Summary
Burada, erüe, ekstraksiyon, filtrasyon ve konsantrasyon olmak üzere dört basamakta bir er-xian ekstraksiyonunun (EXD) hazırlanması ve hazırlanmış bir EXD içeren serumun sıçanlara uygulanmasını gösteriyoruz. Bu yöntemler, geleneksel Çin ilaçları gibi bitkisel dekompozisyonların in vivo ve in vitro çalışması için geçerlidir.
Abstract
Klinik ortamda alternatif bir ilaç olan geleneksel bitki tıbbı, son yıllarda artan bir ilgi görmüştür. Vücutta teslim edilmeden önce, aktif çiğneme maddelerini çiğ otlardan ayırmak için ek bir ekstraksiyon prosedürü yaygın olarak gereklidir. Su dekompozisyonu, klinik ortamda halen yaygın olarak kullanılan klasik bir ekstraksiyon prosedürüdür. Burada, deneysel araştırmalara bitki özütleri uygulamak için er-xian kaynatma işlemi (EXD) için ayrıntılı bir protokol önermekteyiz. Hayvana uygun doz hesaplamanın yanı sıra EXD'nin dört ana aşamasını açıklar: ıslatma, su dekompozisyonu, filtrasyon ve konsantrasyon. Buna ek olarak, serum içeren EXD, in vitro doğrulama aracı olarak farelere verilir. Burada sıçanlar oral yoldan üç gün süreyle EXD ile tedavi edildi. Daha sonra kan numuneleri toplandı, inaktive edildi, santrifüj edildi ve filtrelendi. Kültür ortamı ile seyreltilmiş serum, v'de hücreleri veya dokuları tedavi etmek için kullanılabilirItro. Örneğin, EXD, hem in vivo hem de in vitro çalışmalarda uygulanmış ve EXD'nin osteojenezi arttırdığını göstermiştir. Bu protokol bitkisel ilaçların hazırlanması ve uygulanması için referans olarak kullanılabilir.
Introduction
Çalışmaya ve geleneksel bitkisel tıbbın uygulanmasına olan ilgi günümüzde artmaktadır. Kimyasal maddelerin kesin olduğu modern ilaçların aksine bitkisel formüllerin bilinmeyen bazı bileşenleri vardır ve aktif bileşiklerinin verilmesini sağlamak için ekstraksiyon işlemleri gerektirir. Çoğu araştırma, bütün ot veya bitkisel formülün temsilcisi olarak iyi bilinen bir yapıya sahip küçük bir bileşik seçmeye çalışsa da, ne farmakolojik etkinlikler ne de mekanizmalar eşdeğer 1 , 2 olarak kabul edilemez. Parmak izi kompleks bitkisel formüllerin bileşenlerini analiz etmeyi sağlarken, bazı bileşenler hala net bir şekilde analiz edilmediğinden, çalışma 3 için tüm özütleri birleştirirken bir meydan okumaya neden olur. Çok sayıda bileşenin / ekstraktların etkileşimleri, bitkisel ilaçların terapötik etkilerine aracılık eder. Bu avantajı korumak için, geleneksel ekstrakt form-dekoctİyon hala klinikte yaygın olarak kullanılmaktadır. Ekstrakt prosedürü, terapötik etkinlik üzerinde büyük bir etkiye sahip olduğu için, özellikle in vivo çalışmalar için 4 , 5 için geleneksel su sıkılmasının standart bir protokolü gereklidir.
Öte yandan, farmakolojik mekanizmaları araştırırken, in vitro veya ex vivo çalışmalar sırasında bitkisel açma maddelerinin uygulanması da bir mücadeledir. İlaç içeren serumun konsepti ilk kez Tashino tarafından 1988'de 6 önerildi. O zamandan beri, artan sayıda araştırmacı onu bitkisel ilaç 7 , 8 , 9'a uyguladı. İlaç içeren serumun metodu, serumun belli bileşenlerinin etkisi gibi bazı kısıtlamalara sahip olmakla birlikte, fizyolojik koşulları yakından taklit eden bir yöntem olarak kabul edilmektedir.
14 , menopoz osteoporozu 15 , 16 , 17 , prematür over yetmezliği 18 , meme kanseri 19 , yumurtalık kanseri 20 ve ertelenmiş ergenlik 21'in tedavisinde de uygulanmıştır. Burada, er-xian ekstraksiyonunun (EXD) ve ilacı içeren serumun hazırlanması için ayrıntılı protokoller sunuyoruz. Buna ek olarak, fare menopoz osteoporotik modellerine EXD ve EXD içeren serumun uygulanmasını açıklıyoruz.
