Summary
Hier präsentieren wir die Vorbereitung eines Er-Xian-Abkochens (EXD) in vier Stufen - Einweichen, Abkühlen, Filtrieren und Konzentrieren - und zeigen die Verabreichung eines präparierten EXD-haltigen Serums an Ratten. Diese Methoden gelten für die in vivo und in vitro Studie von pflanzlichen Abkochungen wie traditionelle chinesische Medikamente.
Abstract
Traditionelle Kräutermedizin, eine alternative Medizin in der klinischen Einstellung, hat in den letzten Jahren verstärkte Aufmerksamkeit erhalten. Vor der Auslieferung an den Körper ist ein zusätzliches Extraktionsverfahren üblicherweise erforderlich, um die aktiven Bestandteile aus Rohkräutern freizusetzen. Wasserabkochung ist ein klassisches Extraktionsverfahren, das in den klinischen Einstellungen immer noch weit verbreitet ist. Hier schlagen wir ein detailliertes Protokoll für die Er-xian-Abkochung (EXD) vor, um pflanzliche Abkochungen auf experimentelle Studien anzuwenden. Die Berechnung einer tierrelevanten Dosis wird ebenso beschrieben wie die vier Hauptschritte von EXD: Einweichen, Wasserabkochen, Filtration und Konzentration. Darüber hinaus wird serumhaltiges EXD an Ratten als Mittel der in vitro- Validierung eingeführt. Hier wurden Ratten für drei Tage oral verabreicht. Blutproben wurden dann gesammelt, inaktiviert, zentrifugiert und filtriert. Das mit dem Kulturmedium verdünnte Serum kann zur Behandlung von Zellen oder Geweben in v verwendet werdenItro Beispielsweise wurde EXD sowohl in vivo als auch in vitro untersucht und gezeigt, dass EXD die Osteogenese verstärkt. Dieses Protokoll kann als Referenz für die Vorbereitung und Anwendung von pflanzlichen Arzneimitteln verwendet werden.
Introduction
Das Interesse an der Studie und Anwendung der traditionellen Kräutermedizin wächst derzeit. Im Gegensatz zu modernen Medikamenten, in denen chemische Bestandteile definitiv sind, haben pflanzliche Formeln einige unbekannte Zutaten und erfordern Extraktionsverfahren, um die Abgabe ihrer Wirkstoffe zu ermöglichen. Obwohl viele Studien versuchen, eine kleine Verbindung mit einer bekannten Struktur als Vertreter der ganzen Kräuter- oder Kräuterformel auszuwählen, können weder die pharmakologischen Wirkungen noch Mechanismen als gleichwertig angesehen werden 1 , 2 . Während der Fingerabdruck die Analyse der Bestandteile komplexer pflanzlicher Formeln ermöglicht, werden einige Bestandteile noch nicht klar analysiert, was zu einer Herausforderung führt, wenn alle Extrakte für die Studie 3 kombiniert werden. Die Wechselwirkungen zahlreicher Bestandteile / Extrakte vermitteln die therapeutischen Wirkungen von pflanzlichen Arzneimitteln. Um diesen Vorteil zu behalten, wird der traditionelle Auszugsformular dekodiertIon ist in der Klinik immer noch weit verbreitet. Da das Extraktverfahren einen großen Einfluss auf die therapeutische Wirksamkeit hat, ist ein Standardprotokoll der traditionellen Wasserabkochung notwendig, insbesondere für in vivo Studien 4 , 5 .
Auf der anderen Seite ist bei der Erforschung pharmakologischer Mechanismen auch die Verabreichung von Kräuterdekuren während der In-vitro- oder Ex-vivo- Studien eine Herausforderung. Das Konzept eines drogenhaltigen Serums wurde erstmals 1988 von Tashino vorgeschlagen 6 . Seitdem haben immer mehr Forscher die Kräutermedizin 7 , 8 , 9 angewendet. Obwohl die Methode des Arzneimittel-enthaltenden Serums einige Einschränkungen aufweist, wie der Einfluss bestimmter Bestandteile des Serums, gilt es immer noch als eine Methode, die physiologische Zustände imitiert.
