Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Forberedelse af urtemedicin: Er-Xian Decoction og Er-Xian-indeholdende Serum for Published: May 31, 2017 doi: 10.3791/55654
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Longhua Hospital, Shanghai University of Traditional Chinese Medicine, 2The Academy of Integrative Medicine of Fudan University

Summary

Her præsenterer vi forberedelsen af ​​en er-xian-afkogning (EXD) i fire trin-gennemblødning, afkogning, filtrering og koncentration - og demonstrere indgivelsen af ​​et forberedt EXD-holdigt serum til rotter. Disse metoder er gældende for in vivo og in vitro undersøgelsen af ​​urteafkalkninger, såsom traditionelle kinesiske lægemidler.

Abstract

Traditionel urtemedicin, en alternativ medicin i den kliniske indstilling, har i de senere år fået øget opmærksomhed. Før levering til kroppen kræves der normalt en ekstra ekstraktionsprocedure for at frigive de aktive bestanddele fra rå urter. Vandafkogning er en klassisk udvindingsprocedure, som stadig anvendes bredt i de kliniske indstillinger. Her foreslår vi en detaljeret protokol for er-xian decoction (EXD) for at anvende urtedekoktioner til eksperimentelle undersøgelser. Beregningen af ​​en dyret passende dosis er beskrevet, såvel som de fire hovedtrin i EXD: soaking, vandafkogning, filtrering og koncentration. Derudover introduceres serumholdig EXD til rotter som et middel til in vitro validering. Her blev rotter administreret oralt EXD i tre dage. Blodprøver blev derefter opsamlet, inaktiveret, centrifugeret og filtreret. Serumet, fortyndet med dyrkningsmediet, kan anvendes til at behandle celler eller væv i vItro. Eksempelvis blev EXD påført både in vivo og in vitro undersøgelser og påvist, at EXD forbedrer osteogenese. Denne protokol kan bruges som reference til fremstilling og anvendelse af plantelægemidler.

Introduction

Interessen for at studere og anvende traditionel urtemedicin vokser i øjeblikket. I modsætning til moderne lægemidler, hvor kemiske ingredienser er klare, har urteformler nogle ukendte ingredienser og kræver ekstraktionsprocesser for at muliggøre levering af deres aktive forbindelser. Selvom mange forsøg forsøger at vælge en lille forbindelse med en velkendt struktur som repræsentant for hele urt- eller urteformlen, kan hverken de farmakologiske virkninger eller mekanismer betragtes som ækvivalente 1 , 2 . Mens fingerprinting muliggør analyse af bestanddelene af komplekse urteformler, er nogle bestanddele stadig ikke klart analyseret, hvilket fører til en udfordring, når man kombinerer alle ekstrakter til undersøgelse 3 . Samspillet mellem mange bestanddele / ekstrakter medierer terapeutiske virkninger af plantelægemidler. For at bevare denne fordel, den traditionelle ekstrakt form-decoctIon-bruges stadig meget i klinikken. Da ekstraktproceduren har en stor indflydelse på den terapeutiske virkning, er en standardprotokol for traditionel vandafkogning nødvendig, især for in vivo- undersøgelser 4 , 5 .

På den anden side, når man undersøger farmakologiske mekanismer, er administrationen af ​​urtedekoktioner under in vitro- eller ex vivo- undersøgelser også en udfordring. Konceptet af et lægemiddelholdigt serum blev først foreslået af Tashino i 1988 6 . Siden da har stigende antal forskere anvendt det på urtemedicin 7 , 8 , 9 . Selvom fremgangsmåden til lægemiddelholdigt serum har nogle begrænsninger, såsom påvirkning af visse komponenter i serumet, anses det stadig for at være en metode, som nøje efterligner fysiologiske forhold.

10 , 11 , 12 , 13 . Det er også blevet anvendt til behandling af aplastisk anæmi 14 , menopausal osteoporose 15 , 16 , 17 , for tidlig ovariefejl 18 , brystkræft 19 , ovariecancer 20 og forsinket pubertet 21 . Her præsenterer vi detaljerede protokoller til fremstilling af både er-xian-afkogning (EXD) og dets lægemiddelholdige serum. Desuden beskriver vi anvendelsen af ​​EXD- og EXD-holdige serum til murine menopausale osteoporotiske modeller.