Bir EXD, 9 gr Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii'den oluşur Radix Morindae Officinalis ve Radix Angelicae Sinensis ve her biri yetişkin hasta başına günde 6 g Cortex Phellodendri ve Rhizoma Anemarrhenae . Bir fare için eşdeğer doz, aşağıdaki denklem 22'ye dayanılarak 0.1418 EXD / kg / gün'dür: dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA ve dB, sırasıyla insan ve fare vücut ağırlığı başına doz (mg / kg) anlamına gelir. Dozun mg / kg olarak, EXD / kg sayısı ile değiştirilir. RA ve RB sırasıyla vücut yüzey alanı (m 2 ) / vücut ağırlığı (kg) ile orantılı insan vücut faktörünü ve fare gövde faktörünü temsil eder) 2/3 (Bkz. Tablo 1 ). WA ve WB sırasıyla insan ve fare vücut ağırlığını (kg) gösterir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokol, Şanghay Geleneksel Çin Tıbbı'nın hayvan bakım rehberlerini takip eder ve hayvan deneyleri Şanghay Hayvan Etik Komitesi tarafından onaylanır.
1. Protokol I: EXD'nin hazırlanması
- Hesaplama
- EXD'yi 10 altı aylık bayan Baskı Kontrol Bölgesi (ICR) farelerine (0.02 kg / fare), haftada 5 gün 12 hafta süreyle uygulayan bir tedavi grubuna uygulayın.
NOT: Toplam 1.702 EXD'ye ihtiyaç vardır. EXD'ler ayrı artışlarla ölçülür, çünkü gerçek uygulamada 2 EXD uygulayın. - Fare başına uygulanan EXD hacmini hesaplayın ( yani, V = (0.1418 EXD / kg • gün) * (0.02 kg / fare) * 50 mL / EXD = 0.14 mL / fare • gün.
- EXD'yi 10 altı aylık bayan Baskı Kontrol Bölgesi (ICR) farelerine (0.02 kg / fare), haftada 5 gün 12 hafta süreyle uygulayan bir tedavi grubuna uygulayın.
- Islatma
- İki EXD'nin ( örneğin Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedi (18 g), Radix Morindae Officinalis'in (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) ve Rhizoma Anemarrhenae (12 g), toplam 96 g) bir kapaklı bir kaba koydu.
NOT: Seramik bir kap tavsiye edilir. - Çiğ otları 500 mL damıtılmış su ile 1 saat süreyle macerante edin; Su otları bir inç kadar kaplamalıdır. Tüm otları iyice ıslatın.
- İki EXD'nin ( örneğin Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedi (18 g), Radix Morindae Officinalis'in (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) ve Rhizoma Anemarrhenae (12 g), toplam 96 g) bir kapaklı bir kaba koydu.
- İlk suda kaynatma
- Otlar, su kaynarcaya kadar yüksek sıcaklıkta bir gaz ocağı veya bir indüksiyon ocağı kullanarak ısıtın (yaklaşık 5 - 10 dakika, süre, ısıtma gücüne, kaba ve otların miktarı ve suya bağlıdır). Gücü 2 saat daha düşük bir kaynatma değere çevirin.
- İlk filtrasyon
- Normal filtre kağıdıyla veya gazlı bezle ve pamuklu, 500 mL'lik cam bir behere koyun. Dikkatli bir şekilde, kaynatmayı filtre vasıtasıyla behergöre dökün. Şifalı bitkiler kabın içinde bırakın.
- Geri kalan bitki kalıntılarını geri getirin oFiltre kağıdını kaba koyun.
- İkinci suda kaynatma
- Otlarla birlikte kaba damıtılmış su ekleyin; Otları bir inç kadar kapağı olsun.
- Adım 1.3'ü tekrarlayın.
- İkinci filtrasyon
- 1.4.1 ve 1.4.2 adımlarını tekrarlayın.
- İkinci kaynatmayı aynı behere dökün. Birinci ve ikinci dekatikleri birlikte karıştırın.
- konsantrasyon
- Beferleri asbest içermeyen tel gazlı bezli bir gaz ocağının üzerine koyun, kaynatıp düşük bir kaynatmayla ısıtın ve yavaşça ve bir cam çubukla karıştırın.
- Yoğuşma 200 mL'ye düştüğünde, 500 mL'lik bir behere aktarın.
- Yıkama 100 mL'ye düşene kadar adım 1.7.1'i tekrarlayın.
