腹腔脂肪脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂質測定の測定
Summary
このプロトコールは、正常飼料（NCD）または高脂肪食（HFD）+カプサイシン摂食野生型マウスから得られた鼠径脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン刺激脂肪分解を決定する方法を記載する。脂肪分解の指標として、鼠径脂肪パッドからグリセロール放出を測定した。
Abstract
脂肪分解は、脂肪組織中にトリグリセリドとして貯蔵された脂質を加水分解してグリセロールおよび脂肪酸にするプロセスである。この記事では、正常食餌（NCD）、高脂肪食（HFD）または0.01を含む高脂肪食餌を与えた野生型マウスから単離した鼠蹊脂肪パッドにおける基礎およびフォルスコリン（FSK）刺激脂肪分解の測定方法を記載するカプサイシン（CAP;一過性受容体ポテンシャルバニロイドサブファミリー1（TRPV1）アゴニスト）を32週間投与した。 生体外脂肪分解を実施するために本明細書に記載される方法は、Schweiger et al。 1 UV-Visible（UV / Vis）分光光度法によりグリセロールレベルを測定するための詳細なプロトコールを提示します。本明細書に記載の方法は、脂肪分解測定のための鼠径脂肪パッドを首尾よく分離して、一貫した結果を得るために使用することができる。鼠径脂肪パッドについて記載されたプロトコルは、他の組織における脂肪分解を測定するために容易に拡張することができる。
Introduction
fat 2及び脂肪酸酸化が熱発生3,4のために必要とされるような脂肪組織は、エネルギーを蓄えます。ダイエットによって摂取された脂肪酸は、アポ蛋白質と共にキロミクロンにパッケージングされ、血液循環によって身体の異なる組織に送達される。本体ストアにおけるほとんどの細胞fat 5、6、エネルギーの予備、脂肪組織を格納する余分なエネルギーありません。脂肪組織における脂質分解は複雑なプロセスによって調節され、脂肪分解の分子的詳細はまだ曖昧なままである7 。
脂肪分解は、脂肪組織に貯蔵されたトリグリセリド（TGL）を加水分解して、酵素脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL） 8によってグリセロールおよび脂肪酸（FA）を生成するプロセスである。基礎および刺激脂肪分解における変化は、肥満の特徴である。 The basal脂肪分解は、TGLをジアシルグリセロール（DAG）に変換し、続いてモノアシルグリセロール（MAG）に加水分解するATGL活性化9によって調節される。アデニリルシクラーゼを介して、ホルモン感受性リパーゼ（HSL）の活性化は、環状アデノシン一リン酸（cAMP）依存性プロテインキナーゼA（PKA）の刺激を活性化し、脂肪分解を引き起こします。従って、このプロセスに関与するタンパク質の活性を分析するためには、脂肪分解、基礎および刺激の測定が重要である。また、脂肪分解の分子調節を解明することは、肥満に対する新規な治療戦略を開発するために有益であり得る10 。脂肪分解および脂肪酸酸化を刺激する分子は、貯蔵所に貯蔵される脂肪を減少させる潜在的な候補であるので、再現性のために頑強なアッセイを用いることが重要である。
以前に公開されたデータは、CAPによる白色脂肪組織で発現されるTRPV1タンパク質の活性化が、および鼠径脂肪パッドにおけるFSK（アデニリルシクラーゼ活性化剤）刺激脂肪分解11 。前の研究はまた、CAPによるTRPV1の長期的な活性化はPKA 12を活性化させることを示唆しています。 PKAの活性化は、TRPV1の役割を検証するNCDまたは（CAP±）HFDそれぞれの食餌を給餌の32週間後-fedマウスから単離した鼠径脂肪パッドにおける基礎とPKA依存性刺激脂肪分解の両方を測定する脂肪分解13,14を刺激するので脂肪分解における活性化。
この記事では、基礎脂質分解および刺激脂肪分解を効率的に測定する方法について説明します。測定15のためのグリセロールおよび退屈な高速液体クロマトグラフィーまたはガスクロマトグラフィー/質量分析法の放射性同位体を使用する他の方法が、16が利用可能であり、この方法は、より直接的簡単かつコスト効率を提供します脂肪組織における脂肪分解を決定する技術。
Protocol
Representative Results
Discussion
グリセロールと脂肪酸にTGLの破壊プロセスは、基礎脂肪分解中ATGL 9によって触媒および誘導脂肪分解21、22、23間にアデニリルシクラーゼ/ PKA依存性経路の活性化を含むタンパク質のアレイによって調整されます。脂肪分解の強化は、輸送およびエネルギー使用のための血漿中の血漿レベルを増加させる<sup…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、AH賞第15BGIA23250030号、国立医学総合研究所NIHの受賞番号8P20 GM103432-12およびワイオミング大学助成金助成金BTの支援を受けて行われました。
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
References
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Coelho, M., Oliveira, T., Fernandes, R. Biochemistry of adipose tissue: an endocrine organ. Arch Med Sci. 9 (2), 191-200 (2013).
- Richard, D., Picard, F. Brown fat biology and thermogenesis. Front Biosci (Landmark Ed). 16, 1233-1260 (2011).
- Barquissau, V., et al. White-to-brite conversion in human adipocytes promotes metabolic reprogramming towards fatty acid anabolic and catabolic pathways. Mol Metab. 5 (5), 352-365 (2016).
- Rodriguez, A., Ezquerro, S., Mendez-Gimenez, L., Becerril, S., Fruhbeck, G. Revisiting the adipocyte: a model for integration of cytokine signaling in the regulation of energy metabolism. Am J Physiol Endocrinol Metab. 309 (8), E691-E714 (2015).