En EXD består af 9 g hver af Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis og Radix Angelicae Sinensis og 6 g hver af Cortex Phellodendri og Rhizoma Anemarrhenae pr. Voksen patient pr. Dag. Den ækvivalente dosis for en mus er 0,1418 EXD / kg / dag baseret på følgende ligning 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA og dB henviser til dosis pr. Legemsvægt (mg / kg) af henholdsvis henholdsvis humant og mus. Dosis, i mg / kg, erstattes med antallet af EXD / kg. RA og RB repræsenterer henholdsvis den menneskelige kropsfaktor og muskroppefaktor, som er proportional med (kropsoverfladeareal (m 2 ) / kropsvægt (kg)) 2/3 (se tabel 1 ). WA og WB indikerer henholdsvis kroppens vægt (kg) af henholdsvis humant og mus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Protokollen følger dyresundhedsretningslinjerne fra Shanghai University of Traditional Chinese Medicine og er godkendt af dyreforsøg Shanghai Animal Ethics Committee.

1. Protokol I: Fremstilling af EXD

  1. Beregning
    1. Administrer EXD til en behandlingsgruppe på 10 seks måneder gamle Female Impressing Control Region (ICR) mus (0,02 kg / mus), 5 dage om ugen i 12 uger.
      BEMÆRK: Der kræves i alt 1.702 EXD'er. Fordi EXD'er måles i diskrete trin, administrerer i ægte praksis 2 EXD'er.
    2. Beregn volumenet af EXD påført per mus ( dvs. V = (0.1418 EXD / kg • dag) * (0,02 kg / mus) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / mus • dag).
  2. iblødsætning
    1. Sæt alle råvarer af to EXD'er ( dvs. Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) og Rhizoma Anemarrhenae (12 g), samlet 96 g) i en beholder med låg.
      BEMÆRK: En keramikbeholder anbefales.
    2. Makere de rå urter med 500 ml destilleret vand i 1 time; Vandet skal dække urterne med ca. en tomme. Lad alle urter grundigt sive.
  3. Første vandafkogning
    1. Varm krydderurterne ved hjælp af en gaskomfur eller en induktionskoger med høj effekt, indtil vandet koger (ca. 5 - 10 minutter, tidsrummet afhænger af varmekraften, beholderen og mængden af ​​urter og vand). Sænk strømmen til en lav simmer i 2 timer.
  4. Første filtrering
    1. Dæk et glasbeholder på 500 ml med almindeligt filterpapir eller med gasbind og bomuld. Hæld forsigtigt afkogningen i bægeret gennem filteret. Lad krydderurterne stå i beholderen.
    2. Return de resterende urte rester oN filterpapiret til beholderen.
  5. Anden vandafkogning
    1. Tilsæt destilleret vand til beholderen med urter; Lad det dække urterne med ca. en tomme.
    2. Gentag trin 1.3.
  6. Anden filtrering
    1. Gentag trin 1.4.1 og 1.4.2.
    2. Hæld den anden afkogning i det samme bægerglas. Bland den første og anden decoktion sammen.
  7. Koncentration
    1. Sæt bægeret på en gaskomfur med asbestfri trådgabs mellem dem, opvarm afkogningen ved hjælp af en lav simmer og langsomt og kontinuerligt rør med en glasstang.
    2. Når afkogningen reduceres til 200 ml, overføres den til et 500 ml bæger.
    3. Gentag trin 1.7.1, indtil afkogingen reduceres til 100 ml.
  8. Opbevaring og administration
    1. Overfør den koncentrerede afkogning til en steril glasflaske. Lad det afkøles til rummets temperaturRe (RT). Opbevares ved 4 ° C, hvis den anvendes inden for en uge eller ved -70 ° C til langtidsopbevaring.
    2. Ved hjælp af en forseglingsnål skal man administrere 0,14 ml / mus af afkogningen til ovariektomiserede (OVX) mus én gang dagligt, 5 dage om ugen i 12 uger.