- Depolama ve yönetim
- Konsantre kaynatmayı steril bir cam şişeye aktarın. Oda sıcaklığına kadar soğutunYeniden (RT). Bir hafta içinde kullanıyorsanız 4 ° C'de veya uzun süre depolamada -70 ° C'de saklayın.
- Bir tenteli iğne kullanarak, ovarektomize (OVX) farelere günde bir kez, 12 hafta boyunca haftanın 5 günü, 0.14 mL / fare eksiltme uygulayın.
2. Protokol II: EXD-içeren Serumun Hazırlanması
- Hesaplama
- Her sıçanın vücut ağırlığı (1 aylık) olarak 0.15 kg kullanarak sıçan eşdeğer dozunu (RED) hesaplayın: dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / kg / gün.
NOT: 100 mL kültür ortamı (% 10 EXD içeren serum) hazırlamak için toplam 10 mL EXD içeren serum gereklidir. Her sıçandan 2 mL serum sağlaması bekleniyor. Böylece, 6 sıçan (% 20'lik bir kayıp dikkate alınır), 3 gün boyunca günde bir kez EXD uygulaması için gereklidir. EXD sayısı: (0.111 EXD / kg • gün) * (0.15 kg / sıçan) * (6 sıçan) * (3 gün) = 0.300 EXD. Yine, EXD'ler ayrı artışlarla ölçülür,1 EXD kullanın. - Sıçan başına uygulanan EXD hacmini hesaplayın ( yani, V = (0.111 EXD / kg • gün) * (0.15 kg / sıçan) * (50 mL / EXD) = 0.83 mL / sıçan • gün.
- Her sıçanın vücut ağırlığı (1 aylık) olarak 0.15 kg kullanarak sıçan eşdeğer dozunu (RED) hesaplayın: dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0.15) 1/3 = 0.111 EXD / kg / gün.
- Islatma
- 1 EXD'ye ait hammaddeleri kapaklı bir kaba koyun. Çiğ otları damıtılmış suda 1 saat maceratlayın; Su otları bir inç kadar kaplamalıdır. Tüm otları iyice ıslatın.
- İlk suda kaynatma
- Otlar, yüksek kaynaklarda kaynar su gelene kadar indüksiyon ocağı kullanarak ısıtın (yaklaşık 5 - 10 dakika; süre, ısı gücüne, konteynere ve otlar ile suyun miktarına bağlıdır). Gücü 2 saat daha düşük bir kaynatma noktasına getirin.
- İlk filtrasyon
- Normal filtre kağıdıyla veya gazlı bezle ve pamuklu, 500 mL'lik cam bir behere koyun. Dikkatli bir şekilde, kaynatmayı filtre vasıtasıyla behergöre dökün. Şifalı bitkiler kabın içinde bırakın.
- İkinci suda kaynatma
- Otlarla birlikte kaba damıtılmış su ekleyin; Otları bir inç kadar kapağı olsun.
- Adım 2.4'ü tekrarlayın.
- İkinci filtrasyon
- 2.5.1 ve 2.5.2 adımlarını tekrarlayın.
- İkinci sıkma işlemini, adım 2.4.1'deki gibi aynı behça boşaltın ve birinci ve ikinci dekatikleri birlikte karıştırın.
- konsantrasyon
- Asfalt içermeyen tel gazlı bezli bir gaz ocağı üzerine beheri koyun, kaynatmayı düşük bir kaynatmayla ısıtın ve yavaşça ve bir cam çubukla karıştırın.
- Yoğuşma 100 mL'ye düştüğünde, 100 mL'lik bir behere aktarın.
- Yıkama 50 mL'ye düşene kadar adım 2.7.1'i tekrarlayın.
- Depolama ve yönetim
- Konsantre kaynatmayı sterilizeIle cam şişe. Oda sıcaklığına soğumasını bekleyin. Bir hafta içinde kullanıyorsanız 4 ° C'de veya uzun süre depolamada -70 ° C'de saklayın.
- Intragastional olarak 0.83 mL / sıçan günde bir kez 3 gün boyunca uygulayın.
- EXD içeren serum preparatı
- Farelerin son uygulanmasından 1 saat sonra intraperitonal olarak 300 mL / 100 g 80 mg / kg ketamin ve 10 mg / kg xylazin enjekte ederek anestezi uygulayın. Çimdikleme ile doğru anestezi doğrulayın.
- Sıçanın cildi ve peritonunu, karın bölgesinden göğüs dibine bir bistül (veya düz ameliyat makası) kullanarak incise edin. Sırasıyla yaklaşık 5 cm ve 0.5 cm'lik bir uzunluk ve derinlik kesiği oluşturun. Doku kağıdı kullanarak karın iç organını sola doğru hareket ettirin.
