重要である鼠径脂肪組織タンパク質の測定。さらに、グリセロール標準の調製中に、内容物を反転させて混合し、バイアルを振ってはならないことが重要である。
本明細書に記載の方法は、脂肪分解測定を含むいくつかのアッセイのために鼠径脂肪パッドを首尾よく分離するために使用することができる。鼠径脂肪パッドについて記載された脂肪分解プロトコルは、他の組織における脂肪分解の測定に容易に拡張することができる。この方法は、脂肪細胞のすべての種類、および前脂肪細胞に最適化されています。
要約すると、この記事では、NCDまたはHFD（±CAP）を投与したマウスから単離した鼠径脂肪脂肪の基底およびFSK刺激グリセロール放出を測定する方法について説明します。提示されたデータは、CAPによるTRPV1活性化が、基礎およびFSK刺激脂肪分解を増加させ、脂肪組織における脂質の蓄積を妨げることを示唆している。これらのデータは、TRPV1タンパク質の調節に重要な役割を示す白色脂肪組織における脂肪分解が起こる。
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Disclosures
著者は何も開示することはない。
Acknowledgments
この研究は、AH賞第15BGIA23250030号、国立医学総合研究所NIHの受賞番号8P20 GM103432-12およびワイオミング大学助成金助成金BTの支援を受けて行われました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
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