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Biochemistry

Isolamento de Proteínas de Filamento Intermediário a partir de Tecidos Múltiplos de Rato para Estudar Modificações Pós-Translacionais associadas ao Envelhecimento

Published: May 18, 2017 doi: 10.3791/55655
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine, University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

Neste método, apresentamos procedimentos bioquímicos para isolamento rápido e eficiente de proteínas de filamento intermediário (IF) a partir de tecidos de múltiplos ratos. IFs isoladas podem ser usadas para estudar mudanças em modificações pós-translacionais por espectrometria de massa e outros ensaios bioquímicos.

Abstract

Filamentos intermediários (IFs), juntamente com filamentos de actina e microtúbulos, formam o citoesqueleto - um elemento estrutural crítico de cada célula. Funcionamento normal IFs fornecer células com resistência mecânica e estresse, enquanto um citoesqueleto disfuncional IF compromete a saúde celular e tem sido associado a muitas doenças humanas. As modificações pós-translacionais (PTMs) regulam criticamente a dinâmica de IF em resposta a mudanças fisiológicas e sob condições de estresse. Portanto, a capacidade de monitorar as mudanças na assinatura PTM de IFs pode contribuir para uma melhor compreensão funcional e, em última instância condicionamento, do sistema IF como um stress responder durante a lesão celular. No entanto, o grande número de proteínas IF, que são codificadas por mais de 70 genes individuais e expressas de forma dependente de tecidos, é um grande desafio para classificar a importância relativa de diferentes PTMs. Para o efeito, os métodos que permitem a monitorização de PTMs em proteínas IFEm nível de organismo, e não para membros isolados da família, pode acelerar o progresso da pesquisa nesta área. Aqui, apresentamos métodos bioquímicos para o isolamento da fração total, detergente-solúvel e resistente ao detergente de proteínas IF de 9 diferentes tecidos de ratos (cérebro, coração, pulmão, fígado, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas, rim e baço). Demonstrámos ainda um protocolo optimizado para o isolamento rápido de proteínas IF utilizando matriz de lise e homogeneização automatizada de diferentes tecidos de ratinho. O protocolo automatizado é útil para perfilar IFs em experimentos com alto volume de amostra (como em modelos de doença envolvendo múltiplos animais e grupos experimentais). As amostras resultantes podem ser utilizadas para várias análises a jusante, incluindo perfis PTM de espectrometria de massa. Utilizando estes métodos, fornecemos novos dados para mostrar que as proteínas IF em diferentes tecidos de rato (cérebro e fígado) sofrem mudanças paralelas com respeito à sua expressãoE PTMs durante o envelhecimento.

Introduction

As IFs são uma família de proteínas que nos seres humanos são codificadas por 73 genes e categorizadas em seis tipos principais: os tipos I a IV são citoplasmáticos ( por exemplo, queratina epitelial e capilar (K), desmina de miócitos, neurofilamentos, proteína ácida fibrilar glial (GFAP) e outros); Tipo V são as laminas nucleares; E tipo VI são IFs na lente ocular 1 . Em termos de sua organização molecular, as proteínas IF têm três domínios comuns: um domínio "var" de bobina enrolada altamente conservado e domínios globulares "cabeça" e "cauda". Os tetrâmeros de proteína IF se unem para formar precursores de filamentos curtos, que são finalmente incorporados em filamentos maduros que formam estruturas citoesqueléticas dinâmicas e nucleoesqueléticas envolvidas na proteção mecânica 2 , sensação de estresse 3 , 4 , regulação da transcrição 5 e crescimento e outras funções celulares críticas"> 1 , 6 , 7 .

A importância funcional do sistema IF é evidenciada pela existência de muitas doenças humanas causadas por mutações missense em genes IF, incluindo neuropatias, miopatias, doenças de fragilidade cutânea, disfunções metabólicas e síndromes de envelhecimento prematuro 8 . Algumas mutações no gene IF não causam, mas predispõem seus portadores à progressão da doença, como as queratinas epiteliais simples na doença hepática 9 . Este último é devido às funções críticas de proteção ao estresse das IF no epitélio. As IFs em geral estão entre as proteínas celulares mais abundantes sob condições basais, mas são ainda fortemente induzidas durante vários tipos de estresse 10 . Por exemplo, estudos recentes que avaliam alterações de todo o proteoma no nematóide C. elegans demonstraram que as IFs múltiplas estão altamente reguladas e propensas a agregaçõesDurante o envelhecimento do organismo 11 , 12 . Uma vez que a manutenção de uma estrutura IF adequada é essencial para a resistência celular a várias formas de stress 10 , a agregação IF também pode contribuir para o declínio funcional durante o envelhecimento. Contudo, estudos de nível organizacional que examinam múltiplas proteínas de mamífero IF em diferentes tecidos submetidos a estresse estão faltando.

IFs são estruturas altamente dinâmicas que se adaptam para atender demandas celulares. As queratinas, por exemplo, sofrem uma ciclagem independente da biossíntese entre o pool protéico solúvel (não filamentoso) e insolúvel (filamentoso) 13 . Em condições fisiológicas normais, pode extrair-se aproximadamente 5% do pool K8 / K18 total em tampão sem detergente, em comparação com aproximadamente 20% que pode ser solubilizado no detergente não iónico Nonidet P-40, que é bioquimicamente comparável a Triton- X100 14 , 15 . Durante a mitose, há um aumento notável na solubilidade do K8 e K1814 do epitélio de tipo simples, que é menos aparente nas queratinas epidérmicas, mas mais aparente na vimentina e em outras proteínas IF do tipo III 15,16 . As propriedades de solubilidade das proteínas IF são fortemente reguladas pela fosforilação, uma modificação pós-translacional chave (PTM) para rearranjo de filamentos e solubilidade 17 , 18 , 19 , 20 . A maioria das IF sofre regulação extensiva por um número de PTMs em locais conservados, resultando em alterações funcionais 17 .