- Doku kağıdı kullanarak, damarı açıkça ortaya çıkarmak için karın aortunun bağ dokusunu çıkarın.
- Karbon aortundan, 10 mL'lik, 22 ölçüslü bir şırınga kullanarak kanı yavaşça çekin. Şuraya aktar:İğneyi çıkardıktan sonra 15 mL'lik steril bir tüp; Bir fare 8-10 mL kan üretebilir.
NOT: Kan çizimine başlanırken ve çizim tamamlandıktan sonra ölü olan sıçan canlı olmalıdır ( yani, abdominal aort titreşirken). - Oda RT'da 30 - 60 dakika boyunca dik bir konumda kan pıhtılaştırın. 500-600 xg'de 20 dakika boyunca santrifüjleyin. Tüm süpernatanı (serum) dikkatli bir şekilde bir 50 mL steril tüp içine yerleştirin ve tüm serumu (farklı hayvanlardan) karıştırın.
- Serumu 56 ° C'lik bir su banyosunda 30 dakika inkübe ederek ısı inaktivasyonu yapın. Serumu, 0.22 um gözenek boyutlu bir hidrofil polietersülfon membranlı bir şırınga filtresi kullanarak filtreleyin. Serumu taze veya -20 ° C'de saklayın.
- Kontrollü ilaç içeren serum preparatı (kontrol grubunda kullanılır)
- Her bir fare günde bir kez aynı miktarda tuzlu su (0.83 mL) ile 3 gün süre ile idare edilir. Diğer adımlar adım 2.9'daki ile aynıdır.
- Uygulama
- Her 100 ml'lik orta ve artı% 1 penisilin-streptomisin (PS) 23'e 10 mL EXD içeren serum veya ilaç içeren serum ekleyin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
EXD'nin OVX farelerinin kemik yoğunluğuna etkisi
Omurga vertebrası bölümündeki hematoksilin ve eozin boyama, OVX grubundaki kişilerle ( Şekil 1A , sol panel) karşılaştırıldığında in vivo EXD tedavisinden sonra artmış kemik trabekülleri gösterir ( Şekil 1A , sağ panel). Şekil 1B , 12 haftalık EXD tedavisine sahip OVX farelerindeki ( Şekil 1B , sol panel) ve 4. OVX farelerdeki 4. lomberin temsilci μCT görüntülerini göstermektedir ( Şekil 1B , sağ panel). EXD ile tedavi edilen farelerin bel omurlarının içinde daha fazla trabeküler kemik görülür ve kontrol OVX farelerine göre daha fazla görülür. ΜCT görüntülemeden elde edilen veriler, 4. lomberin artmış kemik hacmi / doku hacmi (BV / TV), trabeküler sayı (Tb. N) ve trabeküler kalınlık (Tb. Th) ve azalmış trabeküler aralığının (Tb. Sp) EXD farelerde ( Şekil 1C ).
EXD'nin OVX farelerinden kemik mezenkimal kök hücrelerinin (bMSC'ler) osteojenezine etkisi
Şekil 2 , bMSC'lerin osteojenik potansiyeli göstermektedir. OVX farelerinin bMSC'leri 7 gün boyunca kültürlendiğinde yağ damlacıkları (yıldız, düzensiz şekli bir lipid damlacıksı) oluşur ( Şekil 2A , sol panel). EXD ile tedavi edilen farelerde, yağ damlası yerine kemik nodülleri (ok) oluşur ( Şekil 2B , sağ panel). Bir alkalin fosfataz (ALP) analizi, kontrol OVX farelerinden ( Şekil 2B , sol panel) bMSC'lerinkine kıyasla, EXD ile muamele edilen bMSC'lerde ( Şekil 2B , sağ panel) daha fazla ALP pozitif hücrenin (mor) tespit edilebildiğini gösterir.
OVX ve EXD fareleri arasındaki gen ekspresyonundaki değişikliklers = "xref"> 24
Hiyerarşik kümeleme, in vitro OVX ve EXD ile muamele edilen fareler arasında (toplam: 26.991 gen), bMSC'lerde mikrodizinin ortaya çıkardığı 389 genin ifadesinin katlandığı (> 1.5, OVX olmayan farelerle normalleştirildi) olduğunu gösterir ( Şekil 3 ). Yeşil ifadenin yukarı doğru düzenlendiğini, kırmızı ise ifadenin aşağıya düzenlendiğini gösterir. Aynı gruptaki üç numune, profilin güvenilir kalitesini gösteren ilk önce bir araya getirilir. Şekil 4 , hem in vivo hem de in vitro olarak EXD tarafından hedeflenen örtüşen sinyal yolunu göstermektedir.