2. Protokol II: Fremstilling af EXD-indeholdende serum

  1. Beregning
    1. Beregn den rotte-ækvivalente dosis (RED) ved at bruge 0,15 kg som kropsvægt af hver rotte (1 måned gammel): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / kg / dag.
      BEMÆRK: I alt 10 ml EXD-holdigt serum er nødvendigt for at fremstille 100 ml dyrkningsmedium (10% EXD-holdigt serum). Hver rotte forventes at give 2 ml serum. Således er 6 rotter (et 20% tab taget i betragtning) nødvendige til EXD administration en gang om dagen i 3 dage. Antal EXD'er er: (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rotte) * (6 rotter) * (3 dage) = 0.300 EXD. Igen, fordi EXD'er måles i diskrete trin,Brug 1 EXD.
    2. Beregn volumenet af EXD påført pr. Rotte ( dvs. V = (0.111 EXD / kg • dag) * (0,15 kg / rotte) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / rotte • dag).
  2. iblødsætning
    1. Sæt råmaterialerne til 1 EXD i en beholder med låg. Makere de rå urter i destilleret vand i 1 time; Vandet skal dække urterne med ca. en tomme. Lad alle urter grundigt sive.
  3. Første vandafkogning
    1. Varm krydderurterne ved hjælp af en induktionskoger med høj effekt, indtil vandet koger (ca. 5 - 10 minutter, tidsrummet afhænger af varmen, beholderen og mængden af ​​urter og vand). Slå strømmen til en lav simmer i 2 timer.
  4. Første filtrering
    1. Dæk et glasbeholder på 500 ml med almindeligt filterpapir eller med gasbind og bomuld. Hæld forsigtigt afkogningen i bægeret gennem filteret. Lad krydderurterne stå i beholderen.
  5. Anden vandafkogning
    1. Tilsæt destilleret vand til beholderen med urter; Lad det dække urterne med ca. en tomme.
    2. Gentag trin 2.4.
  6. Anden filtrering
    1. Gentag trin 2.5.1 og 2.5.2.
    2. Hæld den anden afkogning i det samme bæger som i trin 2.4.1 og bland den første og den anden afkogning sammen.
  7. Koncentration
    1. Sæt bægeret på en gaskomfur med asbestfri trådgabs mellem dem, opvarm afkogningen ved hjælp af en lav simmer og langsomt og kontinuerligt rør med en glasstang.
    2. Når afkogningen reduceres til 100 ml, overføres den til et 100 ml bæger.
    3. Gentag trin 2.7.1 indtil afkogingen reducerer til 50 ml.
  8. Opbevaring og administration
    1. Overfør den koncentrerede afkogning til en stjerneIle glasflaske. Lad det afkøle til RT. Opbevares ved 4 ° C, hvis den anvendes inden for en uge eller ved -70 ° C til langtidsopbevaring.
    2. Administrer intragastrisk 0,83 ml / rotte en gang om dagen i 3 dage.
  9. EXD-indeholdende serumpræparat
    1. Bedøves rotterne ved intraperitonealt injektion af 300 ml / 100 g 80 mg / kg ketamin og 10 mg / kg xylazin efter 1 h efter den sidste administration af EXD. Bekræft korrekt bedøvelse ved tåhinde.
    2. Indse hudens og peritoneum fra rotten fra underlivet til bunden af ​​thoraxen ved hjælp af en skalpel (eller lige opererende saks). Lav et snit af længde og dybde på henholdsvis ca. 5 cm og 0,5 cm. Flyt bukhinden til venstre ved brug af tissuepapir.
    3. Brug tissuepapir, fjern bindevæv i abdominal aorta for tydeligt at udsætte karret.
    4. Træk blodet langsomt fra abdominal aorta ved hjælp af en 10 ml, 22 gauge sprøjte. Overfør det tilEt 15 ml sterilt rør efter fjernelse af nålen; En rotte kan producere 8-10 ml blod.
      BEMÆRK: Rotten skal være i live ( dvs. med abdominal aorta pulserende), når blodtegningen begynder og død efter tegningen er færdig.
    5. Klut blodet i opretstående stilling i 30 - 60 minutter ved stuetemperatur. Centrifuge ved 500-600 xg i 20 minutter. Anbring forsigtigt hele supernatanten (serum) i et 50 ml sterilt rør og bland alt serum (fra forskellige dyr) sammen.
    6. Udfør varmeinaktivering ved at inkubere serumet i et 56 ° C vandbad i 30 minutter. Filtrer serumet ved hjælp af et sprøjtefilter med en 0,22 μm porestørrelse hydrofil polyethersulfonmembran. Brug serum frisk eller opbevar det ved -20 ° C.
  10. Kontrol af lægemiddelholdigt serumpræparat (anvendt i kontrolgruppen)
    1. Administrer hver rotte med samme mængde saltopløsning (0,83 ml) en gang om dagen i 3 dage. De øvrige trin er de samme som i trin 2.9.
  11. Anvendelse
    1. Tilsæt 10 ml EXD-holdigt serum eller lægemiddelholdigt serum til hver 100 ml medium plus 1% penicillin-streptomycin (PS) 23 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Virkningen af ​​EXD på knogletætheden af ​​OVX-mus