A finalidade deste método é introduzir os investigadores que são novos ao campo do IF à extração bioquímica e aos métodos analíticos para o estudo de proteínas de FI através dos tecidos múltiplos do rato. EspecíficoAliado, focamos no isolamento de proteínas IF usando um método de extração de alto sal e avaliação de mudanças em PTMs por espectrometria de massa e por anticorpos dirigidos contra PTM. Estes métodos baseiam-se nos procedimentos previamente publicados 21, mas incluem modificações para extrair diferentes tipos de proteína IF para descobrir o mecanismo comum de regulação em toda a família IF. Por exemplo, a acetilação de K8 num resíduo de lisina específico regula a organização do filamento, enquanto que a hiperacetilação promove a insolubilidade do K8 e a formação de agregados 22 . Recentes estudos globais de perfil proteómico revelaram adicionalmente que a maioria das proteínas IF específicas de tecido são também alvos para acetilação e que a maioria dos locais de acetilação de IF estão confinados ao domínio de haste altamente conservado. Isso destaca a necessidade de métodos adequados para o perfil global do sistema IF. Nós também introduzimos um método rápido de isolar IF proteínas de múltiplos tecidos usando homogeneização automatizada em optiMatriz de lise. As preparações resultantes são adequadas para análise PTM a jusante por espectrometria de massa e outros métodos.

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Protocol

O protocolo é aprovado e realizado de acordo com o Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade da Carolina do Norte.

1. Preparações

  1. Preparar tampão Triton-X (Triton X-100 a 1%, ácido etilenodiaminotetraacético 5 mM (EDTA), aumentar o volume em solução salina tamponada com fosfato (PBS), pH 7,4). Para preparar 500 mL: agitar 5 mL cada de Triton X-100 e EDTA 500 mM em 490 mL de PBS, pH 7,4. Armazenar a solução tampão Triton-X a 4 ° C.
  2. Preparar tampão de alta sal (Tris-HCl 10 mM, pH 7,6, NaCl 140 mM, KCl 1,5 M, EDTA 5 mM, Triton X-100 a 0,5%, aumentar o volume em H 2 O duplamente destilado). Para fazer 500 mL: agitar 10 mL de Tris-HCl 0,5 M (pH 7,6), 14 mL de NaCl 5 M, 55,9 g de KCl, 5 mL de EDTA 0,5 M e 2,5 mL de Triton X-100, ajustar o volume a 500 ML usando água destilada dupla). Solução alta do amortecedor de sal em 4 ° C.
  3. Justo antes do uso, suplementar uma quantidade apropriada de Triton-X e de Tampão de Alta Sal (
  4. Preparar EDTA 5 mM em 1x PBS, pH 7,4. Para fazer 500 mL: agitar 5 mL de EDTA 0,5 M em 495 mL de 1x PBS, pH 7,4.
  5. Isolar os diferentes órgãos do rato (cérebro, coração, pulmão, fígado, pâncreas, cólon, intestino, rim, baço) utilizando protocolos aprovados que cumpram as diretrizes veterinárias e os padrões institucionais 23 . O procedimento de coleta de tecidos não deve levar mais de 5 min para preservar o RNA ea integridade proteica dos tecidos ricos em proteases ( por exemplo, o pâncreas deve ser processado primeiro).
  6. Cortar uma pequena quantidade de tecido (~ 5-20 mg) e colocar em solução de armazenamento de ARN, para posterior extração de RNA, síntese de cDNA e análise quantitativa em tempo real PCR para a expressão do gene IF. Coloque os tubos de solução de armazenamento de RNA com tecido a 4 ° C durante a noite e siga o protocolo do fabricante para maisEtapas de toragem e isolamento.
  7. Corte o resto do tecido em fragmentos menores ( por exemplo, 0,5 cm) e coloque em criovial. Snap-freeze e armazenar os frascos a -80 ° C ou nitrogênio líquido para armazenamento de longo prazo.

2. IF Análise de Expressão Gênica

  1. Extrair ARN de tecidos preservados no reagente de solução de armazenamento de ARN. Utilizar qualquer método de extracção de ARN adequado / preferido de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Quantificar a concentração de RNA e usar 2 μ g de RNA para gerar cDNA usando um adequado transcrição reversa kit de acordo com o fabricante do protocolo.
  3. Utilizando os cDNA gerados e os iniciadores específicos do gene IF do rato criaram reacções qPCR, incluindo três repetições técnicas de cada amostra bem como controlo em branco de acordo com o protocolo do fabricante.
  4. Quantificar IF expressão gênica como dobra alterar comparando diferentes condições ( por exemplo, jovens versus tecidos antigos).

3. PDe lisados ​​teciduais totais para Immunoblot

  1. Homogeneizar 25 mg de tecido em 1 mL de tampão de amostra SDS não redutor 2x. Omitir o corante azul de bromofenol do tampão de amostra se um ensaio de proteína colorimétrica é para ser realizado para quantificar a concentração de proteína.
  2. Adicionar 5% (v / v) de 2-mercaptoetanol (2-ME) para fazer amostras reduzidas. A 200 μL das amostras não redutoras, adicionar 10 μL de 2-ME.
  3. Determinar a concentração de proteína utilizando um ensaio de proteína compatível com detergente e agente redutor. Se o corante já estiver incluído no tampão de amostra, a quantidade de proteína pode ser estimada após a execução de um gel através de várias técnicas, incluindo a mancha baseada em Coomassie 24 .
  4. Vortexar todas as amostras e aquecer a 95 ° C durante 5 min.
  5. Realizar western blotting tanto em condições de redução como de não-redução. A membrana de exposição brevemente (<1 min) revela espécies monoméricas, e mais tempo (> 1 min) para revelar complexos de massa molecular elevada contendoNg IF proteínas. Se monitorar a agregação, examine todo o gel / membrana (incluindo o fundo dos poços de gel).
  6. Executar um gel paralelo e mancha com uma mancha de proteína como um controle de carga 24 . Em modelos de doença ou em experimentos de lesões, a mancha de proteína total deve ser usada como um controle de carga, ao contrário de imunotransferências para proteínas de "limpeza" ( por exemplo , actina, GAPDH) porque estas mudam sob condições de estresse diferentes.

4. Preparação de extractos solúveis em detergente e sal de FIs específicos de tecido

  1. Adicionar 1 mL de tampão Triton X-100 gelado para um homogeneizador de tubo de vidro e colocá-lo em gelo.
  2. Remova um pequeno pedaço de tecido (~ 25 mg) do armazenamento de azoto líquido e coloque-o directamente no homogeneizador de vidro. Utilize um pilão de politetrafluoroetileno para homogeneizar (50 pancadas) e evite fazer bolhas. Manter o homogeneizador eo lisado frios em todos os momentos.
  3. Transferir o lisado para um micr de 1,5 mLNum tubo de ocentrifuga em gelo e centrifugar a 20 000 xg durante 10 min numa centrífuga pré-arrefecida (4 ° C).
  4. Recolher a fracção sobrenadante num tubo separado. Esta é a fracção solúvel em Triton X, que pode ser utilizada para imunoprecipitação (ip) e análise do conjunto solúvel em detergente de proteínas IF. Note que os passos 4.1-4.4 podem ser repetidos para se obter um extracto IF mais limpo do tecido cerebral.
  5. Adicionar 1 mL de High Salt Buffer ao sedimento de tecido, transferir para um homogeneizador limpo e dounce 100 traços. Transferir o homogeneizado para o tubo de microcentrífuga e colocar o tubo num agitador rotativo na câmara fria durante 1 h.
  6. Centrifugar os homogeneizados a 20 000 xg durante 20 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante.
  7. Adicionar 1 mL de tampão PBS / EDTA arrefecido em gelo ao sedimento e homogeneizar o grânulo (20 movimentos) num homogeneizador limpo como um passo de limpeza final *. Transferir para um novo tubo e centrifugar a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C para obter a proteína IF-Rico em sal (HSE).
    * Opcionalmente, vortex em vez de homogeneização nesta etapa.
  8. Descartar o sobrenadante e dissolver os sedimentos em 300 μL de tampão de amostra SDS não redutor que foi pré-aquecido. Separar o sedimento inicialmente por pipetagem e agitação em vórtex, e depois aquecer as amostras durante 5 min a 95 ° C.
  9. Vortex e pipeta conforme necessário para assegurar que a pastilha seja dissolvida. Pode levar vários minutos para dissolver completamente os grânulos.
  10. Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise.

5. Lise automatizada de tecidos para extração de proteínas IF em experimentos de alto volume

  1. Para a extracção de ARN, colocar um tampão de lise (600 μL de tampão por 25 mg de tecido) num tubo contendo matriz de lisação D (utiliza pequenas esferas cerâmicas) e pulsar duas vezes durante 25 segundos no lisador de tecido. Separar o lisado da matriz por centrifugação a 20 000 xg e prosseguir para a fase seguinte isoladamente.
  2. Para a extração de proteínas, coloque o TritEm X-100 (ou tampão de amostra de SDS, se preparar o lisado total) num tubo de lise com matriz de lise SS (utilizar um único rebordo de aço inoxidável). Após o teste de várias matrizes, este foi selecionado porque produz extratos de proteína IF que estão em qualidade similar ao método tradicional douncing. Observe que o método automatizado não é ótimo para pâncreas e baço, eo protocolo de homogeneização padrão deve ser usado para esses tecidos.
  3. Para prosseguir com a preparação de Extracto de Sal Alta, retire o cordão de aço inoxidável do tubo utilizando um íman e centrifugue os tubos a 20.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
  4. Continue com a etapa 4.4 (acima) do protocolo manual.
  5. Armazenar todas as amostras a -20 ° C até à análise.

6. Imuno-enriquecimento de proteínas IF pós-translacionalmente modificadas

  1. Preparar tampão PBST (Tween-20 a 0,02% em PBS). Para fazer 50 mL, adicione 10 μL de Tween-20 a 50 mL de PBS, pH 7,4.
  2. Preparar PTM anticorpo(1-10 μg de anticorpo em 200 μL de PBST). Em geral, 3 μg de anticorpo / reacção é uma boa condição de partida que pode ser ainda mais optimizada se necessário.
  3. Para cada reação, alíquota de 50 μL de esferas magnéticas em um tubo de microcentrifuga, coloque no ímã e aspirar a solução de armazenamento de talão.
  4. Conjugar as esferas ao anticorpo de imunoprecipitação por re-suspensão na solução de anticorpo e incubar no rotador (fim-sobre-fim, para assegurar a mistura de pequenos volumes) à temperatura ambiente durante 20 min.
  5. Coloque os tubos no imã e aspirar a solução de anticorpos.
  6. Enxaguar as esferas conjugadas com anticorpo uma vez em 200 μL de PBST e remover o tampão de lavagem.
  7. Adicionar 0,6-1 mL do lisado de tecido às esferas, misturar por pipetagem suave e incubar durante 3 h no rotador numa câmara fria.
  8. Coloque os tubos no ímã, remova o lisado e lave as esferas cinco vezes com 200 μL de PBST. Após o último passo de lavagem, recolher as pérolas em 100 _6; L de PBS (sem Tween-20) e transferir para um novo tubo limpo. Coloque o tubo no ímã.
  9. Aspirar o PBS e adicionar 100 μL de tampão de amostra não redutor. Remover 50 μL e adicionar 2-ME (5%) para fazer amostras redutoras. Aquecer as amostras a 95 ° C durante 5 min.
  10. Separar a fração ip das contas no ímã e recolhê-lo em um novo tubo.
  11. Armazenar as amostras a -20 ° C até análise.

7. Preparação de Amostras de Proteínas IF para Análise de Espectrometria de Massa

  1. Programar uma consulta com um especialista em proteômica antes de iniciar um estudo, pois há tempo e custo significativos envolvidos com a análise de espectrometria de massa.
  2. Tome precauções especiais para evitar a contaminação. Manuseie todos os géis com luvas limpas e incube em recipientes limpos, lavados apenas com DDH 2 O (evite sabão).
  3. Executar 20-50 μL da amostra HSE (das Secções 4 e 5) num gel SDS-PAGE de acordo com as condições padrão. Mancha com uma mancha de proteína durante 1 h. Lavar várias vezes e desidratação em ddH 2 O durante a noite. As bandas de proteína IF devem ser facilmente visíveis após a descoloração.
  4. Coloque o gel entre protetores de folha de plástico, digitalizar e marcar as bandas que serão excisadas e enviadas para análise.
  5. Excise as bandas de proteína IF usando uma nova navalha limpa.
  6. Coloque as bandas de gel em tubos de microcentrífuga limpa e transfira para uma instalação de espectrometria de massa.

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Representative Results

Um novo método rápido para a alta extração salina de proteínas IF de múltiplos tecidos de ratos usando matriz de lise.

O método tradicional 25 , 26 de isolar a maior parte da fracção de proteína de filamento intermediário a partir do tecido epitelial foi aqui modificado para incluir 9 órgãos diferentes e um procedimento mais rápido para lise de tecidos. Enquanto que 3 passos de homogeneização manual são necessários para o método tradicional, o procedimento modificado tem apenas 1 passo de homogeneização manual, o que encurta o procedimento por várias horas, especialmente quando se processam mais de 6 amostras. A Figura 1A mostra um resultado típico de HSEs a partir de 9 tecidos de ratinho, enquanto a tabela de proteínas esperadas no tecido e o peso molecular de cada proteína está ilustrada na Figura 1B

Fígado K8 e K18 são fortemente upregulated e sofrem maior fosforilação e lisina acetilação em fígados de ratos velhos.

A Figura 2 mostra resultados típicos de várias das análises descritas neste protocolo. O Painel A descreve a análise de expressão dos dois genes IF principais no fígado, queratina 8 ( KRT8 )E queratina 18 ( KRT18 ), que codificam as prote�as IF K8 e K18, respectivamente. Ceratinas epiteliais são fortemente upregulated sob várias condições de estresse. No resultado apresentado, isto ocorre durante o envelhecimento , uma vez que o KRT8 está significativamente regulado para cima nos fígados de ratinhos de 24 m de idade comparados com ratinhos de 3 m de idade. Os resultados ao nível da proteína são mais marcantes, como observado pelo aumento dramático no monómero K8 assim como complexos de massa molecular elevada nos fígados antigos (24 m). A mancha de proteína baseada em Coomassie serve aqui como um controlo de carga para assegurar a carga igual de proteína entre as amostras. Note-se que, com os lisados ​​totais dos tecidos, é fácil sobrecarregar a proteína num gel, como é neste caso. O carregamento de um volume menor ou a diluição da amostra em tampão de dodecilsulfato de sódio (SDS) irá aliviar este problema (especialmente se aparecer viscoso e difícil de pipeta). O Painel C representa um resultado típico de um extrato de sal de alta de fígado obtido usando o protocolo automatizado, demOnstrating o enriquecimento forte das queratinas 8 e 18 no gel. As linhas vermelhas demarcam a área que foi excisada e submetida à análise de espectrometria de massa. No painel D os resultados da análise de espectrometria de massa das amostras no painel C mostram que K8 e K18 no fígado antigo têm múltiplos locais de fosforilação e acetilação que não estão presentes no fígado jovem.

GFAP é fortemente upregulated e lisina acetilada no cérebro de ratos velhos.

A Figura 3 demonstra que os métodos utilizados para extrair as IF dos epitélios podem também ser utilizados em tecido não epitelial. Além disso, os resultados revelam um padrão geral para o envelhecimento dependente upregulation de IF genes e proteínas. O resultado de qPCR na Figura 2A revela uma indução de 5 vezes do mRNA de GFAP nos cérebros de ratinhos de 24 m de idade em comparação com ratinhos de 3 m de idade. Figura 2BRevela proteínas totais presentes na fracção Triton X-100 e o HSE enriquecido com IF. Observe o aumento da intensidade de banda a 50 kDa marcado pela seta (correspondente a GFAP) no cérebro antigo. A análise por transferência de Western na Figura 2C revela ainda a regulação positiva de GFAP e presença significativa de monómero GFAP e complexo potencial de massa molecular elevada na fracção Triton X-100 (ambos marcados por setas). A análise Western blot das mesmas amostras com um anticorpo pan-acetil lisina mostra que o anticorpo reconhece uma banda a ~ 50 kDa no HSE do cérebro de rato antigo e a ~ 250 kDa na fracção Triton X-100 ( Figura 2D ). O imuno-enriquecimento de proteínas acetiladas das fracções Triton X-100 revela uma maior presença de proteína GFAP no lisado obtido a partir do cérebro antigo. As condições redutoras e não redutoras mostram o monómero GFAP e os complexos de massa molecular elevada. A análise por espectrometria de massa (semelhante à Figura 1

figura 1
Figura 1: Lise automatizada e extrac�o de prote�as IF de tecidos de m�tiplos m�s. ( A ) coloração com gel de Coomassie de HSEs a partir dos tecidos designados de ratinho. Os tecidos apresentados foram obtidos a partir do mesmo ratinho CBA macho adulto (3 m). As amostras foram processadas conforme descrito na Seção 5. Cérebro : note que NFL, NFM e NFH são fortemente fosforilados 27 e migram mais lentamente do que o esperado, a ~ 70, 145 e 200 kDa, respectivamente. Coração : Além da banda de 53 kDa correspondente a desmina e vimentina), as amostras de coração também contêm uma banda de ~ 42 kDa, muito provavelmente representando actina, que é conhecida por co-purificar com desmina 28 . euIntestino: A identidade das bandas proeminentes acima de 25 kDa que são co-extraídas com K8 / K18 não são conhecidas, mas estas bandas não estão presentes se os tecidos forem processados ​​usando o método tradicional homogenizador dounce. Pâncreas e Baço : Note-se que a homogeneização automatizada não é adequada para o isolamento de queratinas do pâncreas e vimentina do baço, presumivelmente devido à sensibilidade do lisado ao ligeiro aumento de temperatura durante o pulso no lisador de tecido. ( B ) Tabela mostrando os principais tipos de proteína IF presentes nos diferentes tecidos e seu peso molecular previsto como referência para o painel A. Clique aqui para ver uma versão ampliada desta figura.

Figura 2
Figura 2: MoleculAr e diferenças bioquímicas em queratinas hepáticas de camundongos jovens e velhos. ( A ) A análise de mRNA de KRT8 e KRT8 utilizando o procedimento padrão (Protocolo 1) revela indução significativa no transcrito de KRT8 nos fígados de ratinhos velhos. N = 6 para cada condição (foram utilizados 3 ratinhos CBA machos e 3 fêmeas por grupo). ** p <0,01; ANOVA unidirecional. ( B ) Os lisados ​​hepáticos totais foram obtidos a partir de 3 ratinhos CBA machos jovens (3 meses de idade) e 3 idosos (24 meses de idade) utilizando o Protocolo 2 e as amostras foram analisadas sob condições não redutoras. Utilizou-se anticorpo TS1 para sondar a expressão de K8 e utilizou-se mancha de proteína baseada em Coomassie como controlo de carga. ( C ) Extractos de sal elevado de fígados de ratinhos jovens e idosos, correspondendo aos ratinhos # 1 e # 4, respectivamente do painel B. As duas setas apontam para K8 e K18 no gel ea caixa vermelha indica a parte do gel que foi Excisadas e submetidas à análise de espectrometria de massa. ( D Por favor, clique aqui para ver a versão ampliada desta figura.

Figura 3
Figura 3: Diferenças moleculares e bioquímicas em GFAP a partir de cérebro de ratinhos jovens e velhos. ( A ) A an�ise de ARNm de GFAP utilizando o procedimento padr� (Protocolo 1) revela indu�o significativa nos c�ebros de ratinhos velhos. N = 6 para cada condição (foram utilizados 3 ratinhos CBA machos e 3 fêmeas por grupo). ** p <0,01; ANOVA unidirecional. ( B ) Coomassie à base de proteína mancha de Triton X-100 e HSE frações de tecido cerebral de jovens (3 meses de idade) e idade (24 meses de idade) do rato. Observe o aumento na banda de ~ 50 kDa GFAP em HSE de cérebro velho (seta). ( C ) GFImunotransferência AP (monoclonal de ratinho, clone GA5) das mesmas amostras que o painel B. ( D ) Imunotransferência de acetil-lisina (policlonal de coelho Abcam ab80178) das mesmas amostras que no painel B. ( E ) GFAP blot após imunoprecipitação com acetil- Lisina. As amostras foram analisadas sob condições não redutoras (NR) e reduzindo (R) e as setas apontam para aumentar a presença de GFAP no imunoprecipitado do cérebro antigo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Métodos que permitem a caracterização bioquímica de proteínas IF podem ser úteis para compreender numerosos fenômenos fisiopatológicos em sistemas de mamíferos, uma vez que as proteínas IF são marcadores e moduladores do estresse celular e tecidual 29 . O princípio subjacente ao método actual baseia-se nos procedimentos iniciais desenvolvidos nas décadas de 1970 e 1980 para isolar, separar e reconstituir as proteínas IF das células e tecidos, empregando geralmente soluções salinas de baixo e alto teor de detergente Triton-X100 25 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34 , 35 . Para uma visão histórica sobre os estudos que apoiaram o isolamento bioquímico de proteínas IF, consulte as revisões recentes 36 , 37 . O método atualÉ baseado em protocolos mais recentes desenvolvidos para o estudo de ceratinas epiteliais simples 26 . A vantagem do método é que ele pode servir como um passo inicial para permitir que os investigadores que são novos para o campo IF para efetivamente isolar IF proteínas da maioria dos tecidos de mamíferos. Representa um guia visual de procedimentos relacionados que são amplamente utilizados por investigadores no campo para estudar a regulação da proteína IF 21 , 38 .

Esta técnica pode ser utilizada para estudar a regulação ea função das IFs nos mecanismos de comunicação de estresse entre os tecidos de mamíferos 39,40. Está se tornando bem conhecido que o estresse em um tecido pode afetar o funcionamento de outros tecidos, por exemplo, em condições de estresse nutricional 41 , desvios de proteínas 42 , estresse metabólico 43 e outrosMudanças. Vale ressaltar que a maior parte do trabalho atualmente realizado nesta área está em modelos de Drosophila e C. elegans , enquanto estudos sobre respostas de estresse generalizadas em sistemas de mamíferos estão faltando. Como o principal regulador do estresse celular 10 , o sistema IF pode desbloquear pistas para respostas de estresse em nível de organismo, o que pode ter implicações importantes para a doença. Como tal, o protocolo atual pode ser usado para estudar mecanismos patofisiológicos globais em vários modelos de ratos de estresse, lesão e doença.

Uma limitação da técnica actual é que os extractos com elevado teor de sais são considerados preparações "em bruto" de IF, uma vez que também contêm outras proteínas associadas ao IF, tais como a plectina, por exemplo 44 . Como mostrado anteriormente, os HSEs podem ser desnaturados em tampão ureia 8 M para obter proteínas IF altamente puras que são capazes de re-montagem in vitro em tampão fosfato 44 . Após dois desses ciclos deDesmontagem e re-montagem, a estequiometria das proteínas IF (isoladas de células HeLa) permaneceu a mesma, enquanto que o tratamento com ureia removeu a plectina 44 . Durante a purificação de desmina, a actina pode ser removida por solubilização do HSE em ácido acético 45 . Se os passos de purificação adicionais devem ser incluídos depende do objetivo final da experiência. Por exemplo, se o objectivo é caracterizar o estado de montagem e gerar FIs reconstituídas in vitro, o passo de ureia é necessário para obter proteínas IF altamente puras. Por outro lado, se o objetivo é identificar associações dependentes do contexto entre as IFs e outras proteínas celulares, então as preparações "brutas" podem ser usadas. As proteínas que interagem podem ser identificadas por espectrometria de massa usando digestão in-gel para alvos de alta abundância visíveis por mancha de gel, ou digestão em solução para alvos de baixa abundância. Estudos anteriores utilizando imunoprecipitação de IFs e HSEs solúveis em detergenteContendo prote�as IF identificou interac�o espec�ica funcionalmente importante entre queratinas 8/18 e prote�a 70 de choque t�mico (Hsp70), que �potenciada ap� esfor� de calor 46 , a prote�a adaptadora 14-3-3 ap� a fosforila�o 47 e a cinase Raf-1 K8 / K18 Em condições fisiológicas normais 48, entre outras. O protocolo atual pode permitir estudos semelhantes em outras proteínas IF.

A utilização da matriz de lise é uma modificação chave dos métodos anteriores e deve permitir a extracção rápida de IFs de múltiplos tecidos, com excepção do pâncreas e do baço. A automatização dos passos iniciais pode ser particularmente útil para experimentos de mouse de alto volume. Por exemplo, o isolamento de proteínas IF de 3 tecidos diferentes de 10 ratinhos por condição ( por exemplo, normal e alguma forma de stress ou doença sistémica) exigirá o processamento de 60 tecidos individuais. Usando o método manual tradicional este woUld precisa ser feito em lotes e pode levar vários dias. No entanto, usando o método automatizado com matriz de lise, o procedimento pode ser feito em apenas algumas horas. Os passos críticos do procedimento incluem: assegurar que a amostra fique fria durante todo o procedimento; Incubação em tampão salino alto durante 1 h (passo 4.5); Utilizando tampão quente e vortex extensivo para assegurar a ressuspensão completa do grânulo antes da análise (passo 4.8); E tomando todas as precauções para evitar a contaminação das amostras a serem analisadas por espectrometria de massa (passo 7.2).

O principal inconveniente para a identificação por espectrometria de massa de sites PTM é que ele funciona muito bem para certos PTMs - fosforilação e acetilação lisina sendo exemplos primordiais -, mas outros, como o sumoylation são muito mais desafiador 49 . No entanto, a proteômica é uma ferramenta poderosa para estudar a regulação de proteínas em tecidos normais e doentes. Agnetti et ai. Compilou um relatórioAtualizada de técnicas proteômicas de vanguarda atualmente em uso para estudar várias PTMs no contexto de proteínas expressas em tecido 50 . O objetivo do presente método é gerar amostras que podem ser aplicadas para diferentes tipos de análises. Por exemplo, a sumoiilação in vitro pode ser realizada em proteínas IF imuno-precipitadas, e a sumoylação global pode ser avaliada em IF isoladas em preparações HSE utilizando anticorpos sumo-específicos 18 , 21 . Por conseguinte, a aplicação deste método não se limita a gerar amostras apenas para análise de espectrometria de massa mas pode ser utilizada para sondar várias propriedades IF utilizando uma variedade de técnicas a jusante.

As proteínas IF são extensivamente reguladas por PTMs numerosos em locais conservados, resultando em solubilidade alterada, montagem de filamentos e interações protéicas 17 . Os recentes avanços tecnológicosA incrível magnitude, complexidade e significado de doença de modificações pós-translacionais (PTMs) em proteínas celulares 51 , 52 , 53 . A melhoria dos métodos de detecção de PTMs comuns, tais como a fosforilação 54 ea acetilação 51 , produziram vastos catálogos de dados, mas a compreensão do seu significado biológico - quebrando o "código PTM" - é um grande desafio restante 55 , 56 . Uma maneira de avaliar os papéis funcionais e a importância relativa de cada PTM é determinar quão bem ela é conservada em vários membros da família de proteínas IF. Por exemplo, a identificação de um novo sítio de fosfo-tirosina em K8 revelou que este local está contido dentro de um motivo QYE encontrado essencialmente em todas as proteínas citoplasmáticas de IF e crítico para regular a solubilidade da proteína IF e o filamento dyNamics 57 . Importante, a mutação do resíduo de tirosina conservado no GFAP para um ácido aspártico "fosfomímico" carregado negativamente (Y242D) provoca Doença de Alexander 58 . Os dados representativos aqui apresentados demonstram como dois tipos diferentes de proteínas IF específicas de tecidos (K8 e GFAP) sofrem um padrão semelhante de sub-regulação e acetilação aumentada durante o envelhecimento, o que pode ser um efeito do metabolismo alterado 22 , 51 . Este exemplo ilustra a utilidade do método para compreender a função das proteínas IF numa escala fisiológica global.

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Disclosures

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgments

Este trabalho foi apoiado pelo NIH concede NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] e P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill]. Os autores agradecem a Deekshita Ramanarayanan pela assistência com qPCR e Western blot experiências.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3 x 32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25x) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2x SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10x) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads - Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads - Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer

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References

  1. Eriksson, J. E., et al. Introducing intermediate filaments: from discovery to disease. J Clin Invest. 119 (7), 1763-1771 (2009).
  2. Lowery, J., Kuczmarski, E. R., Herrmann, H., Goldman, R. D. Intermediate Filaments Play a Pivotal Role in Regulating Cell Architecture and Function. J Biol Chem. 290 (28), 17145-17153 (2015).
  3. Perez-Sala, D., et al. Vimentin filament organization and stress sensing depend on its single cysteine residue and zinc binding. Nat Commun. 6, 7287 (2015).
  4. Dialynas, G., et al. Myopathic lamin mutations cause reductive stress and activate the nrf2/keap-1 pathway. PLoS Genet. 11 (5), e1005231 (2015).
  5. Hobbs, R. P., et al. Keratin-dependent regulation of Aire and gene expression in skin tumor keratinocytes. Nat Genet. , (2015).
  6. Chung, B. M., Rotty, J. D., Coulombe, P. A. Networking galore: intermediate filaments and cell migration. Curr Opin Cell Biol. 25 (5), 600-612 (2013).
  7. Gruenbaum, Y., Aebi, U. Intermediate filaments: a dynamic network that controls cell mechanics. F1000 Prime Rep. 6, (2014).
  8. Omary, M. B. "IF-pathies": a broad spectrum of intermediate filament-associated diseases. J Clin Invest. 119 (7), 1756-1762 (2009).
  9. Omary, M. B., Ku, N. O., Strnad, P., Hanada, S. Toward unraveling the complexity of simple epithelial keratins in human disease. J Clin Invest. 119 (7), 1794-1805 (2009).
  10. Toivola, D. M., Strnad, P., Habtezion, A., Omary, M. B. Intermediate filaments take the heat as stress proteins. Trends Cell Biol. 20 (2), 79-91 (2010).
  11. Walther, D. M., et al. Widespread Proteome Remodeling and Aggregation in Aging. C. elegans. Cell. 161 (4), 919-932 (2015).
  12. David, D. C., et al. Widespread protein aggregation as an inherent part of aging in. C. elegans. PLoS Biol. 8 (8), (2010).
  13. Windoffer, R., Beil, M., Magin, T. M., Leube, R. E. Cytoskeleton in motion: the dynamics of keratin intermediate filaments in epithelia. J Cell Biol. 194 (5), 669-678 (2011).
  14. Chou, C. F., Riopel, C. L., Rott, L. S., Omary, M. B. A significant soluble keratin fraction in 'simple' epithelial cells. Lack of an apparent phosphorylation and glycosylation role in keratin solubility. J Cell Sci. 105 ( Pt. 2, 433-444 (1993).
  15. Omary, M. B., Ku, N. O., Liao, J., Price, D. Keratin modifications and solubility properties in epithelial cells and in vitro). Subcell Biochem. 31, 105-140 (1998).
  16. Lowthert, L. A., Ku, N. O., Liao, J., Coulombe, P. A., Omary, M. B. Empigen BB: a useful detergent for solubilization and biochemical analysis of keratins. Biochem Biophys Res Commun. 206 (1), 370-379 (1995).
  17. Snider, N. T., Omary, M. B. Post-translational modifications of intermediate filament proteins: mechanisms and functions. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 163-177 (2014).
  18. Snider, N. T., Weerasinghe, S. V., Iniguez-Lluhi, J. A., Herrmann, H., Omary, M. B. Keratin hypersumoylation alters filament dynamics and is a marker for human liver disease and keratin mutation. J Biol Chem. 286 (3), 2273-2284 (2011).
  19. Eriksson, J. E., et al. Specific in vivo phosphorylation sites determine the assembly dynamics of vimentin intermediate filaments. J Cell Sci. 117 (Pt. 6, 919-932 (2004).
  20. Sahlgren, C. M., et al. Mitotic reorganization of the intermediate filament protein nestin involves phosphorylation by cdc2 kinase). J Biol Chem. 276 (19), 16456-16463 (2001).
  21. Snider, N. T., Omary, M. B. Assays for Posttranslational Modifications of Intermediate Filament Proteins. Methods Enzymol. 568, 113-138 (2016).
  22. Snider, N. T., et al. Glucose and SIRT2 reciprocally mediate the regulation of keratin 8 by lysine acetylation. J Cell Biol. 200 (3), 241-247 (2013).
  23. Danneman, P., Suckow, M. A., Brayton, C., Suckow, M. A. The laboratory mouse. , 2nd edn, CRC Press. (2013).
  24. Weiss, W., Weiland, F., Gorg, A. Protein detection and quantitation technologies for gel-based proteome analysis. Methods Mol Biol. 564, 59-82 (2009).
  25. Achtstaetter, T., Hatzfeld, M., Quinlan, R. A., Parmelee, D. C., Franke, W. W. Separation of cytokeratin polypeptides by gel electrophoretic and chromatographic techniques and their identification by immunoblotting. Methods Enzymol. 134, 355-371 (1986).
  26. Ku, N. O., et al. Studying simple epithelial keratins in cells and tissues. Methods Cell Biol. 78, 489-517 (2004).
  27. Julien, J. P., Mushynski, W. E. Multiple phosphorylation sites in mammalian neurofilament polypeptides. J Biol Chem. 257 (17), 10467-10470 (1982).
  28. Hubbard, B. D., Lazarides, E. Copurification of actin and desmin from chicken smooth muscle and their copolymerization in vitro to intermediate filaments. J Cell Biol. 80 (1), 166-182 (1979).
  29. Ku, N. O., Strnad, P., Bantel, H., Omary, M. B. Keratins: Biomarkers and modulators of apoptotic and necrotic cell death in the liver. Hepatology. 64 (3), 966-976 (2016).
  30. Huiatt, T. W., Robson, R. M., Arakawa, N., Stromer, M. H. Desmin from avian smooth muscle. Purification and partial characterization. J Biol Chem. 255 (14), 6981-6989 (1980).
  31. Zackroff, R. V., Goldman, R. D. In vitro assembly of intermediate filaments from baby hamster kidney (BHK-21) cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 76 (12), 6226-6230 (1979).
  32. Franke, W. W., Schmid, E., Osborn, M., Weber, K. The intermediate-sized filaments in rat kangaroo PtK2 cells. II. Structure and composition of isolated filaments. Cytobiologie. 17 (2), 392-411 (1978).
  33. Small, J. V., Sobieszek, A. Studies on the function and composition of the 10-NM(100-A) filaments of vertebrate smooth muscle. J Cell Sci. 23, 243-268 (1977).
  34. Dahl, D., Bignami, A. Glial fibrillary acidic protein from normal human brain. Purification and properties. Brain Res. 57 (2), 343-360 (1973).
  35. Steinert, P. M., Idler, W. W., Zimmerman, S. B. Self-assembly of bovine epidermal keratin filaments in vitro. J Mol Biol. 108 (3), 547-567 (1976).
  36. Goldman, R. D., Cleland, M. M., Murthy, S. N., Mahammad, S., Kuczmarski, E. R. Inroads into the structure and function of intermediate filament networks. J Struct Biol. 177 (1), 14-23 (2012).
  37. Oshima, R. G. Intermediate filaments: a historical perspective. Exp Cell Res. 313 (10), 1981-1994 (2007).
  38. Mashukova, A., Forteza, R., Salas, P. J. Functional Analysis of Keratin-Associated Proteins in Intestinal Epithelia: Heat-Shock Protein Chaperoning and Kinase Rescue. Methods Enzymol. 569, 139-154 (2016).
  39. Schinzel, R., Dillin, A. Endocrine aspects of organelle stress-cell non-autonomous signaling of mitochondria and the ER. Curr Opin Cell Biol. 33, 102-110 (2015).
  40. Taylor, R. C., Berendzen, K. M., Dillin, A. Systemic stress signalling: understanding the cell non-autonomous control of proteostasis. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (3), 211-217 (2014).
  41. Lemieux, G. A., et al. Kynurenic acid is a nutritional cue that enables behavioral plasticity. Cell. 160 (1-2), 119-131 (2015).
  42. Oosten-Hawle, P., Porter, R. S., Morimoto, R. I. Regulation of organismal proteostasis by transcellular chaperone signaling. Cell. 153 (6), 1366-1378 (2013).
  43. Ulgherait, M., Rana, A., Rera, M., Graniel, J., Walker, D. W. AMPK modulates tissue and organismal aging in a non-cell-autonomous manner. Cell Rep. 8 (6), 1767-1780 (2014).
  44. Aynardi, M. W., Steinert, P. M., Goldman, R. D. Human epithelial cell intermediate filaments: isolation, purification, and characterization. J Cell Biol. 98 (4), 1407-1421 (1984).
  45. Shea, J. M., et al. Purification of desmin from adult mammalian skeletal muscle. Biochem J. 195 (2), 345-356 (1981).
  46. Liao, J., Lowthert, L. A., Ghori, N., Omary, M. B. The 70-kDa heat shock proteins associate with glandular intermediate filaments in an ATP-dependent manner. J Biol Chem. 270 (2), 915-922 (1995).
  47. Liao, J., Omary, M. B. 14-3-3 proteins associate with phosphorylated simple epithelial keratins during cell cycle progression and act as a solubility cofactor. J Cell Biol. 133 (2), 345-357 (1996).
  48. Ku, N. O., Fu, H., Omary, M. B. Raf-1 activation disrupts its binding to keratins during cell stress. J Cell Biol. 166 (4), 479-485 (2004).
  49. Hendriks, I. A., Vertegaal, A. C. A comprehensive compilation of SUMO proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (9), 581-595 (2016).
  50. Agnetti, G., Lindsey, M. L., Foster, D. B. Manual of cardiovascular proteomics. , Springer. (2016).
  51. Choudhary, C., Weinert, B. T., Nishida, Y., Verdin, E., Mann, M. The growing landscape of lysine acetylation links metabolism and cell signalling. Nat Rev Mol Cell Biol. 15 (8), 536-550 (2014).
  52. Herhaus, L., Dikic, I. Expanding the ubiquitin code through post-translational modification. EMBO Rep. 16 (9), 1071-1083 (2015).
  53. Dephoure, N., Gould, K. L., Gygi, S. P., Kellogg, D. R. Mapping and analysis of phosphorylation sites: a quick guide for cell biologists. Mol Biol Cell. 24 (5), 535-542 (2013).
  54. Choudhary, C., Mann, M. Decoding signalling networks by mass spectrometry-based proteomics. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (6), 427-439 (2010).
  55. Creixell, P., Linding, R. Cells, shared memory and breaking the PTM code. Mol Syst Biol. 8, 598 (2012).
  56. Minguez, P., et al. Deciphering a global network of functionally associated post-translational modifications. Mol Syst Biol. 8, (2012).
  57. Snider, N. T., Park, H., Omary, M. B. A conserved rod domain phosphotyrosine that is targeted by the phosphatase PTP1B promotes keratin 8 protein insolubility and filament organization. J Biol Chem. 288 (43), 31329-31337 (2013).
  58. Gorospe, J. R., et al. Molecular findings in symptomatic and pre-symptomatic Alexander disease patients. Neurology. 58 (10), 1494-1500 (2002).

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Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).

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