Şekil 1: EXD'nin Kemik Morfolojisi Üzerindeki Etkisi.
( A ) OVX ve EXD ile muamele edilmiş farelerin lomber 4'üncü bölümünün H & E boyanması. (
Şekil 2: EXD'nin bMSC Farklılaşmasına Etkisi.
( A ) Bei'den sonra 7 gün boyunca kültürlenen bMSC'lerin görüntüleriOVX veya EXD ile muamele edilmiş farelerin femurundan izole edilmiştir. * Bir yağ damlasını gösterir. Bir ok, bir kemik nodülünü gösterir. ( B ) 7 gün boyunca kültürlenen OVX ve EXD ile muamele edilen bMSC'lerin ALP boyaması (mor ALP'yi pozitif gösterir). ( C ) ( B ) miktarının tayini. Sütunlar, her grup için üç yemekten (altı fare) ortalama ± SE'yi temsil etmektedir. ** p <0.01 EXD'ye OVX'e karşı (Öğrencinin t-testi). ( AC ) Shufen Liu ve ark. 24. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 3: EXD'nin Gen Ekspresyon Profili Üzerindeki Etkisi.
OVX ve EXD bMSC'lerindeki 389 genin ekspresyonunun hiyerarşik kümelenmesinin ısı haritası Ayrılma sonrası 7. gününde hasat edildi. Ölçek (küçük resim) OVX olmayan bMSC'ler ile normalleştirilen kıvrım değişikliklerini gösterir. Genlerin listesi Ek Dosya 1'de sağlanmaktadır . Bu rakam Shufen Liu ve ark. 24. Bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için lütfen tıklayınız.
Şekil 4: EXD'nin Hem In Vivo Hem de In Vitro Denemelerde Çakışan Sinyalizasyon Yoluna Etkisi.
EXD in vivo ve EXD içeren serum tarafından in vitro olarak KEGG yoluna dayalı ters çevrilen ilk 10 örtüşen sinyal yolağı. Yollarla ilgili genler Ek Dosya 2'de gösterilmektedir ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bu figürde daha büyük bir versiyon görmek için lütfen tıklayınız.
| Türler | Fare | Sıçan | Gine domuzu | Tavşan | Kedi | Maymun | Köpek | İnsan |
| R, | 59 | 90 | 99 | 93 | 82 | 111 | 104 | 100 |
Tablo 1: Farklı Türlerde R faktörü.
Farmakolojik araştırmada yaygın olarak kullanılan 8 türe ait R faktörü. R-faktörü şu orantılıdır: (vücut yüzey alanı (m 2 ) / bOdy weight (kg)) 2/3 .
Ek Dosya 1.
Upregüle veya downregüle edilmiş 389 genin ≥1,5 kat üzerine bilgisi, ancak in vivo EXD ile kurtarıldı. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Ek Dosya 2.
Hem in vivo hem de in vitro deneylerde sinyal yolağı hakkında bilgi (KEGG yoluna dayalı) ve ilgili genler. Bu dosyayı indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Son yıllarda binlerce yıldır Doğu dünyasında klinik ortamda uygulanan alternatif tıp türlerinden biri olan bitkisel ilaçlara daha fazla önem verilmektedir. Modern tıbbın "tezgahdan tezgah" deseninden farklı olarak, geleneksel bitkisel tıbbın ilk önce kendi mekanizmalarını açıklamak için "tezgah yatağı" örneğini gerektirir. Bunu, tezgah aşamasında yapılan doğrulama ve yeni optimize edilmiş ilaçların geliştirilmesi için işleme takip edilebilir. Şu ana kadar, bütün formüllerden veya otlardan aktif bileşenlerin serbest bırakıldığı bildirilen birkaç ekstraksiyon yöntemi bulunmaktadır. Bunların arasında su sıkma en çok kullanılanıdır.