10 , 11 , 12 , 13 . Es wurde auch auf die Behandlung von aplastischen Anämie 14 , Menopause Osteoporose 15 , 16 , 17 , vorzeitige Eierstockversagen 18 , Brustkrebs 19 , Eierstockkrebs 20 und verspätete Pubertät angewendet 21 . Hier stellen wir detaillierte Protokolle für die Herstellung sowohl des Er-Xian-Abkochens (EXD) als auch seines medikamentenhaltigen Serums vor. Darüber hinaus beschreiben wir die Anwendung von EXD und EXD-haltigem Serum, um menopausale osteoporotische Modelle zu mähen.
Eine EXD besteht aus 9 g Curculigo orchioides Gaertn , Herbaa Epimedii Radix Morindae Officinalis und Radix Angelicae Sinensis und jeweils 6 g Cortex Phellodendri und Rhizoma Anemarrhenae pro erwachsenen Patienten pro Tag. Die äquivalente Dosis für eine Maus ist 0,1418 EXD / kg / Tag, bezogen auf die folgende Gleichung 22 : dB = dA * RB / RA * (WA / WB) 1/3 . DA und dB beziehen sich auf die Dosis pro Körpergewicht (mg / kg) des Menschen bzw. der Maus. Die Dosis in mg / kg wird durch die Anzahl der EXD / kg ersetzt. RA und RB repräsentieren den menschlichen Körperfaktor bzw. den Mauskörperfaktor, die proportional zur (Körperoberfläche (m 2 ) / Körpergewicht (kg)) 2/3 sind (siehe Tabelle 1 ). WA und WB geben das Körpergewicht (kg) des Menschen bzw. der Maus an.
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Protocol
Das Protokoll folgt den Tierpflege Richtlinien der Shanghai University of Traditional Chinese Medicine und ist von der Tierversuch Shanghai Animal Ethics Committee genehmigt.
1. Protokoll I: Vorbereitung von EXD
- Berechnung
- Verabreichen Sie die EXD einer Behandlungsgruppe von 10 Sechs Monate alten weiblichen Imprinting Control Region (ICR) Mäusen (0,02 kg / Maus), 5 Tage pro Woche für 12 Wochen.
HINWEIS: Es werden insgesamt 1.702 EXDs benötigt. Da EXDs in diskreten Inkrementen gemessen werden, in realer Praxis 2 EXDs verabreichen. - Berechnen Sie das Volumen der EXD, das pro Maus aufgetragen wird ( dh V = (0,1418 EXD / kg • Tag) * (0,02 kg / Maus) * 50 ml / EXD = 0,14 ml / Maus • Tag).
- Verabreichen Sie die EXD einer Behandlungsgruppe von 10 Sechs Monate alten weiblichen Imprinting Control Region (ICR) Mäusen (0,02 kg / Maus), 5 Tage pro Woche für 12 Wochen.
- Einweichen
- Setzen Sie alle Rohstoffe von zwei EXDs ( zB Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) und Rhizoma Anemarrhenae (12 g), insgesamt 96 g) in einen Behälter mit Deckel.
HINWEIS: Ein keramischer Behälter wird empfohlen. - Mischen Sie die rohen Kräuter mit 500 ml destilliertem Wasser für 1 Stunde; Das Wasser sollte die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken. Lass alle Kräuter gründlich einweichen.
- Setzen Sie alle Rohstoffe von zwei EXDs ( zB Curculigo orchioides Gaertn (18 g), Herbaa Epimedii (18 g), Radix Morindae Officinalis (18 g), RAdix Angelicae Sinensis (18 g), Cortex Phellodendri (12 g) und Rhizoma Anemarrhenae (12 g), insgesamt 96 g) in einen Behälter mit Deckel.
- Erste Wasserabkochung
- Die Kräuter mit einem Gaskocher oder einem Induktionsherd bei hoher Leistung erhitzen, bis das Wasser kocht (ca. 5 - 10 min, die Zeitspanne hängt von der Heizleistung, dem Behälter und der Menge an Kräutern und Wasser ab). Schalten Sie die Stromversorgung zu einem schwachen köcheln für 2 h.