Hematoxylin og eosin (H & E) farvning af lændehvirvelafsnittet viser øget bentrabekula efter EKD-behandling in vivo ( Figur 1A , højre panel) sammenlignet med dem i OVX-gruppen ( Figur 1A , venstre panel). Figur 1B viser de repræsentative μCT-billeder af den fjerde lændehvirvel i OVX-mus ( Figur 1B , venstre panel) og OVX-mus med EXD-behandling i 12 uger ( Figur 1B , højre panel). Flere trabekulære knogler ses i lændehvirvelen hos EXD-behandlede mus end de af OVX-kontrolmus. Dataene fra μCT-billeddannelsen indikerer en øget knoglevolumen / vævsvolumen (BV / TV), trabekulært tal (Tb. N) og trabekulær tykkelse (Tb. Th) og nedsat trabekulært afstand (Tb. Sp) i den 4. lændehvirvel I EXD-mus ( figur 1C ).

Virkningen af ​​EXD på osteogenese af knogle mesenkymale stamceller (bMSC'er) fra OVX-mus

Figur 2 repræsenterer det osteogene potentiale af bMSC'er. Fedtdråber (asterisk, uregelmæssig form af en lipiddråbe) dannes automatisk, når bMSC'er af OVX-mus dyrkes i 7 dage ( Figur 2A , venstre panel). I EXD-behandlede mus dannes knoglerørder (pil) i stedet for en fedtdråbe ( Figur 2B , højre panel). En alkalisk fosfataseanalyse (ALP) viser, at flere ALP-positive celler (lilla) kan detekteres i EXD-behandlede bMSC'er ( Figur 2B , højre panel) sammenlignet med dem i bMSC'er fra kontrol OVX-mus ( Figur 2B , venstre panel).

Ændringerne i genekspression mellem OVX og EXD-muss = "xref"> 24

Hierarkisk clustering viser, at ekspressionen af ​​389 gener afsløret ved mikroarray i bMSC'er blev foldet ændret (> 1,5, normaliseret ved ikke-OVX-mus) mellem OVX og EXD-behandlede mus in vivo (totalt: 26.991 gener) ( Figur 3 ). Grøn angiver, at udtrykket er opreguleret, mens rødt indikerer at udtrykket er nedreguleret. Tre prøver i samme gruppe klynges sammen først, hvilket indikerer profilens pålidelige kvaliteter. Figur 4 viser den overlappede signalvej, der er målrettet af EXD, både in vivo og in vitro .