Bitkisel ilaçların su ekstraksiyonunda dört temel adım vardır. İlk adım ıslanmaya çalışmaktır. Kompleks bir bitki ilacı, 0.5 ila 1 saat arasında değişen bir süre boyunca suda eritilir. Islatma süresi, ham otların miktarına ve mülkiyetine bağlıdır. içinÇiğ otlar iyice batırılmış olduğundan emin olun, her parçanın veya bloğun merkezi batırılmalıdır. Suyun hacmi, otların toplam hacmine bağlıdır. Bazen, bitkilerin ağırlığı, ıslatma için ne kadar suya ihtiyaç duyulduğunu belirlemek için kullanılır. Bununla birlikte, ot yoğunlukları çok çeşitlidir. Islatma amacı, tüm otları yumuşatmak olduğundan, aşağıdaki adımlar sırasında aktif bileşenlerin serbest bırakılmasını kolaylaştırmak için, ot hacmi, su hacmi için bir referans standart olarak kullanılmak üzere tercih edilir. İkinci adım pişirme. Kaynama ve kaynatma işlemleri binlerce yıldır geliştirildi. Pişirme süresindeki değişim, farklı fiziksel, kimyasal ve farmakolojik özelliklerinden dolayı çoğunlukla otların türüne bağlıdır 12 . Uçucu reaksiyonları önlemek için, ilk kaynatmadan sadece birkaç dakika önce aromatikler eklenmeliyken, diyaforiktilerin kısa bir süre, genelde 20 dakikadan az pişmesi önerilir. FVeya tonik otlar, uzun süre terapötik unsurlarını sızdırmak için gereklidir. Bu durumda, EXD on yıllar boyu postmenopozal osteoporozun tedavisinde kullanılmaktadır 12 . Geleneksel Çin tıbbı teorisinde, bu sendromun böbrekle ilgili bir eksiklikten kaynaklandığı düşünülmektedir. EXD esas olarak böbreği tonüle etmek için tasarlanmıştır. Bu nedenle, EXD, anti-osteoporotik etkilerini göstermek için 2-3 saat pişirildi. Üçüncü adım filtrasyon. Filtrasyon, gevrek iğnenin bitki granülleri ile tıkanmasını önlemeye yardımcı olur. Dördüncü adım konsantrasyon. Gavetim uygulamasının hacmi dikkatlice düşünülmelidir. Oral gastrointestinal yolla uygulanan 10 mL / kg ya da daha fazla gibi büyük hacimlerin, bileşiklerin onikiparmak femuruna hızlı bir şekilde şönt verilmesini ya da pasif reflüsü olan aspirasyon pnömonisini de içeren emilim ile ilgili birçok soruna neden olabileceği bildirilmiştir. materiaÖzofagusa 25 l. Böylece fareler ve sıçanlar için seçilen hacimler sırasıyla yaklaşık 7.5 mL / kg ve 5.5 mL / kg idi.
Kandaki sindirilmiş ve metabolize EXD'nin etkili bileşenlerinin çiğ ekstraktınkilere benzer olup olmadığını teyit etmek önemlidir. EXD biyoeşdeğerlik açısından, Wu ve ark. , Epimedin A, epimedin B, epimedin C, icariin, sagittatoside B, 2 "-O-ramnosyl icariside II ve baohuoside I 26 gibi 7 bileşenin köpek plazmasında belirlenmesini bildirdi. Hu ve ark. Oral uygulamadan sonra sıçan plazmasında 21 bileşik bulmuştur. Şimdiye kadar, EXD'nin ham ekstreni bildirilmedi. Bununla birlikte, icariin ve berberin gibi kanda test edilen etkili bileşenlerden bazıları, karşılaştırmalı gözlem için hayvanlara doğrudan uygulanmıştır 28 .
Hayvan biyo etiğini hesaplamak için birden fazla yaklaşım varEşdeğer doz. Vücut ağırlığına dayanan geleneksel yöntem (mg / kg) uygun değildir, çünkü farmakokinetik farklı türlerde değişiklik göstermektedir. 29 Metabolik hızın bireysel hayvan boyutuyla ilişkili olduğu vücut yüzey alanına (mg / m 2 ) dayalı hesaplama çoğunlukla kullanılır 29 . Burada uygulanan denklem, vücut yüzey alanını ve vücut ağırlığını dikkate alır ve yaygın olarak geleneksel Çin tıbbında kullanılır30.
İlaç içeren serum hazırlanması için tavşanlar, kobaylar, sıçanlar ve fareler gibi birçok hayvan türü seçilebilir. İn vitro olarak işlemden geçirilmiş hücrelerinkiyle aynı tür tercih edilir. Bu çalışmada, sıçanlar, farelerden daha fazla serum sağladığı ve diğer hayvanlara kıyasla türlere göre farelere daha yakın oldukları için seçildi. Buna ek olarak, in vitro protokolün gösterdiği gibi , in vivo veya klinik kullanımdaki eşdeğer doz önerilir. DilutSerumun iyonu (1: 10 önerilir) dikkate alınmaz; Yani muamele edilmiş hücreler veya organların 31 neden olduğu potansiyel toksik reaksiyon nedeniyle eşdeğer dozun 10 katına serumla sağlanan hayvanlara uygulanmaz. İlaç uygulama sıklığı günde bir kez 3 ila 14 gün arasında günde iki kez (her bir uygulama arasında 2 saat) 7 , 8 , 32 arasında değişir. Toplama süresi , genellikle son yönetimden 33 ve 34 saatler sonra saat 1 ve 2 arasında (saat 6'dan önce) oluşur. Amaç, numuneler toplandığında kandaki ilaç konsantrasyonunu nispeten stabil ve tepe noktasında tutmaktır 35 . Uygulama usulleri, in vivo uygulama rutinlerine uygun olarak enjeksiyon, cilt uygulaması veya inhalasyon içerebilir.
Uyuşturucu bağımlılarının inaktivasyonu,Serum içeren serum hala tartışmalıdır. Destekçiler, hormonlar, enzimler, antikorlar ve serumun tamamlayıcıları gibi bir çok aktif bileşen bulunduğunu düşünürken sonuçlarını etkileyen beklenmedik reaksiyonlara neden olabilir 36 . Muhalefet, uyuşturucular tarafından üretilen aktif bileşenlerin inaktive işlemi 37 tarafından da kaldırılabileceğine inanmaktadır. Bunu dengelemek için, insanlar salinle işlenmiş hayvanlardan alınan serumun kullanılacağı şekilde kontrol grubunu tasarlarlar.
Protokolde bazı sınırlamalar var. Ekstraktın kalitesi in vivo ve in vitro denemelere başlamadan önce değerlendirilmemiştir. İkincisi, antibiyotikler kültür ortamında kullanılır; bu, bitki-ilaç etkileşimine neden olabilir ve daha ileri test gerektirir. Üçüncüsü, ıslatma ve kaynatma süresi, klinik uygulama ve hayvan deneylerinden elde edilen deneyime dayanarak belirlenir. Daha fazla süre seçilebilir fVeya karşılaştırma. Islatma ve kaynatma süreleri farklı bitki formülleri için değiştirilebilir. Hayvan idaresi için kaynatma hacmi, türüne, hayvanın yaşına ve ağırlığına göre değiştirilebilir. İlaç içeren serumun hazırlanması için seçilen hayvan ve uygulama yordamları, yukarıda tartışıldığı gibi değiştirilebilir.
Birlikte ele alındığında, protokol ve sonuçlar , in vivo ve in vitro çalışmalarda bitkisel kaynaşmanın hazırlanması ve uygulanması için bir örnek sağlar. Farklı durumlarda, bazı ayrıntılar bitkisel özelliklere dayalı olarak tedavi periyotları, türleri ve uygulama usulleri dahil olmak üzere optimize edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar, rekabet eden mali çıkarlarının olmadığını beyan ettiler.
Acknowledgments
Bu çalışma Çin Ulusal Doğa Bilimleri Vakfı (81573992) tarafından desteklenmiştir. Dil düzenleme yardımı için Emily K. Lo ve Kathleen DiNapoli'ye teşekkür ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
- Zhang, L. G., Ouyang, X. W., Wu, T. T., Ni, L. J., Shi, W. Z. Quantitative evaluation of in vitro effects and interactions of active fractions in a Chinese medicinal formula (Yaotongning Capsule) on rat chondrocytes. J Ethnopharmacol. 155 (3), 1424-1432 (2014).
- Ogawa, Y., Fujii, Y., Sugiyama, R., Konishi, T. The role of the seven crude drug components in the sleep-promoting effect of Yokukansan. J Ethnopharmacol. 177, 19-27 (2016).
- Kim, J. H., Doh, E. J., Lee, G. Evaluation of Medicinal Categorization of Atractylodes japonica Koidz. by Using Internal Transcribed Spacer Sequencing Analysis and HPLC Fingerprinting Combined with Statistical Tools. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 2926819 (2016).
- Sheridan, H., et al. The potential of metabolic fingerprinting as a tool for the modernisation of TCM preparations. J Ethnopharmacol. 140 (3), 482-491 (2012).
- Planas, G. M., Kucacute, J. Contraceptive Properties of Stevia rebaudiana. Science. 162 (3857), 1007 (1968).
- Tashino, S. "Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood. Ther Drug Monit Res. 5, 54-64 (1988).
- Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha-induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway. Exp Ther Med. 8 (3), 998-1004 (2014).
- Fu, L., et al. Ex Vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum. Evid Based Complement Alternat Med. 2016, 7380439 (2016).
- Chen, X., et al. Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine. Chin J Integr Med. 20 (6), 450-455 (2014).