- Erste Filtration
- Bedecken Sie ein 500-ml-Glasbecher mit normalem Filterpapier oder mit Gaze und Baumwolle. Die Abkochung vorsichtig in den Becher durch den Filter abgießen. Lassen Sie die Kräuter in den Behälter.
- Den restlichen pflanzlichen Rückstand zurückgeben oN das Filterpapier zum Behälter.
- Zweite Wasserabkochung
- Füge dem Behälter mit den Kräutern destilliertes Wasser hinzu. Lass es die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken.
- Wiederholen Sie Schritt 1.3.
- Zweite Filtration
- Wiederholen Sie die Schritte 1.4.1 und 1.4.2.
- Gießen Sie die zweite Abkochung in den gleichen Becher. Mischen Sie die erste und zweite Abkochung zusammen.
- Konzentration
- Setzen Sie den Becher auf einen Gaskocher mit asbestfreien Drahtgaze zwischen ihnen, erhitzen Sie den Abkochung mit einem schwachen köcheln und langsam und kontinuierlich mit einem Glasstab umrühren.
- Wenn die Abkochung auf 200 ml reduziert wird, transportiere sie auf ein 500-ml-Becherglas.
- Wiederholen Sie Schritt 1.7.1, bis die Abkürzung auf 100 ml reduziert wird.
- Lagerung und Verwaltung
- Übertragen Sie die konzentrierte Abkochung auf eine sterile Glasflasche. Lass es auf Raumtemperatur abkühlenRe (RT). Bei 4 ° C bei einer Verwendung von einer Woche oder bei -70 ° C zur Langzeitlagerung aufbewahren.
- Mit einer Spülladel 0,14 ml / Maus des Abkochens an ovariektomierte (OVX) Mäuse einmal pro Tag, 5 Tage pro Woche für 12 Wochen.
2. Protokoll II: Herstellung von EXD-haltigem Serum
- Berechnung
- Berechnen Sie die Ratten-Äquivalent-Dosis (RED) mit 0,15 kg als Körpergewicht jeder Ratte (1 Monat alt): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / Kg / Tag.
HINWEIS: Es werden insgesamt 10 ml EXD-haltiges Serum benötigt, um 100 ml Kulturmedium (10% EXD-haltiges Serum) herzustellen. Es wird erwartet, dass jede Ratte 2 ml Serum liefert. So werden 6 Ratten (ein 20% Verlust berücksichtigt) für die EXD-Verabreichung einmal täglich für 3 Tage benötigt. Die Anzahl der EXDs ist: (0,111 EXD / kg • Tag) * (0,15 kg / Ratte) * (6 Ratten) * (3 Tage) = 0,300 EXD. Wiederum, weil EXDs in diskreten Schritten gemessen werden,1 EXD verwenden. - Berechnen Sie das Volumen der aufgetragenen EXD pro Ratte ( dh V = (0,111 EXD / kg • Tag) * (0,15 kg / Ratte) * (50 ml / EXD) = 0,83 ml / Ratte • Tag).
- Berechnen Sie die Ratten-Äquivalent-Dosis (RED) mit 0,15 kg als Körpergewicht jeder Ratte (1 Monat alt): dB = (1/60) * (90/100) * (60 / 0,15) 1/3 = 0,111 EXD / Kg / Tag.
- Einweichen
- Legen Sie die Rohstoffe für 1 EXD in einen Behälter mit einem Deckel. Mischen Sie die rohen Kräuter in destilliertem Wasser für 1 Stunde; Das Wasser sollte die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken. Lass alle Kräuter gründlich einweichen.
- Erste Wasserabkochung
- Die Kräuter mit einem Induktionsherd bei hoher Leistung erhitzen, bis das Wasser kocht (ca. 5 - 10 min, die Zeitspanne hängt von der Wärmeleistung, dem Behälter und der Menge an Kräutern und Wasser ab). Schalten Sie die Stromversorgung für 2 Std.
- Erste Filtration
- Bedecken Sie ein 500-ml-Glasbecher mit normalem Filterpapier oder mit Gaze und Baumwolle. Die Abkochung vorsichtig in den Becher durch den Filter abgießen. Lassen Sie die Kräuter in den Behälter.