figur 1
Figur 1: Effekten af ​​EXD på knoglemorfologi.
( A ) H & E-farvning af lændebjælke 4. del af OVX- og EXD-behandlede mus. ( C ) Kvantificering af μCT. BV: knoglevolumen, tv: vævsvolumen, Tb.N: trabekulært tal, Tb.Th: trabekulært tykkelse og Tb.Sp: trabekulær afstand. Kolonnerne repræsenterer midlerne ± SE. N = 6 pr. Gruppe. * P <0,05, ** p <0,01 EXD versus OVX (Studentens t-test). ( AC ) er blevet modificeret fra Shufen Liu et al. 24. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 2
Figur 2: Effekten af ​​EXD på bMSC Differentiering.
( A ) Billeder af bMSC'er dyrket i 7 dage efter beiNg isoleret fra lårbenet af OVX eller EXD-behandlede mus. * Angiver en fedtdråbe. En pil angiver en knogleknude. ( B ) ALP-farvning af OVX- og EXD-behandlede bMSC'er dyrket i 7 dage (lilla repræsenterer ALP-positiv). ( C ) Kvantificering af ( B ). Kolonnerne repræsenterer midlerne ± SE fra tre retter (seks mus) pr. Gruppe. ** p <0,01 EXD versus OVX (Studentens t-test). ( AC ) er blevet modificeret fra Shufen Liu et al. 24. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 3
Figur 3: Effekten af ​​EXD på genuttryksprofilen.
Heatmap af den hierarkiske clustering af ekspression af 389 gener i OVX og EXD bMSCs Høstet på den 7. dag efter disassociation. Skalaen (lille billede) angiver fold ændringer normaliseret af ikke-OVX bMSCs. Listen over gener findes i supplerende fil 1 . Figuren er blevet modificeret fra Shufen Liu et al. 24. Venligst klik her for at se en større version af denne figur.

Figur 4
Figur 4: Effekten af ​​EXD på overlappede signalveje i både in vivo og in vitro eksperimenter.
De første 10 overlappede signalveje, der reverseres af EXD in vivo og EXD-holdigt serum in vitro baseret på KEGG-vejen. De gener, der er relateret til stierne, vises i supplerende fil 2 ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Klik venligst her for at se en større version af denne figur.

Arter Mus Rotte marsvin Kanin Kat Abe Hund Human
R 59 90 99 93 82 111 104 100

Tabel 1: R-faktor i forskellige arter.
R-faktor i 8 arter, der almindeligvis anvendes i farmakologisk forskning. R-faktoren er proportional med: (kropsoverfladeareal (m 2 ) / bOdy vægt (kg)) 2/3 .

Supplerende fil 1.
Information om 389 gener, der opreguleres eller nedreguleres ≥ 1,5 gange, men er reddet af EXD in vivo . Klik her for at downloade denne fil.

Supplerende fil 2.
Information om signalvejen (baseret på KEGG-vejen) og beslægtede gener i både in vivo og in vitro forsøg. Klik her for at downloade denne fil.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I de seneste år har der været mere opmærksomhed på plantelægemidler, en type alternativ medicin, der har været anvendt i kliniske omgivelser i den østlige verden i tusinder af år. Forskellige fra "bænk til seng" mønster af moderne medicin kræver traditionel urtemedicin først "bed til bænk" mønster for at forklare deres mekanismer. Dette kan følges af validering udført på bænkfasen og behandling til udvikling af nyoptimerede lægemidler. Hidtil er der flere ekstraktionsmetoder, der er rapporteret til frigivelse af aktive komponenter fra hele formler eller urter. Blandt dem er vandudvinding den mest udbredte.