- Sze, S. C., et al. A novel mechanism: Erxian Decoction, a Chinese medicine formula, for relieving menopausal syndrome. J Ethnopharmacol. 123 (1), 27-33 (2009).
- Sze, S. C., et al. Effects of Erxian decoction, a Chinese medicinal formulation, on serum lipid profile in a rat model of menopause. Chin Med. 6, 40 (2011).
- Zhong, L. L., et al. A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women. Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).
- Wang, S. W., et al. Steroidogenic effect of Erxian decoction for relieving menopause via the p-Akt/PKB pathway in vitro and in vivo. J Ethnopharmacol. , (2016).
- Lin, L., Wu, S., Tang, J. [Clinical observation and experimental study of the treatment of aplastic anemia by warming and tonifying the spleen and kidney]. Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 10 (5), 272-274 (1990).
- Nian, H., et al. Antiosteoporotic activity of Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in ovariectomized rats. J Ethnopharmacol. 108 (1), 96-102 (2006).
- Qin, L., et al. Antiosteoporotic chemical constituents from Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula. J Ethnopharmacol. 118 (2), 271-279 (2008).
- Xue, L., et al. A HNMR-based metabonomics study of postmenopausal osteoporosis and intervention effects of Er-Xian Decoction in ovariectomized rats. Int J Mol Sci. 12 (11), 7635-7651 (2011).
- Lu, X. N., Xu, X. R., Lin, L. J. [Clinical observation of bushen er'xian decoction in treating premature ovarian failure]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 28 (7), 594-596 (2008).
- Yu, X., et al. Anti-angiogenic activity of Erxian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, in zebrafish. Biol Pharm Bull. 35 (12), 2119-2127 (2012).
- Chu, E. S., et al. An in vitro and in vivo investigation of the antimetastatic effects of a Chinese medicinal decoction, erxian decoction, on human ovarian cancer models. Integr Cancer Ther. 12 (4), 336-346 (2013).
- Zhu, Z., Li, L., Jin, X., Fang, J., Zhang, D. Er-Xian Decoction, a traditional Chinese herbal formula, intervening early in hypothalamic-pituitary axis of male rats with delayed puberty. Pharmacogn Mag. 10 (40), 517-521 (2014).
- Miao, M. S. Experimental animals and technology. 1997, Chinese Modical Publisher. Beijing. 145 (1997).
- Soleimani, M., Nadri, S. A protocol for isolation and culture of mesenchymal stem cells from mouse bone marrow. Nat Protoc. 4 (1), 102-106 (2009).
- Lu, S., Huang, J., Wang, J., et al. Er-Xian Decoction Stimulates Osteoblastic Differentiation of Bone Mesenchymal Stem Cells in Ovariectomized Mice and Its Gene Profile Analysis. Stem Cells International. 2016, 4079210 (2016).
- Turner, P. V., Brabb, T., Pekow, C., Vasbinder, M. A. Administration of substances to laboratory animals: routes of administration and factors to consider. J Am Assoc Lab Anim Sci. 50 (5), 600-613 (2011).
- Wu, C., et al. Simultaneous determination of seven flavonoids in dog plasma by ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and its application to a bioequivalence study of bioactive components in Herba Epimedii and Er-Xian Decoction. J Pharm Biomed Anal. 54 (1), 186-191 (2011).
- Hu, Y. M., et al. Identification of the major chemical constituents and their metabolites in rat plasma and various organs after oral administration of effective Erxian Decoction (EXD) fraction by liquid chromatography-mass spectrometry. Biomed Chromatogr. 24 (5), 479-489 (2010).
- Xue, L., et al. Effects and interaction of icariin, curculigoside, and berberine in er-xian decoction, a traditional chinese medicinal formula, on osteoclastic bone resorption. Evid Based Complement Alternat Med. , (2012).
- Nair, A. B., Jacob, S. A simple practice guide for dose conversion between animals and human. J Basic Clin Pharm. 7 (2), 27-31 (2016).
- Xu, X., et al. Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats. Int J Clin Exp Med. 8 (2), 1768-1779 (2015).
- Li, Z., Wang, J. On the methods for Chinese herbs serum pharmcology. Zhong Guo Zhong Yi Yao Xing Xi Za Zhi. 9 (2), 5-6 (2002).
- Jiang, Y. R., et al. Effect of chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells. Chin J Integr Med. 18 (1), 30-33 (2012).
- Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. [Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway]. Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).
- Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells]. Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).
- Li, Y. K. [Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology]. Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).
- Zhang, L., et al. [A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study]. Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).
- Zhang, D. [Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology]. Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).