- Zweite Wasserabkochung
- Füge dem Behälter mit den Kräutern destilliertes Wasser hinzu. Lass es die Kräuter um etwa einen Zoll abdecken.
- Wiederholen Sie Schritt 2.4.
- Zweite Filtration
- Wiederholen Sie die Schritte 2.5.1 und 2.5.2.
- Gießen Sie die zweite Abkochung in den gleichen Becher wie in Schritt 2.4.1 und mischen Sie die erste und zweite Abkochung zusammen.
- Konzentration
- Setzen Sie den Becher auf einen Gaskocher mit asbestfreien Drahtgaze zwischen ihnen, erhitzen Sie den Abkochung mit einem schwachen köcheln und langsam und kontinuierlich mit einem Glasstab umrühren.
- Wenn die Abkochung auf 100 mL abfällt, übertrage sie in ein 100-ml-Becherglas.
- Wiederholen Sie Schritt 2.7.1, bis die Abkürzung auf 50 ml reduziert wird.
- Lagerung und Verwaltung
- Übertragen Sie die konzentrierte Abkochung in ein SterIle Glasflasche Lass es auf RT abkühlen. Bei 4 ° C bei einer Verwendung von einer Woche oder bei -70 ° C zur Langzeitlagerung aufbewahren.
- Intragastrisch verabreichen 0,83 ml / Ratte einmal pro Tag für 3 Tage.
- EXD-haltige Serumzubereitung
- Die Ratten durch intraperitoneale Injektion von 300 ml / 100 g 80 mg / kg Ketamin und 10 mg / kg Xylazin bei 1 h nach der letzten Verabreichung von EXD anästhesieren. Bestätigen Sie die richtige Betäubung durch Zehenknecht.
- Die Haut und das Bauchfell der Ratte vom Bauch bis zum Boden des Thorax mit einem Skalpell (oder einer geraden Arbeitsschere) aufschneiden. Erstellen Sie einen Schnitt von Länge und Tiefe von etwa 5 cm bzw. 0,5 cm. Verschieben Sie die Bauch-Eingeweide nach links mit Seidenpapier.
- Mit Tissue-Papier, entfernen Sie das Bindegewebe der Bauch-Aorta, um deutlich aus dem Gefäß.
- Ziehen Sie das Blut langsam aus der Bauchaorta mit einer 10-ml-22-Gauge-Spritze. Übertragen Sie es aufEin 15-ml-steriles Rohr nach dem Entfernen der Nadel; Eine Ratte kann 8-10 ml Blut produzieren.
ANMERKUNG: Die Ratte sollte am Leben sein ( dh mit der abdominalen Aorta pulsierend) beim Beginn der Blutzeichnung und tot, nachdem die Zeichnung abgeschlossen ist. - Das Blut in einer aufrechten Position für 30 - 60 min bei Raum RT klopfen. Zentrifuge bei 500-600 xg für 20 min. Setzen Sie den Überstand (Serum) sorgfältig in ein 50 ml steriles Röhrchen und mischen Sie das ganze Serum (von verschiedenen Tieren) zusammen.
- Durchführen der Hitzeinaktivierung durch Inkubieren des Serums in einem 56 ° C Wasserbad für 30 min. Filtern des Serums unter Verwendung eines Spritzenfilters mit einer hydrophilen Polyethersulfonmembran mit einer Dicke von 0,22 μm. Verwenden Sie das Serum frisch oder lagern Sie es bei -20 ° C.
- Kontroll-Arzneimittel enthaltende Serumzubereitung (in der Kontrollgruppe verwendet)
- Jede Ratte mit dem gleichen Salzgehalt (0,83 ml) einmal pro Tag für 3 Tage verabreichen. Die anderen Schritte sind die gleichen wie in Schritt 2.9.
- Anwendung
- Füge 10 ml EXD-haltiges Serum oder medikamentenhaltiges Serum zu je 100 ml Medium, plus 1% Penicillin-Streptomycin (PS) 23 hinzu.