Vandetekstraktionen af ​​plantelægemidler har fire grundlæggende trin. Det første skridt er blødning. En kompleks urtemedicin makereres i vand i en tidsperiode, normalt fra 0,5 til 1 time. Tidsrummet til nedblødning afhænger af mængden og egenskaben af ​​de rå urter. TilSørg for, at de rå urter er grundigt gennemblødt, midten af ​​hvert stykke eller blok skal være gennemsyret. Vandmængden afhænger af den samlede mængde urter. Nogle gange bruges vægten af ​​urterne til at bestemme, hvor meget vand der er behov for til blødning. Men urtætheder varierer meget. Da formålet med blødgøring er at macerere alle urterne, hvilket letter frigivelsen af ​​de aktive komponenter under de følgende trin, foretrækkes mængden af ​​urter til anvendelse som referencestandard for vandmængden. Det andet trin er madlavning. De kogende og simmerende processer er udviklet i tusindvis af år. Variationen i tilberedningstiden afhænger hovedsageligt af arten af ​​urter på grund af deres forskellige fysiske, kemiske og farmakologiske egenskaber 12 . Diaphoretik anbefales at lave mad i en kort periode, normalt mindre end 20 minutter, mens aromatiske stoffer kun skal tilsættes nogle få minutter før den første kogning for at undgå flygtige reaktioner. FEller tonic urter, er det nødvendigt med en lang periode at udleje deres terapeutiske bestanddele. I dette tilfælde anvendes EXD til behandling af postmenopausal osteoporose i løbet af årtier 12 . I traditionel kinesisk medicinsteori anses dette syndrom for at være forårsaget af en nyre-relateret mangel. EXD er hovedsagelig designet til at tonere nyrerne. Derfor blev EXD kogt i 2 - 3 timer for at tillade EXD at udøve sine anti-osteoporotiske virkninger 15 . Det tredje trin er filtrering. Filtrering hjælper med at forhindre, at forsamlingsnålen er tilstoppet med urtegranulerne. Det fjerde trin er koncentration. Volumet af gavage indgivelse bør nøje overvejes. Det er blevet rapporteret, at store mængder, såsom 10 ml / kg eller derover, administreret ved oral gavage kan resultere i adskillige problemer med absorptionen, herunder den hurtige samling af forbindelserne til duodenum eller aspirationspneumoni forbundet med passiv tilbagesvaling af materiaJeg ind i spiserøret 25 . Således var de valgte mængder for mus og rotter omkring henholdsvis 7,5 ml / kg og 5,5 ml / kg.

Det er vigtigt at bekræfte, om de effektive komponenter i fordøjet og metaboliseret EXD i blodet ligner dem af råekstraktet. Med hensyn til EXD bioækvivalens, Wu et al. Rapporteret bestemmelsen af ​​7 komponenter i hundeplasma: epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin, sagittatosid B, 2 "-O-rhamnosyl icarisid II og baohuosid I 26 . Hu et al. Fundet 21 forbindelser i rotteplasma efter oral administration 27 . Hidtil er råekstraktet fra EXD ikke blevet rapporteret. Imidlertid er nogle af de effektive komponenter testet i blod, såsom icariin og berberin, blevet anvendt direkte på dyr til sammenlignende observation 28 .

Der er flere tilgange til at beregne dyret bioeQuivalente dosis. Den traditionelle metode baseret på kropsvægt (mg / kg) er ikke hensigtsmæssig, fordi farmakokinetikken varierer i forskellige arter. Beregningen baseret på kropsoverfladeareal (mg / m 2 ), hvor metabolisk hastighed er relateret til den enkelte dyrestørrelse, anvendes hyppigt 29 . Den anvendte ligning tager hensyn til både kropsoverfladeareal og kropsvægt og anvendes almindeligvis i traditionel kinesisk medicin 30 .

Mange slags dyr, såsom kaniner, marsvin, rotter og mus, kan vælges til lægemiddelholdigt serumpræparat. Den samme art som den for in vitro -behandlede celler foretrækkes. I dette studie blev rotter valgt fordi de giver mere serum end mus gør og er tættere på mus i form af arter sammenlignet med andre dyr. Desuden anbefales dosisækvivalent i in vivo eller klinisk brug, som in vitro- protokollen viste. UdtyndingenIon af serum (1:10 anbefales) tages ikke i betragtning; Det vil sige, 10 gange af den tilsvarende dosis påføres ikke de serumleverede dyr på grund af den potentielle toksiske reaktion forårsaget af behandlede celler eller organer 31 . Lægemiddeladministrationsfrekvensen varierer fra en gang om dagen i 3 til 14 dage til to gange om dagen (2 timer mellem hver administration) 7 , 8 , 32 . Indsamlingstiden sker sædvanligvis mellem time 1 og 2 (før time 6) efter den sidste administration 33 , 34 . Målet er at holde lægemiddelkoncentrationen i blodet relativt stabil og på sit højeste niveau, når prøverne samles 35 . Administrationsrutinerne kan omfatte injektion, hudadministration eller inhalation i overensstemmelse med in vivo administrationsrutinerne.