- Giordano, A., Smorlesi, A., Frontini, A., Barbatelli, G., Cinti, S. White, brown and pink adipocytes: the extraordinary plasticity of the adipose organ. Eur J Endocrinol. 170 (5), R159-R171 (2014).
- Langin, D. Adipose tissue lipolysis as a metabolic pathway to define pharmacological strategies against obesity and the metabolic syndrome. Pharmacol Res. 53 (6), 482-491 (2006).
- Zimmermann, R., Lass, A., Haemmerle, G., Zechner, R. Fate of fat: the role of adipose triglyceride lipase in lipolysis. Biochim Biophys Acta. 1791 (6), 494-500 (2009).
- Miyoshi, H., Perfield, J. W., Obin, M. S., Greenberg, A. S. Adipose triglyceride lipase regulates basal lipolysis and lipid droplet size in adipocytes. J Cell Biochem. 105 (6), 1430-1436 (2008).
- Kolditz, C. I., Langin, D. Adipose tissue lipolysis. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 13 (4), 377-381 (2010).
- Baskaran, P., Krishnan, V., Ren, J., Thyagarajan, B. Capsaicin induces browning of white adipose tissue and counters obesity by activating TRPV1 channel-dependent mechanisms. Br J Pharmacol. 173 (15), 2369-2389 (2016).
- Yang, D., et al. Activation of TRPV1 by dietary capsaicin improves endothelium-dependent vasorelaxation and prevents hypertension. Cell Metab. 12 (2), 130-141 (2010).
- Ding, L., et al. Reduced lipolysis response to adipose afferent reflex involved in impaired activation of adrenoceptor-cAMP-PKA-hormone sensitive lipase pathway in obesity. Sci Rep. 6, 34374 (2016).
- Ohyama, K., et al. A combination of exercise and capsinoid supplementation additively suppresses diet-induced obesity by increasing energy expenditure in mice. Am J Physiol Endocrinol Metab. 308 (4), E315-E323 (2015).
- Beylot, M., Martin, C., Beaufrere, B., Riou, J. P., Mornex, R. Determination of steady state and nonsteady-state glycerol kinetics in humans using deuterium-labeled tracer. J Lipid Res. 28 (4), 414-422 (1987).
- Gilker, C. D., Pesola, G. R., Matthews, D. E. A mass spectrometric method for measuring glycerol levels and enrichments in plasma using 13C and 2H stable isotopic tracers. Anal Biochem. 205 (1), 172-178 (1992).
- Baskaran, P., et al. TRPV1 activation counters diet-induced obesity through sirtuin-1 activation and PRDM-16 deacetylation in brown adipose tissue. Int J Obes (Lond). , (2017).
- Smith, N. C., Fairbridge, N. A., Pallegar, N. K., Christian, S. L. Dynamic upregulation of CD24 in pre-adipocytes promotes adipogenesis. Adipocyte. 4 (2), 89-100 (2015).
- Schweiger, M., et al. Measurement of lipolysis. Methods Enzymol. 538, 171-193 (2014).
- Duncan, R. E., Ahmadian, M., Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Sul, H. S. Regulation of lipolysis in adipocytes. Annu Rev Nutr. 27, 79-101 (2007).
- Ahmadian, M., Duncan, R. E., Sul, H. S. The skinny on fat: lipolysis and fatty acid utilization in adipocytes. Trends Endocrinol Metab. 20 (9), 424-428 (2009).
- Jaworski, K., Sarkadi-Nagy, E., Duncan, R. E., Ahmadian, M., Sul, H. S. Regulation of triglyceride metabolism. IV. Hormonal regulation of lipolysis in adipose tissue. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 293 (1), G1-G4 (2007).
- Jeppesen, J., Kiens, B. Regulation and limitations to fatty acid oxidation during exercise. J Physiol. 590 (5), 1059-1068 (2012).
- Nakamura, M. T., Yudell, B. E., Loor, J. J. Regulation of energy metabolism by long-chain fatty acids. Prog Lipid Res. 53, 124-144 (2014).
- Murray, A. J., Panagia, M., Hauton, D., Gibbons, G. F., Clarke, K. Plasma free fatty acids and peroxisome proliferator-activated receptor alpha in the control of myocardial uncoupling protein levels. Diabetes. 54 (12), 3496-3502 (2005).
- Barbera, M. J., et al. Peroxisome proliferator-activated receptor alpha activates transcription of the brown fat uncoupling protein-1 gene. A link between regulation of the thermogenic and lipid oxidation pathways in the brown fat cell. J Biol Chem. 276 (2), 1486-1493 (2001).
- Leung, F. W. Capsaicin as an anti-obesity drug. Prog Drug Res. 68, 171-179 (2014).
- Hursel, R., Westerterp-Plantenga, M. S. Thermogenic ingredients and body weight regulation. Int J Obes (Lond). 34 (4), 659-669 (2010).
- Kang, J. H., et al. Dietary capsaicin reduces obesity-induced insulin resistance and hepatic steatosis in obese mice fed a high-fat diet. Obesity (Silver Spring). 18 (4), 780-787 (2010).
- Winkler, B., Steele, R., Altszuler, N. Relationship of glycerol uptake to plasma glycerol concentration in the normal dog. Am J Physiol. 216 (1), 191-196 (1969).
- Dugan, C. E., Cawthorn, W. P., MacDougald, O. A., Kennedy, R. T. Multiplexed microfluidic enzyme assays for simultaneous detection of lipolysis products from adipocytes. Anal Bioanal Chem. 406 (20), 4851-4859 (2014).