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Representative Results
Die Wirkung von EXD auf die Knochendichte von OVX-Mäusen
Hämatoxylin- und Eosin- (H & E) -Färbung des Lendenwirbelabschnitts zeigt erhöhte Knochentrabekel nach der EXD-Behandlung in vivo (Abbildung 1A , rechte Tafel) im Vergleich zu denen in der OVX-Gruppe (Abbildung 1A , linke Tafel). Abbildung 1B zeigt die repräsentativen μCT-Bilder der 4. Lendenwirbelsäule in OVX-Mäusen (Abbildung 1B , linke Tafel) und OVX-Mäusen mit EXD-Behandlung für 12 Wochen (Abbildung 1B , rechte Tafel). Im Inneren des Lendenwirbels von EXD-behandelten Mäusen sind mehr trabekuläre Knochen zu sehen als die der OVX-Mäuse. Die Daten aus der μCT-Bildgebung zeigen ein erhöhtes Knochenvolumen / Gewebevolumen (BV / TV), Trabekelzahl (Tb. N) und Trabekulardicke (Tb. Th) und verminderter Trabekelabstand (Tb. Sp) der 4. Lendenwirbelsäule In EXD-Mäusen (Abbildung 1C ).
Die Wirkung von EXD auf die Osteogenese von Knochen mesenchymalen Stammzellen (bMSCs) von OVX-Mäusen
Abbildung 2 stellt das osteogene Potential von bMSCs dar. Fette Tröpfchen (Asterisk, unregelmäßige Form eines Lipidtröpfchens) werden automatisch gebildet, wenn bMSCs von OVX-Mäusen für 7 Tage kultiviert werden (Abbildung 2A , linkes Feld). Bei EXD-behandelten Mäusen werden Knochenknoten (Pfeil) anstelle eines Fetttröpfchens gebildet ( Abbildung 2B , rechte Tafel). Ein alkalischer Phosphatase (ALP) -Assay zeigt, dass in den EXD-behandelten bMSCs (Abbildung 2B , rechte Tafel) mehr ALP-positive Zellen (lila) nachgewiesen werden können, verglichen mit denen in bMSCs von Kontroll-OVX-Mäusen (Abbildung 2B , linke Tafel).
Die Veränderungen der Genexpression zwischen OVX- und EXD-MäusenS = "xref"> 24
Hierarchische Clusterbildung zeigt, dass die Expression von 389 Genen, die durch Microarray in bMSCs aufgedeckt wurden, zwischen OVX und EXD-behandelten Mäusen in vivo (insgesamt: 26.991 Gene) fehl verändert wurde (> 1,5, normalisiert durch Nicht-OVX-Mäuse) (Abbildung 3 ). Grün zeigt an, dass der Ausdruck hochreguliert wurde, während Rot anzeigt, dass der Ausdruck herunterreguliert wurde. In der gleichen Gruppe werden zunächst drei Samples zusammengefasst, die die zuverlässigen Qualitäten des Profils angeben. Fig. 4 zeigt den überlappenden Signalweg, der durch EXD gezielt wird, sowohl in vivo als auch in vitro .
Abbildung 1: Die Wirkung von EXD auf die Knochenmorphologie.
( A ) H & E-Färbung des lumbalen 4. Abschnittes von OVX- und EXD-behandelten Mäusen. (
Abbildung 2: Die Wirkung von EXD auf die bMSC-Differenzierung.
( A ) Bilder von bMSCs kultiviert für 7 Tage nach beiNg isoliert aus dem Femur von OVX oder EXD-behandelten Mäusen. * Zeigt ein fettes Tröpfchen an. Ein Pfeil zeigt einen Knochenknoten an. ( B ) ALP-Färbung von OVX- und EXD-behandelten BMSCs, die für 7 Tage kultiviert wurden (Purpur repräsentiert ALP-positiv). ( C ) Quantifizierung von ( B ). Die Spalten stellen die Mittelwerte ± SE aus drei Gerichten (sechs Mäuse) pro Gruppe dar. ** p <0,01 EXD versus OVX (Student's t-Test). ( AC ) wurden von Shufen Liu et al. 24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3: Die Wirkung von EXD auf das Genexpressionsprofil.
Heatmap der hierarchischen Clusterung der Expression von 389 Genen in OVX und EXD bMSCs Geerntet am 7. Tag nach der Disassoziation. Die Skala (kleines Bild) zeigt Faltungsänderungen an, die durch Nicht-OVX-BMSCs normalisiert sind. Die Liste der Gene ist in der Ergänzungsdatei 1 enthalten . Die Figur wurde von Shufen Liu et al. 24. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 4: Die Wirkung von EXD auf die überlappende Signalwege in beiden In-vivo- und In-vitro- Experimenten.
Die ersten 10 überlappenden Signalwege, die durch das EXD in vivo und das EXD-haltige Serum in vitro auf der Basis des KEGG-Weges umgekehrt werden. Die mit den Pfaden verknüpften Gene sind in der Ergänzungsdatei 2 dargestellt ./files/ftp_upload/55654/55654fig4large.jpg "target =" _ blank "> Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
| Spezies | Maus | Ratte | Meerschweinchen | Hase | Katze | Affe | Hund | Menschlich |
| R | 59 | 90 | 99 | 93. | 82 | 111 | 104. | 100 |
Tabelle 1: R-Faktor in verschiedenen Arten.
Der R-Faktor in 8 Arten, die häufig in der pharmakologischen Forschung verwendet werden. Der R-Faktor ist proportional zu: (Körperoberfläche (m 2 ) / bGewicht (kg) 2/3 .
Ergänzungsdatei 1.
Informationen über 389 Gene, die hochreguliert oder herunterreguliert sind ≥1,5-fach, werden aber von EXD in vivo gerettet. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
Ergänzungsdatei 2.
Informationen über den Signalweg (basierend auf dem KEGG-Weg) und verwandte Gene sowohl in vivo als auch in vitro- Experimenten. Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.
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Discussion
In den letzten Jahren wurde mehr Aufmerksamkeit auf pflanzliche Arzneimittel, eine Art von alternativen Medizin, die in der klinischen Einstellung in der östlichen Welt seit Tausenden von Jahren angewendet wurde bezahlt worden. Anders als das "Bench to Bed" -Muster der modernen Medizin, verlangen traditionelle Kräutermedizin zuerst das "Bett zur Bank" Muster, um ihre Mechanismen zu erklären. Darauf folgt eine Validierung, die im Bankstadium durchgeführt wird und für die Entwicklung von neu optimierten Medikamenten verarbeitet wird. Bisher gibt es mehrere Extraktionsmethoden, die der Freisetzung aktiver Komponenten aus ganzen Formeln oder Kräutern berichtet wurden. Unter ihnen ist die Wassergewinnung am weitesten verbreitet.
Die Wassergewinnung von pflanzlichen Arzneimitteln hat vier grundlegende Schritte. Der erste Schritt ist einweichen. Eine komplexe pflanzliche Medizin wird in Wasser für einen Zeitraum von Zeit, in der Regel von 0,5 bis 1 h mazeriert. Die Zeitspanne für das Einweichen hängt von der Menge und dem Eigentum der Rohkräuter ab. NachStellen Sie sicher, dass die rohen Kräuter gründlich eingeweicht werden, die Mitte jedes Stückes oder Blocks sollte durchtränkt werden. Das Volumen des Wassers hängt vom Gesamtvolumen der Kräuter ab. Manchmal wird das Gewicht der Kräuter verwendet, um festzustellen, wie viel Wasser für das Einweichen benötigt wird. Allerdings sind die Kräuterdichten sehr unterschiedlich. Da der Zweck des Einweichens darin besteht, alle Kräuter zu mazerieren, was die Freisetzung der aktiven Komponenten während der folgenden Schritte erleichtert, wird das Volumen der Kräuter für die Verwendung als Referenzstandard für das Volumen des Wassers bevorzugt. Der zweite Schritt ist das Kochen. Die kochenden und kochenden Prozesse wurden über Tausende von Jahren entwickelt. Die Variation der Kochzeit hängt vor allem von der Art der Kräuter ab, aufgrund ihrer unterschiedlichen physikalischen, chemischen und pharmakologischen Eigenschaften 12 . Diaphoretik wird vorgeschlagen, für eine kurze Zeitspanne zu kochen, in der Regel weniger als 20 min, während Aromaten nur wenige Minuten vor dem ersten Kochen hinzugefügt werden sollten, um flüchtige Reaktionen zu vermeiden. FOder tonischen Kräutern, ist eine lange Zeitspanne erforderlich, um ihre therapeutischen Bestandteile auszulagern. In diesem Fall wird EXD für die Behandlung der postmenopausalen Osteoporose über Jahrzehnte verwendet 12 . In der traditionellen chinesischen Medizin-Theorie wird dieses Syndrom als durch einen Nieren-bedingten Mangel verursacht verursacht. EXD ist hauptsächlich entworfen, um die Niere zu tonisieren. Daher wurde die EXD für 2 - 3 h gekocht, damit die EXD ihre anti-osteoporotischen Effekte ausüben kann 15 . Der dritte Schritt ist die Filtration. Filtration hilft, die Spülladel nicht mit dem Kräutergranulat verstopfen zu lassen. Der vierte Schritt ist die Konzentration. Das Volumen der Gavage-Administration sollte sorgfältig geprüft werden. Es wurde berichtet, dass große Volumina, wie 10 ml / kg oder mehr, die durch orale Spülung verabreicht werden, zu mehreren Problemen im Zusammenhang mit der Absorption führen können, einschließlich des schnellen Rangierens der Verbindungen zum Duodenum oder der Aspirationspneumonie, die mit dem passiven Rückfluss des MaterieIch in die Speiseröhre 25 . Somit betrugen die für die Mäuse und Ratten gewählten Volumina etwa 7,5 ml / kg bzw. 5,5 ml / kg.
Es ist wichtig zu bestätigen, ob die wirksamen Bestandteile des verdauten und metabolisierten EXD im Blut denjenigen des Rohsextraktes ähnlich sind. In Bezug auf die EXD-Bioäquivalenz haben Wu et al. Berichteten über die Bestimmung von 7 Komponenten im Hundeplasma: Epimedin A, Epimedin B, Epimedin C, Icariin, Sagittatosid B, 2 "-O-Rhamnosyl icarisid II und Baohosos I 26 . Hu et al. Gefunden 21 Verbindungen im Rattenplasma nach oraler Verabreichung 27 . Bisher wurde der Rohauszug aus EXD nicht gemeldet. Allerdings wurden einige der wirksamen Bestandteile, die im Blut getestet wurden, wie Icariin und Berberin, direkt auf Tiere zur Vergleichsbeobachtung angewendet worden.
Es gibt mehrere Ansätze, um das Tier Bioe zu berechnenQuivalent dosis Die traditionelle Methode, die auf Körpergewicht (mg / kg) basiert, ist nicht angemessen, da die Pharmakokinetik in verschiedenen Spezies variiert. Die Berechnung der Körperoberfläche (mg / m 2 ), bei der die metabolische Rate mit der individuellen Tiergröße zusammenhängt, wird häufig verwendet 29 . Die hier angewandte Gleichung berücksichtigt sowohl die Körperoberfläche als auch das Körpergewicht und wird in der traditionellen chinesischen Medizin allgemein genutzt 30 .
Viele Arten von Tieren, wie Kaninchen, Meerschweinchen, Ratten und Mäuse, können für die medikamentenhaltige Serumpräparation ausgewählt werden. Die gleiche Spezies wie die der in vitro- behandelten Zellen ist bevorzugt. In dieser Studie wurden Ratten gewählt, weil sie mehr Serum als Mäuse liefern und sind näher an Mäusen in Bezug auf Arten im Vergleich zu anderen Tieren. Darüber hinaus wird das Dosisäquivalent in der In-vivo- oder Klinikverwendung empfohlen, wie das in vitro -Protokoll zeigte. Der verdünnungsmittelIon des Serums (1:10 wird empfohlen) wird nicht berücksichtigt; Das heißt, das 10-fache der äquivalenten Dosis wird nicht auf die mit Serum gelieferten Tiere aufgrund der potentiellen toxischen Reaktion, die durch behandelte Zellen oder Organe verursacht wird, angewendet. Die Arzneimittelverabreichungshäufigkeit variiert von einmal pro Tag für 3 bis 14 Tage bis zweimal pro Tag (2 h zwischen jeder Verabreichung) 7 , 8 , 32 . Die Sammelzeit tritt üblicherweise zwischen den Stunden 1 und 2 (vor Stunde 6) nach der letzten Verwaltung 33 , 34 auf . Das Ziel ist es, die Arzneimittelkonzentration im Blut relativ stabil zu halten und bei ihrem Peak, wenn die Proben gesammelt werden, 35 . Die Verabreichungsroutinen können Injektion, Hautverabreichung oder Inhalation gemäß den in vivo- Verabreichungsroutinen einschließen.
Die Inaktivierung von Arzneimittel-Serum ist immer noch umstritten. Unterstützer glauben, dass die Anwesenheit von vielen aktiven Komponenten, wie Hormone, Enzyme, Antikörper und Komplemente im Serum selbst, zu unerwarteten Reaktionen führen kann, die die Ergebnisse beeinflussen 36 . Die Opposition glaubt, dass die von den Medikamenten erzeugten aktiven Komponenten auch durch den Inaktivierungsprozess 37 entfernt werden können. Um dies auszugleichen, entwerfen die Menschen die Kontrollgruppe, so dass das Serum aus salzbehandelten Tieren verwendet wird.
Es gibt einige Einschränkungen für das Protokoll. Die Qualität des Extraktes wird nicht vor Beginn in vivo und in vitro Experimente ausgewertet. Zweitens werden Antibiotika im Kulturmedium verwendet, die Kraut-Arzneimittel-Wechselwirkungen verursachen können und weitere Tests erfordern. Drittens werden die Einweich- und Köchenzeit auf der Grundlage der Erfahrungen aus der klinischen Praxis und dem Tierversuch bestimmt. Weitere Zeiträume können gewählt werdenOder Vergleich. Die Einweich- und Simmerzeiten können für verschiedene Kräuterformeln modifiziert werden. Das Abkochungsvolumen für die Tieradministration kann je nach Art und Alter und Gewicht des Tieres verändert werden. Das Tier, das für die Herstellung von Arzneimittel enthaltendem Serum und für die Verabreichungsroutinen ausgewählt wurde, kann, wie oben diskutiert, geändert werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Protokoll und die Ergebnisse ein Beispiel für die Vorbereitung und Anwendung von Kräuterdekoration in In-vivo- und In-vitro- Studien sind. In verschiedenen Fällen müssen einige der Details optimiert werden, einschließlich der Behandlungsperioden, Arten und Verabreichungsroutinen, basierend auf den pflanzlichen Eigenschaften.
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Disclosures
Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.
Acknowledgments
Diese Arbeit wurde von der Nationalen Naturwissenschaftlichen Stiftung von China (81573992) unterstützt. Wir danken Emily K. Lo und Kathleen DiNapoli für ihre Sprachbearbeitung.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Curculigo orchioides Gaertn (9 g), Herbaa Epimedii (9 g), Radix Morindae Officinalis (9 g), Radix Angelicae Sinensis (9 g), Cortex Phellodendri (6 g), and Rhizoma Anemarrhenae (6 g) | Kang-qiao Chinese Medicine Yinpian Co. Ltd (Shanghai, CN) | 160922 | EXD components |
| Filter paper | GElifesciences | 99-103-952 | Filter EXD decoction before concentration |
| Imprinting Control Region (ICR) mice | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | In vivo study |
| Sprague Dawley rats | Shanghai Laboratory Animal Center | SCXK 2007-0005 | EXD-containing serum preparation |
| Syringe filter | Millipore | SLGP033RB | 0.22 µm |
| gavage needles (10 ml) | Shanghai BO Ge trade sales department | 59104274 | Adminstration of EXD |
| Ketamine (80 mg/kg) | Fujian Gutian Pharma Co. Ltd | H35020148 | Anesthesia |
| Xylazine (10 mg/kg) | Sunway Pharma Co. Ltd | CB07591 | Anesthesia |
| Dulbecco’s modification of Eagle’s medium Dulbecco (DMEM) culture medium | Gibco | 12800-116 | DMEM with 2 mM L-glutamine and without ribonucleosides and ribonucleotides |
| Streptomycin | Sigma | 1277 | 100 µg / ml |
| Penicillin | Sigma | 4687 | 100 µg / ml |
References
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