Inaktivering af lægemiddel-Indeholdende serum er stadig kontroversielt. Tilhængere mener, at tilstedeværelsen af ​​mange aktive komponenter, såsom hormoner, enzymer, antistoffer og komplementer i selve serumet, kan resultere i uventede reaktioner, der påvirker resultaterne 36 . Oppositionen mener, at de aktive komponenter fremstillet af lægemidlet også kunne fjernes ved inaktiveringsprocessen 37 . For at afbalancere dette designer folk kontrolgruppen således, at serumet fra saltopdrættede dyr anvendes.

Der er nogle begrænsninger for protokollen. Kvaliteten af ​​ekstraktet evalueres ikke før indledende in vivo og in vitro forsøg. For det andet anvendes antibiotika i dyrkningsmediet, hvilket kan forårsage interaktioner mellem urte og lægemiddel og kræver yderligere test. For det tredje bestemmes blødgørings- og simmertiden baseret på erfaringerne opnået fra klinisk praksis og dyreforsøg. Flere tidsperioder kan vælges fEller sammenligning. Soaking og simmer gange kan ændres til forskellige urteformler. Afkogningsvolumenet til dyreindgivelse kan modificeres ifølge arten og dyrets alder og vægt. Dyret, der er valgt til fremstilling af lægemiddelholdigt serum og til administrationsrutinerne, kan ændres som diskuteret ovenfor.

Samlet set giver protokollen og resultaterne et eksempel på fremstilling og anvendelse af urteafkogning i in vivo og in vitro undersøgelser. I forskellige tilfælde skal nogle af detaljerne optimeres, herunder behandlingsperioder, arter og administrationsrutiner, baseret på naturlægemidlerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.

Acknowledgments

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (81573992). Vi takker Emily K. Lo og Kathleen DiNapoli for deres sprogredigering.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) 160922 EXD components
Filter paper GElifesciences 99-103-952 Filter EXD decoction before concentration
Imprinting Control Region (ICR) mice Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 In vivo study
Sprague Dawley rats Shanghai Laboratory Animal Center SCXK 2007-0005 EXD-containing serum preparation
Syringe filter Millipore SLGP033RB 0.22 µm
gavage needles (10 ml) Shanghai BO Ge trade sales department 59104274 Adminstration of EXD
Ketamine (80 mg/kg)  Fujian Gutian Pharma Co. Ltd H35020148 Anesthesia
Xylazine (10 mg/kg) Sunway Pharma Co. Ltd CB07591 Anesthesia
Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium Gibco 12800-116 DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides
Streptomycin Sigma 1277 100 µg / ml
Penicillin Sigma 4687 100 µg / ml

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
  2. Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
  3. Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
  4. Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
  5. Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
  6. Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
  7. Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
  8. Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
  9. Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
  10. Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
  11. Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
  12. Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
  13. Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
  14. Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
  15. Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
  16. Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
  17. Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
  18. Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
  19. Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
  20. Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
  21. Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
  22. Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
  23. Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
  24. Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
  25. Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
  26. Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
  27. Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
  28. Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
  29. Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
  30. Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
  31. Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
  32. Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
  33. Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
  34. Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
  35. Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
  36. Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
  37. Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).

Tags

Medicin udgave 123 er-xian afkog lægemiddelholdigt serum serumfarmakologi urtemedicin integrationsmedicin traditionel kinesisk medicin,
Forberedelse af urtemedicin: Er-Xian Decoction og Er-Xian-indeholdende Serum for<em&gt; In vivo</em&gt; Og<em&gt; In Vitro</em&gt; Eksperimenter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J.,… More

Liu, S., Sun, Y., Li, J., Dong, J., Bian, Q. Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In Vivo and In Vitro Experiments. J. Vis. Exp. (123), e55654, doi:10.3791/55654 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter